Метод серийных разведений.

Биологическую активность антибиотика измеряют в международных единицах ЕД (единица действия) – наименьшее количество препарата, которое оказывает антимикробное действие на тест-культуру.

Для получения количественных результатов используют методы серийных разведений. Метод серийного разведения препарата в бульоне основан на определении способности растворенного в питательном бульоне препарата вызывать гибель или ингибировать рост находящихся в нем микробов.

Для постановки опыта необходимы основные растворы антибиотиков в дистиллированной воде, питательный бульон (МПБ) и 18-часовая бульонная культура исследуемого штамма с примерной плотностью в 10 м.т./мл.

Ход исследования: из основных разведений препаратов готовят ряд в объеме 1 мл двукратных серийных разведений (титруют с1-й по 7-ю пробирки, из последней 1.0 мл сливают в дез. раствор для уравнивания количества жидкости) по схеме , захватывающие все уровни чувствительности-устойчивости. Во все разведения ряда доливают по 0,1 мл исследуемой культуры.

Контроли: контроль культуры (К/К) содержит 0,1 мл культуры и 1 мл бульона, а контроль среды ( К\Ср) только 1 мл питательного бульона.

Инкубируют посевы при 37°С до следующего дня.

Число пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Кратные разведения а\б , ЕД	64	32	16	8	4	2	1	К\К	К\Ср
МПБ (мл)	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
А\б 128 ЕД	1.0						1.0 мл в дез.р-р	_	_
Исследуемая культура	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	_
Результат	-	-	-	+	+	+	+	+	-

Результат: Сначала смотрят контроли – К\К – мутная пробирка, есть рост культуры (+) – микроорганизмы способны размножаться, а К/Ср – прозрачная пробирка (-) – рост отсутствует, питательная среда стерильна. Определяют МИК (минимальная концентрация препарата, оказывающая антимикробное действие), которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста (последняя прозрачная пробирка в ряду с 1-й по7-ю). Затем эту дозу антибиотика пересчитывают на вес больного.

Если необходимо установить бактерицидное действие МБК, из нескольких пробирок с задержкой роста делают высев петлей на секторы чашки с МПА. Инкубируют до следующего дня и учитывают рост. За МБК принимают концентрацию препарата в последней пробирке, высев из которой не дал роста.

Метод серийных разведений в плотной питательной среде базируется на способности растворенного в плотной питательной среде препарата ингибировать рост нанесенных на него микробов. По сравнению с методом серийных разведении в жидкой среде более производителен, чувствителен и точен.

Ускоренные методы определения чувствительности.

Ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к химиопрепаратам дают возможность получить ответ спустя 2-6 ч. от начала исследования чистых культур. По принципу и механизму реакций, возникающих в результате действия антибиотиков, можно выделить 5 групп ускоренных методов, которые основаны на:

1) выявлении изменений ферментативной активности бактерий. Сущность методов 1-й группы заключается в следующем: в мясо-пептонный бульон с глюкозой добавляют антибиотик в необходимой концентрации, а затем засевают испытуемый штамм микробов. Устойчивые к данному антибиотику микроорганизмы усваивают глюкозу, что проявляется изменением кислотно-щелочного потенциала (pH) среды. Для определения изменений pH среды предложено использовать индикаторы, которые изменяют свой цвет при снижении pH – феноловый красный, индикатор Андреде и бромтимоловый синий.

2) выявлении изменений окислительно-восстановительного потенциала среды развивающимися микроорганизмами. Методы 2-й группы, получившие наибольшее распространение, основаны на выявлении изменений окислительно-восстановительного потенциала среды (rH2) развивающимися микроорганизмами в присутствии антибиотиков с помощью биологических или химических редокс-индикаторов. Микроорганизмы, которые устойчивы к антибиотику, растут и размножаются в среде и снижают rH2 – потенциал, в результате чего индикатор, добавленный к питательной среде, изменяет свой цвет. Чувствительные микроорганизмы в зоне диффузии антибиотиков не размножаются и не изменяют rH2, вследствие этого цвет среды вокруг дисков не изменяется.

3) цитоморфологической оценке изменений бактериальных клеток и формирования микроколоний. Цитоморфологические ускоренные методы основаны на том принципе, что микроорганизмы, чувствительные к антибиотикам при 3-4-часовом росте на средах с химиопрепаратами, не увеличивают размеров микробной клетки или не образуют микроколоний на специальных препаратах с питательными средами.

4) определении изменений оптической плотности среды растущей популяцией или включения радиоизотопов в микробные клетки. Предложены ускоренные методы, основанные на выявлении динамики оптической плотности культур в присутствии антибиотика с помощью нефелометра или спектрофотометра. Разработка системы автоматизации процесса регистрации подавления микробного роста антимикробными препаратами позволила создать различные приборы-автоматы (АТВ Expression, MIC-2000, MS-2, Autobac и др.), обеспечивающие стандартность исследования и ускоренное получение антибиотикограмм.

5) использовании специальных питательных сред с ростовыми стимуляторами. Пятая группа ускоренных методов основана на использовании специальных питательных сред с ростовыми стимуляторами для достижения быстро регистрируемых изменений в среде. В качестве таких стимуляторов используют экстракт бычьего сердца и глюкозу, кровь и глюкозу, индолилмасляную и индолилуксусную кислоты, гибереллин.

Для лечебной и эпидемиологической практики большой интерес представляют экспресс-методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, которые позволяют устанавливать антибиотикограмму возбудителя непосредственно в нативном материале или в первичном посеве, то есть без выделения чистой культуры, что сокращает время анализа до нескольких часов. Разработано несколько модификаций экспресс-метода, в основном для определения чувствительности к антибиотикам возбудителей опасных инфекционных заболеваний (ОИЗ) в первичном посеве исследуемого материала с помощью иммунологических реакций-метода флюоресцирующих антител, реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментного метода. Основу модификаций эспресс-анализа антибиотикочувствительности составляет регистрация с помощью специфических антител действия препаратов на рост и размножение популяции возбудителя в смешанной культуре, то есть в ассоциации с сопутствующей микрофлорой.