ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Поможем в ✍️ написании учебной работы

Имя

Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой

Нажимая кнопку "Продолжить", я принимаю политику конфиденциальности

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено і проаналізовано сучасні дані стосовно механізмів регуляції стероїдогенезу кортикотропіном та ангіотензином II, іншими потенційними модуляторами адренокортикальної функції. Зроблено акцент на фактах, які свідчать про існування нових механізмів контролю гормонопоезу агоністами, таких що доповнюють загальноприйняту схему регуляції або суперечать їй.

Матеріали і методи досліджень. Більшість досліджень проведено на тканинах пухлин надниркових залоз хворих з такою патологією: аденома кори надниркових залоз (гормонально-неактивна (28 зразків), гормонально-активна: кортикостерома (29 зразків), альдостерома (12 зразків), андростерома (3 зразки)), карцинома кори надниркових залоз (11 зразків), хвороба Іценка-Кушинга (24 зразки). Були досліджені також ділянки візуально незміненої тканини кори надниркових залоз (умовно нормальна тканина), всього 71 зразок. В дослідах використовували післяопераційні тканини надниркових залоз хворих, прооперованих у клініці Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України. В роботі також були використані експериментальні тварини (всього 305) – самки та самці (інтактні та орхіектомовані) щурів лінії Вістар масою 200-250 г, самці морських свинок масою 350-550 г, тканина надниркових залоз новонароджених поросят.

Для вивчення стероїдогенезу зрізи кори надниркових залоз щурів інкубували з ³Н-холестерином ("Ізотоп", Російська Федерація). Екстраговані стероїди розділяли методом двомірної тонкошарової хроматографії на силікагелі КСК [Челнакова и др., 1990], визначали радіоактивність продуктів мічення.

Для характеристики метаболізму фосфатидилхоліну до контрольних та дослідних суспензій клітин кори надниркових залоз морських свинок додавали ³Н-холін ("Amersham", Велика Британія). Екстракцію ліпідів проводили за методом [Bligh, Dyer, 1959]. Фосфоліпіди розділяли мікротонкошаровоїю хроматографією в системі розчинників: хлороформ : метанол : 28 % аміак (65 : 35 : 5) (1-й напрямок) та хлороформ : ацетон : метанол : оцтова кислота : вода (30 : 40 : 10 : 10 : 5) (2-й напрямок). Водорозчинні метаболіти фосфатидилхоліну розділяли тонкошаровою хроматографією на силікагелі Н ("Merck", Німеччина) в системі розчинників: метанол : 2,4 % NaCl : вода : 28 % аміак (50 : 12,5 : 37,5 : 5). Перед хроматографією до проб додавали аутентичні немічені свідки ("Sigma", США).

АКТГ та пролактин йодували хлораміновим методом [Чард, 1981]. Як ліганд для вивчення зв’язування АКТГ використовували також (3-[¹²⁵I]йодотирозил²³)АКТГ(1-39) ("Amersham", Велика Британія). Стандартна проба для вивчення рецепції містила мічений гормон (100 000 імп./хв), 50-100 мкг білка мікросом або 10⁵-10⁶ клітин. Для визначення неспецифічного зв’язування до проби додатково вносили по 10 мкг/мл неміченого АКТГ або пролактину, а для визначення загального зв’язування – тільки мічений гормон.

Субклітинні фракції адренокортикоцитів отримували методом диференційного ультрацентрифугування з додатковою очисткою ядерної фракції у градієнті щільності сахарози [Buckley et al., 1988].

Визначення активності протеїнкінази С (ПКС) у субклітинних фракціях клітин кори надниркових залоз людини або щурів проводили з використанням нейрограніну – високоспецифічного лужного пептидного субстрату ПКС, який внаслідок фосфорилювання ПКС змінює заряд та рухається в агарозному гелі до аноду [Uchida et al., 2000], а нефосфорильований нейрогранін, використаний як негативний контроль, мігрує до катоду. Інкубаційне середовище для визначення активності ПКС містило трис-HCl буфер, Mg-ацетат, АТР, а також специфічні активатори ферменту (Са²⁺, фосфатидилсерин), нейрогранін та білки досліджуваних субклітинних фракцій.

Специфічну активність протеїнкінази А (ПКА) визначали за методикою, що базується на зміні напрямку руху в агарозному гелі пептидного субстрату кемптиду внаслідок його фосфорилювання ПКА [Kemp et al., 1977]. Інкубаційне середовище для визначення активності ПКА містило трис-HCl буфер, АТР, активатори ферменту (Mg²⁺, cAMP), кемптид та білки субклітинних фракцій.

