Важным классификационным принципом биореакторов различного типа являются системы перемешивания. По способу перемешивания и аэрации биореакторы подразделяются на аппараты с механическим, пневматическим и циркуляционным перемешиванием. Наиболее распространенные конструкции в современной микробиологической промышленности - аппараты с механическим перемешиванием. Такие реакторы имеют механическую мешалку с центральным валом и лопастями (лопатками), число которых обычно равно 6, реже 8. Лопасти могут быть прямыми или изогнутыми, часто их располагают в несколько ярусов, что обеспечивает более эффективное перемешивание больших объемов жидкости. В систему входят также отражательные перегородки - узкие металлические пластинки, прикрепленные к внутренним стенкам биореактора. Они предотвращают возникновение водоворотов и обеспечивают вихревое движение жидкости, равномерно распределяемое по всему объему реактора. Аэрация может осуществляться также путем барботажа – подачи воздуха снизу через горизонтальную трубку с отверстиями, иногда аэрирование достигается применением специальных вибраторов, которые обеспечивают высокую степень асептики, малый расход энергии и относительно слабо травмируют клетки. В аппаратах с пневматическим перемешиванием мешалка отсутствует, и перемешивание жидкости осуществляется пузырьками газа. Естественно, что скорость массообмена в них намного ниже, чем в ферментерах с механическим перемешиванием. Биореакторы с пневматическим перемешиванием характеризуются более мягким (плавным) перемешиванием содержимого и получили распространение при выращивании клеток животных и растений. Биореакторы циркуляционного типа оснащены насосами и эжекторами, создающими направленный ток жидкости по замкнутому контуру (кругу). Жидкость увлекает за собой пузырьки газа и тем самым культуральная среда одновременно с перемешиванием может насыщаться либо атмосферным кислородом, либо (с использованием специальных устройств и эжекторов) газом иного типа. Эти биореакторы отличаются простотой конструкции и надежностью в эксплуатации. В последнее время разрабатываются новые способы аэрации. Например, воздух может подаваться через специальные полипропиленовые мембраны. Это позволяет избегать пенообразования. Теплообмен в биореакторах осуществляется с помощью труб с охлаждающим или нагревающим агентом, которые оплетают аппарат и образуют так называемую рубашку реактора. Иногда эта система труб располагается непосредственно в полости ферментера. Нагревающими агентами в промышленных биореакторах служат горячая вода или пар, в лабораторных ферментерах чаще используется электрический подогрев. Система пеногашения биореактора – это средство борьбы с избыточным пенообразованием. Существуют химические, механические, акустические и другие виды пеногашения. Наиболее часто применяют химические и механические способы. К химическим средствам пеногашения относятся поверхностно активные вещества, которые, внедряясь в стенки пузырей, становятся центрами их неустойчивости. Эффективными пеногаситслями служат растительные масла и животные жиры. Недостатком этих пеногасителей является то, что при их утилизации микробными клетками сами по себе способствуют пенообразованию. Механические пеногасители представляют собой различные устройства, сбивающие пену: диски, лопасти, барабаны, располагающиеся в верхней части реактора. Более сложными приспособлениями являются сепараторы пены, которые одновременно служат для сбора биомассы, содержащейся в пенном слое. Устройства и режим стерилизации определяется конструкцией биореактора, вспомогательного оборудования, используемых питательных сред и т. п. Наибольшее значение имеют термический метод стерилизации оборудования и сред и фильтрационный способ, применяемый для удаления микроорганизмов из подаваемого в ферментеры воздуха или другого газа.

19. Типы и режимы ферментаций: периодические и непрерывные.

Биотехнологические процессы могут быть двух типов: периодическими и непрерывными.

