С помощью ДНК-диагностики можно решать следующие задачи, которые часто не удается решить другими методами: подтверждение клинического диагноза или дифференциальная диагностика у пациента; пресимптоматическая диагностика; диагностика у фенотипически здоровых гетерозиготных носителей мутации в гене; пренатальная диагностика по ДНК плодного материала; преимплантационная диагностика по ДНК клеток дробящейся яйцеклетки, оплодотворенной in vitro; геномная дактилоскопия, диагностика инфекций.

С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Главное преимущество прямого метода – это высокая, доходящая до 100% точность диагностики и отсутствие необходимости анализа всей семьи на предмет ее информативности. Последнее обстоятельство особенно важно для проведения пренатальной диагностики тяжелых, зачастую летальных наследственных болезней (муковисцидоза, гемофилии А, миодистрофии Дюшена и др.) Еще одно достоинство прямой диагностики – возможность выявления гетерозиготного носительства патологических мутаций у родителей умершего больного и его родственников, что особенно актуально для аутосомно - рецессивных заболеваний.

Однако на практике указанные методы могут применяться при определенных условиях: 1) известной цитогенетической локализации гена, ответственного за развитие наследственного заболевания, 2) должен быть клонированным ген заболевания и известна его нуклеотидная последовательность. Целью прямой диагностики является идентификация мутантных аллелей (нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, мутации и их типы). Высокая точность метода прямой ДНК-диагностики в большинстве случаев не требует ДНК-анализа всех членов семьи, так как выявление мутации в соответствующем гене позволяет почти со 100-процентной точностью подтвердить диагноз и определить генотип всех членов семьи больного ребенка, включая гетерозиготных носителей. Методы прямой ДНК-диагностики показаны для таких заболеваний, как фенилкетонурия (мутация R408W), муковисцидоз - (наиболее частая мутация delF508), хорея Гентингтона (экспансия тринуклеотидных повторов-CTG-повторы) и др.

Однако к настоящему времени гены многих заболеваний не картированы, неизвестна их экзонно-интронная организация, и многие наследственные болезни отличаются выраженной генетической гетерогенностью, что не позволяет в полной мере использовать прямые методы ДНК-диагностики. Недостатком метода прямой ДНК-диагностики является необходимость знания точной локализации гена. Кроме этого, к недостаткам прямых методов следует отнести их неполную информативность, что связано с наличием широкого спектра патологических мутаций в одном и том же гене, обусловливающих развитие наследственного заболевания. Поэтому информативность метода прямой ДНК-диагностики широко варьирует. Так, при диагностике хореи Гентингтона, ахондроплазии она составляет 100%, при фенилкетонурии, муковосицидозе, адреногенитальном синдроме - от 70 до 80%, а при болезни Вильсона-Коновалова и миопатии Дюшенна/Бекера — 45-60%. В связи с этим используются косвенные методы молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней.

Косвенные методы ДНК-диагностики более универсальны, поскольку не требуют знания структуры гена и спектра мутаций в нём. Необходимо только иметь сведения о его локализации. В этом основное преимущество этих методов. Также они могут быть успешно использованы для заболеваний, при которых мутации в генах слишком разнообразны и не отмечается ярко выраженных мажорных (основных) патологических мутаций. ДНК-диагностика в этом случае строится на семейном анализе различных ДНК-полиморфных вариантах. Кроме того, методы косвенной диагностики информативны практически для всех обратившихся семей, поскольку всегда есть возможность среди полиморфных маркеров, сцепленных с локусом заболевания, найти информативный для данной семьи.

Косвенные методы основаны на анализе сцепления с исследуемым геном определенного полиморфного локуса (маркера), с помощью которого можно производить маркировку как мутантных, так и нормальных аллелей и проанализировать их передачу в поколениях, т.е. среди родственников обследуемого лица. Это особенно важно при решении вопроса о пренатальной диагностике наследственного заболевания. При использовании косвенных методов ДНК-диагностики следует помнить — чем теснее сцепление между маркерным локусом и мутантным геном, тем точнее диагноз. Чтобы свести до минимума ошибку диагностики, необходимо по возможности использовать внутригенные маркеры или использовать два маркерных локуса, фланкирующих мутантный аллель. Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть определена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизирующихся со специфическими ДНК-зондами (ПДРФ-анализ; Restriction Fragment Length Polymorphism, или RFLP-анализ). Метод ПДРФ-анализа включает проведение нескольких этапов исследования: выделение геномной ДНК; рестрикция выделенной ДНК с помощью специфических эндонуклеаз; электрофоретическое разделение фрагментов ДНК; идентификация фрагментов ДНК, содержащая полиморфный сайт рестрикции с помощью блот-гибридизации по Саузерну. При отсутствии рестрикции ДНК по данным радиоавтографии будет выявляться крупный неразрезанный фрагмент, или бэнд. При наличии рестрикции будет выявляться меньший по размерам фрагмент. У лиц, гомозиготных по данному наследственному заболеванию, будет выявляться один бэнд, в то время как у лиц, гетерозиготных по данному наследственному моногенному дефекту, будут определяться оба фрагмента. ПДРФ-анализ значительно упрощается, если имеется возможность специфической амплификации участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции. Проведение в этом случае ПЦР-реакции и рестрикции амплифицированного фрагмента позволяет провести тестирование состояния этого локуса. Таким образом, косвенная ДНК-диагностика проводится в следующих случаях: 1) когда ген не идентифицирован, а лишь картирован на определенной хромосоме, 2) когда методы прямой ДНК-диагностики не дают результата (например, в силу большой протяженности гена или широком спектре мутационных изменений, 3) при сложной экзонно-интронной организации гена. При использовании косвенных методов ДНК-диагностики требуется семейный анализ аллелей полиморфных маркеров. Для косвенной диагностики могут использоваться так называемые гипервариабельные сателлитные повторы. Они являются более информативными методами, чем ПДРФ-анализ, поскольку обладают высоким уровнем гетерозиготности и плотно расположены в каждой из хромосом. В последние годы используются короткие тандемные повторы (STR-повторы, short tandem repeates), которые стабильно наследуются и обладают большим уровнем полиморфизма, а также короткие секвенированные последовательности ДНК с известной генной локализацией, так называемые STS-повторы (sequence tagged sites). Последние обладают выраженной индивидуальной специфичностью, стабильно наследуются по законам Менделя и находят широкое применение для молекулярно-генетической диагностики моногенных болезней. Они могут также использоваться в качестве молекулярных маркеров мутантных хромосом в семьях высокого риска. Косвенные методы ДНК-диагностики могут использоваться в пренатальной диагностике практически для всех моногенных заболеваний. Однако для этого необходимо иметь знания о том, что локус является высокополиморфным и находится вблизи от мутантного гена или внутри него. Поэтому для диагностики требуется обследование как можно большего числа родственников (в первую очередь родители—дети), чтобы проследить путь передачи маркеров потомству. Это повышает информативность выбранного маркера. Более того, косвенные методы молекулярной диагностики пригодны даже для тех болезней, гены которых еще не идентифицированы и мутации не известны. Единственным и непременным условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрикции либо коротких тандемных повторов типа STR, находящихся в непосредственной близости от мутантного гена или, что еще лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих полиморфных сайтов удается маркировать, т.е. сделать информативными мутантные аллели гена и проследить их передачу потомству.