Рівень cAMP та cGMP визначали, використовуючи радіоімунологічні набори TRK-432 та -500 відповідно ("Amersham", Велика Британія).

Детекцію ізоформ ПКС, каспази-3, протеїнкіназ, що активуються мітогенами, факторів транскрипції проводили імуноблот-аналізом із використанням моноклональних антитіл [Kurien, Scofield, 2006]. Розділені методом електрофорезу у поліакриламідному гелі за присутності додецилсульфату натрію білки [Laemmli, 1970] переносили на нітроцелюлозну мембрану напівсухим способом. Після інкубації з первинними і вторинними антитілами імунні комплекси візуалізували за допомогою реагенту ECL. Після денситометричного визначення інтенсивності засвічення плівки Hyperfilm ECL результати обробляли у програмі "PhotoCaptMw".

Екстракцію ДНК із зрізів проводили, послідовно інкубуючи адренокортикальну тканину з протеїназою К та рибонуклеазою А [Kostyuchenko et al., 2005]. Депротеїнізацію проводили сумішшю хлороформ : ізоаміловий спирт (24 : 1). ДНК осаджували з водної фази етанолом. Екстракцію РНК проводили, використовуючи реагент TRIzol LS ("Invitrogen", США).

Реакцію зворотної транскрипції проводили в реакційній суміші, що містила: стандартний буфер для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), хлористий магній, суміш дНТФ, а саме АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ, інгібітор РНКази, зворотну транскриптазу, суміш випадкових гексамерів та 1 мкг екстрагованої РНК. Інкубація в термоциклері проводилась за таких умов: 22 ⁰С – 10 хв, 42 ⁰С – 15 хв, 99 ⁰С – 5 хв, 4 ⁰С – 5 хв.

Реакцію ПЛР проводили в суміші, що містила: стандартний буфер для ПЛР, хлористий магній, дНТФ, полімеразу red hot taq, прямий та зворотній праймери до RET тирозинкінази (РТК), комплементарну ДНК, одержану в результаті реакції зворотної транскрипції. Умови інкубації: 95 ^оС – 30 сек, 50 ^оС – 30 сек, 72 ^оС – 1 хв, а потім температуру знижували до 4 ^оС. Кількість циклів становила 30. Продукти ПЛР аналізували в 1,7 % агарозному гелі.

Впродовж всієї роботи використовували кортикотропін А ("Sigma", США),17b-естрадіол, естрадіол бензоат ("Кoch-Ligth", Велика Британія), пролактин великої рогатої худоби (Каунаський завод ендокринних препаратів, Литва). NAE (суміш N-ацилетаноламінів, N-стеароїлетаноламін) було синтезовано в Інституті біології моря (Владивосток, Російська Федерація). о,п’-ДДД було синтезовано в лабораторії оргсинтезу та хімреактивів Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України.

У роботі були використані моноклональні антитіла до ізоформ протеїнкінази С-α, -β₁, -β₂, -γ, -δ, -ε, -η, -θ, -µ -ζ; οротеїнкіназ, що активуються мітогенами – ERK1/2, JNK, p38; факторів транскрипції – с-jun, с-fos; каспази-3 ("Cell Signaling Technology" або "Sigma", США); IgG, кон’юговані з пероксидазою хрону ("Sigma", США), субстрати нейрогранін та кемптид (Ala-Ala-Lys-Ile-Gln-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-His-Met-Ala-Arg-Lys-Lys та Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly відповідно, "Sigma", США) нітроцелюлозна мембрана Hybond C та реагенти для посиленої хемілюмінесценції ("Amersham Life Science", Велика Британія), набори для проведення полімеразної ланцюгової реакції ("Roche", Франція), агароза, трис, протеїназа К, рибонуклеаза А ("Sigma", США), колагеназа ("Fluka", Швейцарія), усі солі, NaOH, HCl ("Merck", Німеччина).

Для характеристики генеральної сукупності вираховували середнє значення М та середню похибку m, які представлено у ілюстративному матеріалі. Різницю між двома вибірками визначали за параметричним t-критерієм Стьюдента, непараметричним U-критерієм Вілкоксона-Манна-Уїтні та дисперсійним аналізом за F-критерієм Фішера.