Периодическое культивирование включает несколько этапов: стерилизацию сред и оборудования, загрузку биореактора питательной средой, внесение посевного материала, выращивание культуры, отделение и очистку готового продукта. После окончания последнего этапа производится мойка биореактора и подготовка его к новому циклу. При этом типе культивирования рост клеточной популяции подразделяется на несколько фаз: 1) После введения инокулята обычно наблюдают индукционный период (лаг-фаза), в течение которого не происходит сколько-нибудь заметного увеличения числа клеток или образования каких-либо продуктов. В этот период перестраивается метаболизм клетки, синтезируются ферменты, специфичные к использованию новых субстратов, активируется биосинтез белка.2)Фаза экспоненциального роста, в течение которой быстро накапливаются биомасса и продукты разных реакций. Эта фаза достаточно строго описывается экспоненциальной кривой. 3) В замкнутой системе экспоненциальная фаза роста не может развиваться неограниченно. Она переходит в фазу линейного роста, характеризующуюся равномерным во времени линейным ростом культуры. 4) Фаза линейного роста может смениться весьма непродолжительным периодом, в течение которого скорость роста культуры снижается до нуля. Это фаза замедления роста. 5)В некоторых случаях рост культуры может переходить в достаточно устойчивую и продолжительную стационарную фазу. В этих условиях культура развивается в режиме постоянства общего числа клеток. Режим характеризуется достаточно высокими скоростями отмирания клеток. При этом скорость прироста биомассы полностью компенсируется скоростью гибели и лизиса клеток. 6) Если система полностью истощается по субстрату или накопление ингибирующих рост продуктов является значительным, то скорость прироста биомассы становится равной нулю, происходят существенные физиологические изменения клеток и, как правило, наблюдается фаза отмирания культуры.

    Биотехнологически ценные продукты синтезируются как в экспоненциальной фазе (нуклеотиды, многие ферменты, витамины – так называемые первичные метаболиты), так и в стационарной фазе роста (антибиотики, пигменты и т. п. - так называемые вторичные метаболиты).

    Довольно широко в биотехнологии используется периодическое культивирование с подпиткой, при котором, помимо первичного внесения питательного субстрата до засева культуры, в процессе культивирования в аппарат через определенные интервалы добавляют питательные вещества либо порциями, либо непрерывно "по каплям". Существует также отъемно-доливочное культивирование, когда часть содержимого биореактора периодически изымается и добавляется равное количество питательной среды. Такой прием обеспечивает регулярное "омолаживание" культуры и задерживает ее переход в фазу отмирания. Этот прием иногда называется полунепрерывным культивированием. Модификацией периодического культивирования является культивирование с диализом, при котором питательный субстрат постоянно поступает в реактор через специальную мембрану. Диализ ведет к снижению концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнеспособность. Помимо этого, диализ удаляет из культуры часть жидкости, что позволяет получать в конце процесса концентрированную биомассу.

    В непрерывных процессах культивирования клетки постоянно поддерживаются в экспоненциальной фазе роста. С этой целью в биореактор подается свежая питательная среда и обеспечивается отток из него культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Основным принципом непрерывных процессов является точное соблюдение равновесия между приростом биомассы вследствие деления клеток и их убылью в результате разбавления содержимого свежей средой.

    Различают хемостатный и турбидостатный режимы непрерывного культивирования. При хемостатном режиме культивирования саморегулируемая система возникает в силу следующих причин: если первоначальное поступление свежей питательной среды и вымывание биомассы превышает скорость деления клеток, то в результате разбавления культуры снижается концентрация веществ, ограничивающих ростовые процессы и скорость роста культуры повышается; увеличивающаяся популяция начинает активнее "выедать" субстрат, что в свою очередь приводит к торможению роста культуры. Конечным итогом этих процессов является (после серии затухающих колебаний) установление равновесия между скоростью роста культуры и ее разбавлением. Турбидостатный режим культивирования базируется на прямом контроле концентрации биомассы. Наиболее распространенным методом ее определения является измерение светорассеивания с помощью фотоэлементов. Повышение концентрации клеток и соответственно оптической плотности автоматически ускоряет проток жидкости и наоборот.

