Векторные системы для клонирования в клетках эукариот. В качестве векторов для переноса ДНК в эукариотические клетки используют дрожжевые плазмиды (единственные плазмиды, найденные в эукариотических клетках) и различные эукариотические вирусы (чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аденоассоциированные вирусы). В ряде случаев введение векторных конструкций в эукариотические клетки осуществляют путем ко-трансформаций — одновременного введения плазмиды и сегмента чужеродной ДНК. В клетках эукариот векторные конструкции сохраняются в виде эписом (суперскрученных кольцевых молекул) в течение нескольких дней, а иногда экзогенная ДНК интегрируется в хромосомную ДНК и устойчиво сохраняется в геноме клетки-хозяина.

У дрожжей известны три вида плазмид, которые можно использовать в качестве векторов. Это 2m и 3m (длина соответственно 2 и 3 мкм), а также митохондриальная (длина 24 мкм) ДНК.

Первая плазмида найдена во многих штаммах дрожжей. Она представляет собой кольцевую молекулу ДНК (6318 пн), локализуется в ядре клетки и составляет около 3% всей дрожжевой ДНК (50-70 копий на гаплоидный геном). В природе эта плазмида не интегрируется в дрожжевые хромосомы. Лабораторные же варианты клеток, содержащих хромосомы с интегрированными в них 2-микронными ДНК, крайне не стабильны. Это объясняется несовместимостью механизма, регулирующего число копий плазмидной ДНК, с механизмом удвоения хромосом. Молекула 2- микронной ДНК содержит два инвертированных повтора -IR1 и IR2,включающих по 599 пн. В одном повторе находится ее ori-сайт. Его присутствие достаточно для автономной репликации плазмид, но в таком случае число копий невелико. Высокую копийность 2-микронной ДНК обеспечивают два плазмидных гена - REP1 и REP2 и локус REP3.

Между инвертированными повторами 2-микронной плазмиды in vivo происходит внутримолекулярная рекомбинация, зависящая только от плазмидного белка, кодируемого геном FLP. Область рекомбинации длиной приблизительно около 60 пн лежит около XbaI- сайта. Благодаря рекомбинации 2-микронная ДНК может существовать, а двух формах (А и В) в соотношении 1:1. Малый EcoRI-фрагмент В-формы (2242 пн) содержит повтор IR1, ori-сайт, ген FLP и единственные сайты рестрикции (EcoRI, HindIII, BalI, BclI и ClaI), применяемые для клонирования и экспрессии гетерологичных генов. Поэтому его используют в качестве основы при конструировании дрожжевых векторов.

Эукариотические вирусы нашли более скромное применение в качестве векторов.
Практически используется только онкогенный вирус SV-40 и его производные.

13. Методы соединения клонируемых фрагментов и векторных молекул
Способы соединения векторных молекул и клонируемых фрагментов.

Векторные молекулы и клонируемые фрагменты м. б. получены с использованием одной рестриктазы. Тогда они имеют одинаковые «липкие концы» и в присутствии ДНК-лигаз они легко соединяются м/у собой по принципу коплементарности липких концов - лигирование.

Чаще их получают с разными рестриктазами, т. е. концевые фрагменты не комплементарны. Поэтому были разработаны 3 подхода их соединения.

Линкерный мол – короткая последовательность ДНК (6-12 пар оснований синтезированных искусственно), внутри себя содержат сайты узнавания для одной или нескольких рестриктаз. При использовании высоких концентраций фермента ДНК-лигаза, такие линкеры пришиваются с обеих сторон к клонируемому фрагменту. Затем такая ДНК обрабатывается этой рестриктазой, образуется однонитевые фрагменты, которые можно соединять с векторной молекулой, полученной этой же рестриктазой.

Полилинкеры – несколько сайтов узнавания рестриктаз.

Адаптеры – искусственно синтезированный однонитчатый фрагменты ДНК, которые используются для соединения фрагментов с несовместимыми концами, полученными с помощью различных рестриктаз. Для использования адаптеров необходимо знать липкие концы.

Коннекторы – используются для соединения фрагментов. К одному добавляется тимин, к др. – аденин. После объединения, в присутствии ДНК-полимераз, ДНК-лигазы возможно объединение фрагментов за счет комплементарных нуклеотидов.

14.Требования, предъявляемые к питательным субстратам. Питательные среды для ферментационных процессов. Пит среда должна отвечать требованиям: содержать все необходимые для размножения микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме; иметь оптимальные влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по возможности прозрачной. Каждую питательную среду стерилизуют. Должна обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, анаэробы размножаются выше 5, а аэробы — не ниже 10.

    Важно поддерживать определенный состав питательной среды. В непрерывных процессах биосинтеза требуется поддержание концентрации всех питательных веществ (и кислорода) и дозированному введению кислоты или щелочи для рН-статирования системы на заданном уровне. Простейшим вариантом управления стадией ферментации в периодическом режиме является изменение концентраций компонентов среды и её рН, а также введение необходимых добавок по заранее разработанной программе, реализуемой технологом в каждом цикле ферментации. Этот способ относительно прост и легко поддается автоматизации. Во многих случаях необходимо возможно полно исчерпывать компоненты питательной среды, чтобы они не попадали на последующие стадии переработки. Эта необходимость вызвана причин:

- дороговизна или дефицитность субстрата;

- вредное воздействие субстрата на качество готового продукта (например, при производстве дрожжей на парафинах, когда выделение остаточных количеств углеводородов из клеточной массы затруднено, поэтому добавляют дополнительные секции для дозревания или утилизации запасенных в цитоплазме углеводородов);

- затруднения, возникающие на стадии выделения и очистки метаболитов при одновременном присутствии в культуральной жидкости неутилизированных веществ.

    Твердофазную ферментацию обычно реализуют в твердой, сыпучей или пастообразной среде, влажность которой составляет 30–80 %. Поверхностная ферментация на жидких субстратах реализуется в кюветах со средой, помещенных в вентилированные воздухом камеры.