ВИСНОВКИ

1. Обґрунтовано концепцію мультифакторного контролю регуляції гормонопоезу в корі надниркових залоз, взаємодії між різними системами вторинних месенджерів, які опосередковують внутрішньоклітинне перенесення сигналів агоністів, та їх трансрегуляторні впливи. Універсальність мережі месенджерних систем, які запускаються в адренокортикоцитах різними регуляторами – кортикотропіном, естрогенами, пролактином, іонами калію, дофаміном, N-ацильованими похідними етаноламіну, забезпечують реалізацію специфічної функції клітин кори надниркових залоз – синтез кортикостероїдних гормонів.

2. Збільшення активності cAMP-залежної протеїнкінази А, а також протеїнкінази С та її α-ізоформи в клітинах кори надниркових залоз та субклітинних фракціях під впливом АКТГ, естрадіолу, іонів калію свідчить про залучення до забезпечення їхньої регуляторної дії обох кіназних систем.

3. До подальшого перенесення сигналу АКТГ залучено сигнальний каскад протеїнкіназ, що активуються мітогенами, а також ядерні транскрипційні фактори. Серед них найбільш вагома роль у трансдукції сигналу АКТГ в адренокортикоцитах належить МАР-кіназі JNK та ядерному фактору транскрипції с-jun.

4. Виявлені під впливом АКТГ антиапоптичні зміни в клітинах надниркових залоз, оцінювані за зниженням вмісту каспази-3 і ступеня фрагментації ДНК, значною мірою визначаються активацією протеїнкінази С.

5. Встановлено дозозалежність зниження специфічного зв’язування тропних гормонів (АКТГ та пролактину) мембранами адренокортикоцитів за дії адренокортиколітичного препарату хлодитану.

6. В корі надниркових залоз людини основною ізоформою протеїнкінази С є Са²⁺/фосфоліпід-залежна α-ізоформа. Її експресія в адренокортикальній тканині істотно перевищує експресію інших досліджуваних ізоформ. Транслокація α-ізоформи з цитозольної до мікросомної фракції адренокортикоцитів значно посилюється в пухлинах кори надниркових залоз.

7. В субклітинних фракціях адренокортикоцитів людини експресуються всі Са²⁺-незалежні ізоформи протеїнкінази С.

8. Збільшення експресії тирозинкінази РТК спостерігається в адренокортикальних карциномах людини. Цей факт може бути теоретичним підґрунтям для використання експресії рецепторних тирозинкіназ як діагностичного маркера злоякісності при адренокортикальній патології.

9. Естрадіол бере участь в регуляції глюкокортикоїдної функції кори надниркових залоз. Дозозалежна стимуляція секреції 11-гідроксикортикостероїдів в дослідах in vitro на первинній культурі надниркових залоз свідчить про пряму дію гормону на адренокортикоцити. Про залучення до опосередкування дії естрадіолу in vivo центральних ланок гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи свідчить збільшення рівня кортикостероїдів в плазмі крові та нуклеїнових кислот в корі надниркових залоз, гіпофізі та гіпоталамусі.

10. Естрадіол in vi tro та in vivo посилює продукцію кортикостероїдів в корі надниркових залоз. До реалізації цих ефектів в адренокортикальних клітинах залучені cAMP-залежна протеїнкіназа А та протеїнкіназа С.

11. Естрадіол викликає збільшення в корі надниркових залоз вмісту МАР-кінази ERK1/2 та ядерного фактора транскрипції с-fos.

12. Адреномодуляторна дія N-ацилетаноламінів in vitro виявляється у стимуляції включення міченого холестерину до синтезованих корою надниркових залоз щурів альдостерону та кортикостерону.

13. Виявлено модулюючий ефект N-ацилетаноламінів in vitro на функцію кори надниркових залоз: підвищення рівня 11-гідроксикортикостероїдів, що синтезуються корою надниркових залоз самок щурів, та зниження вмісту 11-гідроксикортикостероїдів в середовищі інкубації тканини кори надниркових залоз людини та самців щурів. N-ацилетаноламіни здійснюють свій стимулюючий ефект на кору надниркових залоз шляхом активації протеїнкінази С; зменшення стероїдогенезу забезпечується пригніченням утворення cAMP та протеїнкінази А.