20. Хемостаты и турбидостаты. Принципы конструирования

    Биореактор, работающий в хемостатном режиме культивирования, называют хемостатом. Его конструкция предусматривает наличие: 1) приспособления для подачи питательной среды; 2) устройства, обеспечивающего отток культуральной

жидкости вместе с клетками, и 3) системы, контролирующей концентрацию элементов питательной среды и управляющей скоростью подачи питательной среды. Последнее является наиболее важным и наиболее сложно осуществимым устройством.

    Один из простейших вариантов хемостата содержит насос, постоянно нагнетающий питательную среду в биореактор, и выпускную трубу, по которой жидкость из биореактора вытекает, как только ее уровень поднимается выше горловины этой трубы.

    В тех случаях, когда необходимо достичь максимально возможной скорости роста под влиянием тех или иных факторов, используется турбидостат. Работа турбидостата основывается на поддержании постоянной плотности культуральной суспензии, или постоянной мутности. Фотоэлемент, измеряющий мутность, регулирует через систему реле поступление питательного раствора. В сосуде для культивирования все питательные вещества содержатся в избытке, и скорость роста культуры приближается к максимальной. При помощи турбидостата открывается возможность для разработки проблемы быстрого и сверхбыстрого роста. По своей конструкции турбидостаты отличаются от хемостатов лишь системами контроля скорости протока.С технической точки зрения турбидостат может быть применен лишь для одноклеточных организмов. При длительном культивировании биообъекта в турбидостате возникает серьезная проблема, связанная с прилипанием клеток к фотоэлементу. При засеве смешанной культуры в турбидостате автоматически отбирается наиболее быстрорастущий вид. Это является преимуществом турбидостатного метода, в определенной степени предохраняющим культуру микроорганизма от заражения посторонней микрофлорой. Такой принцип использован для селекции антибиотикоустойчивых организмов

Хемостаты и турбидостаты эффективно действуют при различных скоростях разбавления культуры. Хемостатный режим успешно применяются при малом протоке, когда концентрация клеток меняется незначительно с изменением его скорости, что облегчает саморегулировку системы. Область функционирования турбидостата — высокие скорости разбавления, при этом происходит быстрое и резкое изменение концентрации биомассы в ответ на смену скорости протока. Это обеспечивает своевременное срабатывание фотоэлемента или другого датчика, управляющего скоростью протока жидкости через турбидостат.

Твердофазная ферментация

Большинство ферментационных технологий связано с жидкими аэрируемыми системами, однако в настоящее время достаточно широко используются ферментационные технологии, основанные на утилизации плотных субстратов, при отсутствии воды или малом ее количестве, а также в безкислородных условиях. Существуют процессы, в которых роль жидкой фазы сведена до минимума: она, используется лишь для увлажнения твердой поверхности или воздуха (газа). В зависимости от превалирующей фазы процессы и соответствующие им аппараты подразделяются на твердофазные и газофазные.

Твердофазные процессы осуществляются, как правило, на основе растительного сырья и используют чаще всего мицелиальные грибы или дрожжи. Различают три типа твердофазных процессов:

а) Поверхностные, когда слой субстрата не превышает 3-7 см. В качестве "биореакторов" используются большие (до нескольких квадратных метров) подносы или культуральные камеры.

б) Глубинные процессы, идущие в не перемешиваемом слое. Биореакторы представляют собой глубокие открытые сосуды. Для аэробных твердофазных процессов разработаны приспособления, обеспечивающие диффузионный и конвекционный газообмен.

в) Перемешиваемые процессы, протекающие в перемешиваемой и аэрируемой массе субстрата, который может быть гомогенным (полужидкой консистенции) или состоять из частиц твердого вещества, взвешенных в жидкости (переходный вариант от твердофазного процесса к процессу в жидкой фазе). Для этого обычно используют биореакторы с низкоскоростным перемешиванием.