Стратегия ДНК-диагностики на сегодняшний день заключается в том, чтобы результаты косвенной диагностики по возможности подтвердить методами прямой диагностики и наоборот.

Биохимический метод

Биохимический метод используется для диагностики болезней обмена веществ, причиной которых является изменение активности определенных ферментов (генные или точковые мутации). С помощью этого метода открыто более 500 молекулярных болезней. Биохимические методы разнообразны: жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, магнитная резонансная спектрометрия, бомбардировка быстрыми нейронами и др. Объектами биохимических методов служат любые биологические жидкости и клетки: моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, культуры клеток.

Выделяют два уровня биохимической диагностики: первичный (массовый) скрининг и уточняющий (селективный) скрининг. Массовый скрининг позволяет среди большого количества обследуемых выделить предположительно больных, имеющих какое-то наследственное отклонение от нормы (ФКУ, аномалии развития нервной трубки, врожденный гипотиреоз, адреногенитальный синдром, муковисцидоз). Селективный скрининг подразумевает уточнение диагноза у пациентов с подозрением на генные наследственные болезни.

Неонатальный скрининг - этим термином обозначают массовое обследование новорожденных для выявления ряда наследственных заболеваний. В целях своевременного выявления и их полноценной коррекции (терапии) в настоящее время в РФ осуществляется неонатальный скрининг пяти патологических состояний: фенилкетонурия (ФКУ), врожденный гипотиреоз (ГПТ), галактоземия, адреногенитальный синдром и муковисцидоз. Отметим, что ранее в РФ проводился неонатальный скрининг лишь двух заболеваний — ФКУ и врожденного ГПТ. Расширение программы неонатального скрининга с ранней диагностикой галактоземии, адреногенитального синдрома и муковисцидоза начато в 2006 году (в рамках реализации приоритетного национального проекта «Здоровье». В родильных домах России у новорожденных осуществляют забор образца крови (из пятки), которую наносят на специальную тест-полоску (тест-бланк), с последующим централизованным направлением в медико-генетическую консультацию, где проводится соответствующее исследование. При наличии подозрений на одно из перечисленных выше пяти заболеваний родители ребенка получают экстренное извещение с просьбой обратиться в медико-генетическую консультацию для повторного исследования.

Наиболее распространенными скрининг – тестами являются:

1. Проба Фелинга на ФКУ. К 2 мл мочи приливают 6 капель 10% раствора хлористого железа. Наличие сине-зелёной окраски говорит о положительном результате пробы - уровень фенилаланина больше 15 мл.

2. Проба Селиванова на фруктозурию. Несколько кристаллов резорцина растворяют в 3 мл концентрированной соляной кислоты (реактив Селиванова). К 1 объёму реактива прибавляют 2 объёма мочи, смесь подогревают на водяной бане. При наличии фруктозы смесь быстро приобретает интенсивное окрашивание, которое оценивается как положительный результат, однако, при более длительном нагревании положительную реакцию может дать и глюкоза.

3. Проба на галактозу и лактозу. К 1 мл мочи добавляют 0,5 мл концентрированного раствора аммиака и 3 капли 10% раствора едкого натрия, нагревают до кипения. Проба считается положительной при проявлении ярко-желтой окраски.

4. Проба Сулковича на кальций. К 1мл мочи добавляют 0,5 мл реактива (10,5 мл уксусной кислоты, 8,3 г щавелевой кислоты, 8,3 г сернокислого аммония на 500 мл воды). О количестве кальция судят по помутнению мочи через 1-2 минуты.

5. Проба на мукополисахариды. 1-5 капель мочи наносят на фильтрованную бумагу, высушивают. Полоска бумаги опускается в раствор толуидинового синего, с последующим отмыванием 10% раствором уксусной кислоты. Пурпурная окраска означает положительную реакцию.