14. N-ацилетаноламіни здатні викликати апоптоз або некроз в тканинах пухлин надниркових залоз людини.

АНОТАЦІЯ

Ковзун О.І. Молекулярні механізми перенесення сигналів регуляторів функції кори надниркових залоз. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю – 14.01.14 ендокринологія. – Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, Київ, 2008

Робота присвячена вивченню молекулярних механізмів регуляції функції кори надниркових залоз. Досліджено процеси трансдукції сигналів основного регулятора адренокортикальної функції - кортикотропіну та менш досліджених агоністів і модуляторів: естрогенів, іонів калію, N-ацильованих похідних етаноламіну. Вивчено регуляцію адренокортикальних рецепторів АКТГ та пролактину. Охарактеризовано основні пострецепторні месенджерні системи, які беруть участь в опосередкуванні дії регуляторів адренокортикальної функції в клітинах кори надниркових залоз, зокрема cAMP-залежного месенджерного каскаду, протеїнкінази С, каскаду протеїнкіназ, що активуються мітогенами. Суттєвим етапом в перенесенні сигналу АКТГ та естрогенів є активація ядерних транскрипційних чинників. Продемонстрована можливість гальмування апоптичних процесів в корі надниркових залоз кортикотропіном та проапоптична дія N-ацильованих похідних етаноламіну. Визначено роль ферментів родини протеїнкінази С в регуляції біохімічних процесів в клітинах кори надниркових залоз, охарактеризовано роль окремих ізоформ протеїнкінази С та рецепторних тирозинкіназ у виникненні пухлинних новоутворень адренокортикальної тканини.

Дисертація обґрунтовує концепцію щодо мультифакторного контролю регуляції гормонопоезу, взаємодії між різними системами вторинних месенджерів, які опосередковують внутрішньоклітинне перенесення сигналів агоністів, що забезпечують функціональну активність адренокортикальних клітин, та їх трансрегуляторні впливи.

Ключові слова: кора надниркових золоз, месенджерні процеси в адренокортикоцитах, кортикотропін, іони калію, естрогени, похідні етаноламіну, протеїнкінази, транскрипційні чинники.

АННОТАЦИЯ

Ковзун Е.И. Молекулярные механизмы переноса сигналов регуляторов функции коры надпочечников. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности – 14.01.14 эндокринология. – Институт эндокринологии и обмена веществ им. В.П. Комиссаренко АМН Украины, Киев, 2008

Работа посвящена изучению молекулярных механизмов регуляции функции коры надпочечников. Исследованы процессы трансдукции сигналов основного регулятора адренокортикальной функции – кортикотропина и менее исследованных агонистов и модуляторов: эстрогенов, ионов калия, N-ацилированных производных этаноламина. Изучена регуляция адренокортикальных рецепторов АКТГ и пролактина. Охарактеризованы основные пострецепторные мессенджерные системы, принимающие участие в опосредовании действия регуляторов адренокортикальной функции в клетках коры надпочечников, в частности cAMP-зависимого мессенджерного каскада, протеинкиназы С, каскада митоген-активируемых протеинкиназ. Существенным этапом в переносе сигнала АКТГ и эстрогенов является активация ядерных факторов транскрипции. Продемонстрирована возможность торможения апоптических процессов в коре надпочечников кортикотропином и проапоптическое действие N-ацилированных производных этаноламина. Определена роль ферментов семейства протеинкиназы С в регуляции биохимических процессов в клетках коры надпочечников, охарактеризована роль отдельных изоформ протеинкиназы С и рецепторных тирозинкиназ в возникновении опухолевых новообразований адренокортикальной ткани.

Диссертация обосновывает концепцию о мультифакторном контроле регуляции гормонопоэза, взаимодействии между различными системами вторичных мессенджеров, которые опосредуют внутриклеточный перенос сигналов агонистов, обеспечивающих функциональную активность адренокортикальных клеток, а также их трансрегуляторные влияния.

Ключевые слова: кора надпочечников, мессенджерные процессы в адренокортикоцитах, кортикотропин, ионы калия, эстрогены, производные этаноламина, протеинкиназы, транскрипционные факторы.

SUMMARY

Kovzun O.I. Molecular mechanisms of signal transduction of adrenal cortex regulators. – Manuscript.

Thesis for a scientific degree of doctor of biological sciences by speciality 14.01.14 – Endocrinology. – Komisarenko Institute of Endocrinology and Metabolism of Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008

The thesis describes the research of the molecular mechanisms of regulation of adrenocortical function. The signal transduction of main regulator of adrenocortical function – ACTH, and estrogens, potassium ions, N-acylethanolamines – is considered.