Интерес к твердофазным процессам обусловлен некоторыми их преимуществами по сравнению с процессами, осуществляющимися в жидкой фазе: они требуют меньших затрат на оснащение и более дешевые в эксплуатации; характер субстрата облегчает отделение и очистку продукта; низкое содержание воды препятствует заражению культуры продуцента посторонней микрофлорой; твердофазные процессы не связаны со сбросом в окружающую среду больших количеств сточных вод.

Однако, и в данных процессах есть некоторые недостатки. Так, вследствие отсутствия хорошего перемешивания, продуцент часто растет в виде колоний и лишь постепенно может распространяться по субстрату. При этом возникает локальная недостача питательных веществ и часть субстрата вообще не используется продуцентом.

22. Особенности получения целевых продуктов при различных условиях ферментации

Завершающие стадии биотехнологических процессов — выделение целевогопродукта - существенно различаются в зависимости от того, накапливается продукт в клетке, или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является клеточная биомасса. Наиболее сложным является выделение внутриклеточного продукта. При этом клетки необходимо отделить от среды культивирования, подвергнуть их разрушению, а затем целевой продукт очистить от остатков разрушенных клеток. Выделение продукта существенно облегчается, если он экскретируется продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому одной из насущных задач биотехнологии является создание промышленных штаммов микроорганизмов, секретирующих возможно большее число ценных продуктов в значительных количествах. Технология выделения и очистки в значительной степени определяется природой целевого продукта. В ряде случаев существует возможность не использовать тщательную очистку продукта, если он обладает требуемыми активностями в неочищенном состоянии и если примесь посторонних веществ не оказывает каких-либо нежелательных влияний при его использовании. Некоторые традиционные биотехнологические процессы вообще исключают этап отделения продукта.

Первым этапом на пути к очистке целевого продукта является разделение культуральной жидкости и биомассы–сепарация. Существуют различные методы сепарации:1) флотация, если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой сма-чиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости;2) фильтрация на пористой фильтрующей перегородке; 3) центрифугирование. Метод основан на осаждении взвешенных в жидкости частиц с применением центробежной силы. Ценрифугирование требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование. Поэтому оно оправдывает себя, если: а) суспензия фильтруется медленно; б) поставлена задача максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся частиц; в) необходимо наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодическое действие. Центрифугирование и фильтрация в некоторых производственных процессах реализуются в комбинации–речь идет о фильтрационных центрифугах. Широко применяют центрифуги, где разделение жидкой и твердой фаз не связано с фильтрацией и основано лишь на центробежной силе.

Следующим этапом получение целевого продукта является разрушение клеток. Разрушение клеток (дезинтеграцию) проводят физическим, химическим и химико-ферментативным методами. Наибольшее индустриальное значение имеет физическое разрушение: ультразвуком; с помощью вращающихся лопастей или вибраторов–метод, обычно используемый в пилотных и промышленных установках; встряхиванием со стеклянными бусами; продавливанием через узкое отверстие под высоким давлением; раздавливанием замороженной клеточной массы; растиранием в ступке; осмотическим шоком; замораживанием–оттаиванием; сжатием клеточной суспензии с последующим резким снижением давления (декомпрессия).

За дезинтеграцией клеток следует этап отделения фрагментов клеточных стенок. Используют те же методы, что и при сепарации клеток: центрифугирование или фильтрацию. Однако применяют более высокоскоростные центрифуги и фильтры с меньшим диаметром пор (часто мембранные), чем при сепарации клеток. В большинстве биотехнологических процессов клеточные стенки отбрасываюткак балласт, но возможно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как целевого продукта. Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции или адсорбции.

Осаждение растворенных веществ осуществляется физическими (нагревание, разведение или концентрирование, охлаждение раствора) или химическими воздействиями, переводящими растворенное вещество в малорастворимое состояние.

Экстракция подразделяется на твердо-жидкофазную (при которой продукт из твердой фазы переходит в жидкую) и жидко-жидкофазную (когда обеспечивается перевод продукта из одной жидкой фазы в другую, также жидкую фазу).

