Іони калію відіграють значну роль в регуляції адренокортикальної функції. Відомо, що К⁺ здатний активувати гормонопоез при підвищенні його вмісту в крові або інкубаційному середовищі. Крім того, він є тлом, що модулює ефекти інших регуляторів, в першу чергу ангіотензину II та кортикотропіну [Chen et al., 1999; Pratt et al., 1989]. Проте регуляція синтезу мінералокортикоїдів іонами калію є дослідженою значно гірше порівняно з іншими агоністами. Вважається, що основною ланкою в опосередкуванні ефектів калію в клітинах клубочкової зони надниркових залоз є Са²⁺/кальмодулін-залежна протеїнкіназа [Condon et al., 2002; Ganguly et al., 1992]. В той же час в регуляції найважливіших метаболічних функцій клітини, зокрема в регуляції стероїдогенезу, значну роль відіграють циклічні нуклеотиди. Ми провели дослідження на умовно нормальних та гіперплазованих тканинах кори надниркових залоз людини, які свідчать про участь в трансдукції регуляторних сигналів іонів К⁺ cAMP, ПКА та ПКС. Для того щоб прослідкувати можливу участь ПКС в опосередкуванні регуляторних сигналів іонів калію в адренокортикоцитах людини, ми вивчали розподіл основної ізоформи ПКС у корі надниркових залоз, ПКС-α, в субклітинних фракціях після інкубації зрізів в середовищі з різним вмістом К⁺. Встановлено, що кількість ферменту за присутності іонів калію в інкубаційному середовищі є більшою в мікросомах. Таке накопичення ПКС-α в мембранній фракції (її транслокація) свідчить про активацію ферменту. В цитозольній фракції адренокортикоцитів вміст α-ізоформи ПКС залишається без змін.

Ми також вивчали зміни активності ПКС у субклітинних фракціях зрізів адренокортикальної тканини людини під впливом змін концентрації іонів калію. Суттєва активація ПКС спостерігалась в мікросомній фракції: при концентрації калію 8,5 мМ активність ПКС визначалась у мікросомах на рівні 11,09 ± 2,33 нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1 білка. Цікаво відмітити, що після інкубації зрізів у середовищі без калію активність ПКС в мікросомах дещо знижується, порівняно з кіназною активністю при фізіологічній (3,5 мМ) концентрації К⁺. Визначення активності ПКС в ізольованих ядрах адренокортикоцитів морських свинок показало значне посилення її активності внаслідок дії К⁺ [Пушкарьов, 2005]. Натомість, інші протеїнкінази в ядрах не активувались, або їх активність навіть мала тенденцію до зменшення.

Активація ПКС в ядрах, можливо, пов’язана з фосфорилюванням деяких транскрипційних чинників, а через них посиленням експресії генів, продукти яких кодують ферменти стероїдогенезу та білки-регулятори стероїдогенезу (StAR). Таким чином, активація ПКС зі збільшенням концентрації К⁺ спостерігається в надниркових залозах людини та морських свинок [Пушкарьов, 2005], які є близькими за спектром кортикостероїдних гормонів, що секретуються адренокортикоцитами. Така активація залежить від обміну фосфоінозитидів та мобілізації кальцію з внутрішньоклітинних кальцієвих депо і значною мірою визначає рівень синтезу альдостерону в клубочковій зоні залози. Щоб оцінити можливу роль cAMP-залежної ПКА в опосередкуванні стероїдогенного ефекту К⁺ в корі надниркових залоз людини, визначали вміст нуклеотиду в залежності від концентрації калію в інкубаційному середовищі.

Аналіз залежності продукції cAMP корою надниркових залоз людини від концентрації іонів калію дозволив продемонструвати, що при збільшенні концентрації іонів калію до 8,5 мМ продукція cAMP зростає в 4 рази і становить 0,62 ± 0,15 пмоль/мг тканини. В умовах відсутності калію вміст cAMP становить 0,14 ± 0,02 пмоль/мг тканини. Зростання кількості cAMP також спостерігалось за умов стимуляції тканини калієм в клітинах кори надниркових залоз морських свинок [Pushkarev, Mikosha, 1991].

Крім того, у присутності інгібітору ПКА фосфорилювання білків при 5,5 мМ К⁺ в надниркових залозах морських свинок вірогідно зменшувалося [Пушкарьов, 2005]. Ці дані свідчать про можливу участь ПКА у посиленні регуляторного сигналу К⁺ в адренокортикоцитах морських свинок, як це спостерігається при дії АКТГ. Пряме визначення активності ПКА в мікросомній фракції за інтенсивністю фосфорилювання специфічного субстрату – кемптиду показало, що калій активує цю кіназу, хоча амплітуда активації виявилась нижчою порівняно з ПКС. Як і у випадку ПКС, при концентрації калію в середовищі, нижчій від фізіологічної (3,5 мМ), активність ПКА в мікросомній фракції знижується, при збільшенні концентрації калію до 8,5 мМ активність ПКА також зростає до рівня 4,16 ± 0,83 нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1 білка. Активність ПКА в цитозольній фракції зростає при збільшенні концентрації калію. У фізіологічних умовах активність ПКА в цитозольній фракції визначалася на рівні 2,11 ± 0,14 нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1 білка, при збільшенні концентрації калію до 8,5 мМ вона сягала 3,04 ± 0,38 нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1 білка.

На відміну від цитозолю та мікросом, активність ПКА в ядрах, при визначенні фосфорилювання білків в безклітинній системі, практично не змінюється [Пушкарьов, 2005]. Останній факт може свідчити про те, що основні субстрати цієї кінази знаходяться в цитоплазмі адренокортикоцитів.