Corticotropin and prolactin receptors in the adrenal cortex and their regulation has been characterized. The postreceptoral system of the agonists signal transduction have been studied. It was shown that either cAMP-dependent protein kinase A, or protein kinase C are involved to postreceptoral messenger mechanism, that mediates ACTH action in adrenocortical cells. Important steps in the ACTH signaling are mitogen-activated protein kinase (JNK) and nuclear transcriptional factor (c-jun).

The main messenger system participating in estrogens effects in adrenal cortex were estimated. The influence of estradiol on cAMP and cGMP levels, protein kinases A and C activities, mitogen-activated protein kinase, transcriptional factors levels and corticosteroids secretion was investigated. Estradiol raised the activities of protein kinases A and C in membrane fraction of adrenal cortex tissue. Significant increase of steroidogenesis was observed. It was declared that cAMP dependent signaling system, protein kinase C, mitogen-activated protein kinase (ERK1/2) and nuclear transcriptional factor (c-fos) are involved in activation of steroidogenesis in the adrenal cortex by estradiol.

The possibility of involvement of several messenger systems, such as cAMP-dependent messenger cascade and protein kinase C, in К⁺ signal transduction in human adrenocortical cells as well as hypothesis on crosstalk between messenger mechanisms for main physiological agonists controlling steroid biosynthesis in adrenals are discussed.

The messenger mechanisms mediating N-acylethanolamines (NAE) regulatory signals in adrenal cortex were studied. It was shown, that N-acylethanolamines treatment resulted in a decrease of cAMP level in adrenocortical cells. The rise of protein kinase C activity was obtained in membrane fraction after N-acylethanolamines in vitro treatment (3.3 μg/ml). Activity of cAMP-dependent protein kinase A significantly decreased in cytosol fraction of adrenocorticocytes. It was conclused, that steroidogenenis activation is mediated of protein kinase C activation, inhibition is mediated of cAMP-dependent messenger system.

The role of protein kinase C isoforms and receptor tyrosine kinases in tumorogenesis of adrenal cortex is described. Translocation of PKCα from cytosol to membrane fraction was detected in adenomas and carcinomas of adrenal cortex. In conclusion it may be argued that some isoforms of PKC might be involved in oncogenesis in human adrenal gland.

The effect of corticotropin and inhibitor of protein kinase C, chelerythrine chloride on the change of caspase-3 level and on the rate of DNA laddering in hyperplasia adrenal cortex tissue of patient with Cushing’s syndrome was studied. It was established that ACTH caused significant antiapoptotic effect in human adrenal cortex. The obtained data suggest an antiapoptotic effect of ACTH in adrenal cortex estimated according to the caspase-3 level and on the rate of DNA fragmentation depends on activation of protein kinase C. The reactivity of human adrenal tumors depends on influence of N-acyletanolamines mixture in different types of tumors. It was shown that DNA fragmentation, as a final event of apoptosis, is significantly increased in tumor aldosteroma tissue in comparison with adjacent normal tissue.

Some interactions and transregulation influences between different second messenger systems, which mediate intracellular signal transduction of agonists and provide functional activity of adrenocortical cells are discussed.

Key words: adrenal cortex, messenger mechanisms of adrenocortical cells, corticotropin, potassium ions, estrogens, N-acylethanolamines, protein kinases, transcriptional factors.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. При розгляді дистантних хімічних сигналів, що сприймаються клітиною, віднесення гормонів до особливої категорії поступово втрачає сенс. По-перше, встановлено, що деякі класичні гормони, можливо значна їх частина, продукуються в багатьох тканинах організму, а не тільки в спеціалізованих залозах. По-друге, з’ясувалося, що низка біорегуляторів не мають різниці за механізмами дії на клітину порівняно з гормонами і навіть володіють еволюційною спорідненістю з ними. Мова йде в першу чергу про ростові чинники, цитокіни і нейропептиди, що також здійснюють свою дію через специфічні клітинні рецептори. Базисна парадигма клітинної ендокринології у зв’язку з цим істотно розширилася. Так, зараз вважається, що класична ендокринна регуляція клітинних функцій є лише одним з її різновидів. Існують також, як мінімум, паракринний і аутокринний типи регуляції. Перегляд зазначених теоретичних постулатів, з одного боку, привів базисні уявлення в більшу відповідність з реальністю, з іншого боку, розділи, присвячені молекулярній біології клітини, ендокринології, імунології, нейробіології і експериментальній онкології, зараз важко відокремити. Ще більшу спільність процесів, що вивчаються цими розділами науки, виявлено завдяки бурхливому прогресу в з’ясуванні внутрішньоклітинних механізмів дії біорегуляторів. Спільність ця базується на тому, що процес перенесення інформації від рецепторів на внутрішньоклітинні ланки не залежить від того, чи йде мова про рецептор гормону або іншого біорегулятора. Всі вони використовують спільні сигнальні каскади шляхом активації одного або декількох з безлічі неймовірно складних внутрішньоклітинних механізмів обробки і перенесення регуляторної інформації.