Твердо-жидкофазная экстракция сводится порой к простой обработке твердого образца водой или органическим растворителем с целью извлечения из него растворимых соединений. Достаточно широко применяются различные органические растворители, в частности экстрагирование ацетоном, который эффективно переводит в раствор ряд липидных и белковых компонентов клеток. При жидко-жидкофазной экстракции используются различные органические растворители - алкилфенолы, эфиры, галогениды, гексан, хлороформ и др. Почти полностью избежать инактивации позволяют методы экстрагирования на холоде, т. е. путем использовании методов криоэкстракции. При этом уравниваются различия между твердым субстратом и культуральной жидкостью, поскольку и то и другое находится в замороженном состоянии (в одной фазе). Криоэкстракция проводится с применением растворителей, температура кипения которых низка и при обычной комнатной температуре находится в газообразном состоянии.

Адсорбция является достаточно распространенным методом отделения продукта и рассматривается в качестве частного случая экстракции, при котором экстрагирующим агентом служит твердое тело. Механизм ее сводится к связыванию выделяемого из жидкой или газообразной фазы вещества поверхностью твердого тела. Традиционными адсорбентами являются древесный уголь, пористые глины и т. п.

Более современные методы разделения веществ включают хроматографию, электрофорез, электрофокусировку, которые основаны на принципах экстракции и адсорбции.

23.Принцип масштабирования технологических процессов: лабораторные, пилотные и промышленные установки.

Технология производственного процесса отрабатывается поэтапно: в лабораторных, пилотных (опытно-промышленных) и промышленных установках. Чаще встречаются аппараты с объемами ферменторной камеры: 0,5-100 л (лабораторные), 100-5000 л (лабораторно-промышленные) и 5000-1 000 000 л и более (промышленные). На каждом этапе увеличения масштаба ферментации решаются конкретные задачи отработки (налаживания) производства и его оптимизации.

Лабораторные ферментёры по устройству и форме напоминают промышленные и подразделяются на те же типы. Правда, в лабораторных масштабах наиболее часто применяются аппараты с механическим перемешиванием. По принципу теплообмена и стерилизации они делятся на две категории. К первой относятся лишенные собственных систем теплообмена и стерилизации. Такие аппараты, по сути дела, представляют собой камеры для культивирования, помещаемые в водяные бани и стерилизуемые в автоклавах. Аппараты второй категории снабжены системами теплообмена и стерилизации, принципиально не отличающимися от таковых промышленных установок.

С помощью лабораторных биореакторов решаются следующие задачи:

1) кинетические - определение скорости роста клеток, эффективности утилизации субстратов и образования целевого продукта;

2) некоторые массообменные - расчет коэффициентов массопередачи, скорость поступления в среду О₂ и других газов, скорость освобождения от газообразных продуктов, образующихся при культивировании продуцентов (в первую очередь СО₂);

3) определение коэффициентов реакций, связывающих утилизируемые субстраты и О₂ с получаемыми целевым и побочными продуктами.

Пилотные установки используют для поиска (отсюда и название) наиболее целесообразных технологий и в общих чертах моделирование промышленного процесса. Поэтому на данном этапе стараются применять тот тип аппарата, который предполагается использовать в промышленном масштабе. Иными словами, отрабатываются все аспекты производства, вплоть до штатных вопросов. При масштабных переходах следует постоянно иметь в виду, что при соблюдении одинаковых условий (среда, тип аппарата, температура и рН, скорость перемешивания) уровень и скорость синтеза целевого продукта могут существенно различаться ситуация, очень четко прослеженная еще в 1940-1950 гг. при организации крупномасштабных производств антибиотиков.

При переходе от лабораторных к пилотным, а затем от пилотных к промышленным установкам, приходится наряду с объемом изменять и конструкцию, и режимы работы аппаратов. Центральной проблемой при этом является подбор надежных критериев масштабирования, обеспечивающих разработку высокоэффективных и экономичных технологий промышленного производства целевого продукта.