Таким чином, базуючись на одержаних нами даних та даних літератури можна стверджувати, що перенесення регуляторних сигналів іонів калію в адренокортикоцитах є значно складнішим процесом, ніж вважалось до цього часу. Ефект підвищених концентрацій іонів калію в адренокортикоцитах реалізується за участю різних месенджерних систем. У перенесенні активуючого сигналу іонів калію в адренокортикальних клітинах можуть брати участь cAMP-залежна протеїнкіназа [Pushkarev, Mikosha, 1991], кальмодулін-залежна протеїнкіназа [Condon et al., 2002], протеїнкіназа С [Betancourt-Calle et al., 2001; Pushkarev et al., 1994]. В результаті активації протеїнкіназ та фосфатаз відбувається фосфорилювання та дефосфорилювання клітинних білків, що обумовлює фізіологічну відповідь клітини.

Отже, можна вважати, що отримані результати обґрунтовують нову концепцію щодо участі регуляторів адренокортикальної функції у формуванні адаптаційних реакцій, які здійснюються безпосередньо наднирковими залозами. Аналіз механізмів взаємодії на молекулярному рівні агоністів, причетних до регуляції адренокортикальної функції і проліферації клітин кори надниркових залоз, переконливо доводить, що ця взаємодія реалізується шляхом низки трансрегуляторних впливів систем внутрішньоклітинних месенджерів, починаючи з першої ланки їхньої дії – рецепції на плазматичній мембрані.

ВИСНОВКИ

1. Обґрунтовано концепцію мультифакторного контролю регуляції гормонопоезу в корі надниркових залоз, взаємодії між різними системами вторинних месенджерів, які опосередковують внутрішньоклітинне перенесення сигналів агоністів, та їх трансрегуляторні впливи. Універсальність мережі месенджерних систем, які запускаються в адренокортикоцитах різними регуляторами – кортикотропіном, естрогенами, пролактином, іонами калію, дофаміном, N-ацильованими похідними етаноламіну, забезпечують реалізацію специфічної функції клітин кори надниркових залоз – синтез кортикостероїдних гормонів.

2. Збільшення активності cAMP-залежної протеїнкінази А, а також протеїнкінази С та її α-ізоформи в клітинах кори надниркових залоз та субклітинних фракціях під впливом АКТГ, естрадіолу, іонів калію свідчить про залучення до забезпечення їхньої регуляторної дії обох кіназних систем.

3. До подальшого перенесення сигналу АКТГ залучено сигнальний каскад протеїнкіназ, що активуються мітогенами, а також ядерні транскрипційні фактори. Серед них найбільш вагома роль у трансдукції сигналу АКТГ в адренокортикоцитах належить МАР-кіназі JNK та ядерному фактору транскрипції с-jun.

4. Виявлені під впливом АКТГ антиапоптичні зміни в клітинах надниркових залоз, оцінювані за зниженням вмісту каспази-3 і ступеня фрагментації ДНК, значною мірою визначаються активацією протеїнкінази С.

5. Встановлено дозозалежність зниження специфічного зв’язування тропних гормонів (АКТГ та пролактину) мембранами адренокортикоцитів за дії адренокортиколітичного препарату хлодитану.

6. В корі надниркових залоз людини основною ізоформою протеїнкінази С є Са²⁺/фосфоліпід-залежна α-ізоформа. Її експресія в адренокортикальній тканині істотно перевищує експресію інших досліджуваних ізоформ. Транслокація α-ізоформи з цитозольної до мікросомної фракції адренокортикоцитів значно посилюється в пухлинах кори надниркових залоз.

7.  В субклітинних фракціях адренокортикоцитів людини експресуються всі Са²⁺-незалежні ізоформи протеїнкінази С.

8. Збільшення експресії тирозинкінази РТК спостерігається в адренокортикальних карциномах людини. Цей факт може бути теоретичним підґрунтям для використання експресії рецепторних тирозинкіназ як діагностичного маркера злоякісності при адренокортикальній патології.

9.  Естрадіол бере участь в регуляції глюкокортикоїдної функції кори надниркових залоз. Дозозалежна стимуляція секреції 11-гідроксикортикостероїдів в дослідах in vitro на первинній культурі надниркових залоз свідчить про пряму дію гормону на адренокортикоцити. Про залучення до опосередкування дії естрадіолу in vivo центральних ланок гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи свідчить збільшення рівня кортикостероїдів в плазмі крові та нуклеїнових кислот в корі надниркових залоз, гіпофізі та гіпоталамусі.

10.  Естрадіол in vi tro та in vivo посилює продукцію кортикостероїдів в корі надниркових залоз. До реалізації цих ефектів в адренокортикальних клітинах залучені cAMP-залежна протеїнкіназа А та протеїнкіназа С.

11.  Естрадіол викликає збільшення в корі надниркових залоз вмісту МАР-кінази ERK1/2 та ядерного фактора транскрипції с-fos.

12. Адреномодуляторна дія N-ацилетаноламінів in vitro виявляється у стимуляції включення міченого холестерину до синтезованих корою надниркових залоз щурів альдостерону та кортикостерону.

13. Виявлено модулюючий ефект N-ацилетаноламінів in vitro на функцію кори надниркових залоз: підвищення рівня 11-гідроксикортикостероїдів, що синтезуються корою надниркових залоз самок щурів, та зниження вмісту 11-гідроксикортикостероїдів в середовищі інкубації тканини кори надниркових залоз людини та самців щурів. N-ацилетаноламіни здійснюють свій стимулюючий ефект на кору надниркових залоз шляхом активації протеїнкінази С; зменшення стероїдогенезу забезпечується пригніченням утворення cAMP та протеїнкінази А.

14. N-ацилетаноламіни здатні викликати апоптоз або некроз в тканинах пухлин надниркових залоз людини.