Протягом багатьох років вважалося, що регуляція функції надниркових залоз здійснюється за допомогою двох факторів: АКТГ, який головним чином контролює глюкокортикоїдну функцію, та ангіотензину II, який є основним регулятором мінералокортикоїдної функції. Але функція надниркових залоз може регулюватися не тільки через вплив на швидкість стероїдогенезу, але й шляхом зміни маси функціонуючої залози. У зв’язку з цим регуляція мітогенезу та апоптозу також може робити свій внесок до загальної функціональної відповіді надниркових залоз. Цей аспект привернув увагу дослідників лише в останні роки. Тривалий час внутрішньоклітинний механізм дії основних стероїдогенних регуляторів здавався досить чітким: ефекти АКТГ опосередковуються через cAMP-залежний каскад протеїнкінази А, а ангіотензину ІІ – через фосфоінозитидний цикл із залученням протеїнкінази С, а також шляхом регуляції транспорту Са²⁺[Gallo-Payet et al., 2003; Vinson et al., 1992]. Проте дослідження останніх років показали, що cAMP-залежна система перенесення сигналу АКТГ взаємно регулюється сигнальним каскадом, залежним від протеїнкінази С. В той же час зміни активності протеїнкінази С при різних патологіях надниркових залоз, участь окремих ізоформ протеїнкінази С у перенесенні сигналу АКТГ, їх розподіл у різних клітинних компартментах залишаються нез’ясованими.

До факторів регуляції адренокортикальної функції відносяться також естрогени. Естрогени здатні безпосередньо впливати на кору надниркових залоз, а також змінювати чутливість гіпофіза до КРФ та інших нейропептидів гіпоталамуса. Про прямий вплив естрогенів на кору надниркових залоз свідчить наявність рецепторів естрогенів у клітинах кори надниркових залоз щурів, а також стимуляція секреції кортизолу адренокортикоцитами людини за умов відсутності АКТГ [Caticha et al., 1993]. До останнього часу аналіз механізмів впливу естрогенів на клітини різних типів здебільшого був сконцентрований на геномних ефектах. Між тим, участь систем вторинних месенджерів у цих процесах не аналізувалась. Зараз розглядається можливість участі як cAMP-залежної системи перенесення сигналу естрогенними гормонами, так і МАР-кіназної в різних типах клітин, зокрема тих, що не відносяться до репродуктивної сфери [Aronica et al., 1994; Vivacqua et al., 2006; Ronda et al., 2007]. Водночас месенджерні механізми, що опосередковують дію естрогенів у надниркових залозах, залишаються невідомими.

Як ймовірні модулятори адренокортикальної функції зараз привертають увагу N-ацильовані похідні етаноламіну (NАЕ) [Гула та ін., 2000; Pagotto et al., 2006]. Дослідження розподілу мічених [¹⁴C]-NAE в організмі експериментальних тварин продемонструвало переважне включення мітки до надниркових залоз. Оскільки в мозку виявлено незначну кількість міченого N-пальмітоїлетаноламіну, малоймовірно, щоб ця сполука впливала на стимуляцію утворення АКТГ. Внутрішньоклітинні механізми впливу NАЕ на кору надниркових залоз потребують подальшого дослідження. З’ясування основних етапів перенесення сигналу похідних етаноламінів є важливим для визначення їх місця та значення в системі регуляції функції кори надниркових залоз.

В регуляції адренокортикальної функції значну роль відіграють іони калію. Відомо, що К⁺ здатний активувати гормонопоез при підвищенні його вмісту в крові або інкубаційному середовищі. Крім того, він є необхідним компонентом модулювання ефектів інших регуляторів, в першу чергу ангіотензину II та кортикотропіну. Основною ланкою в опосередкуванні ефектів калію в клітинах клубочкової зони кори надниркових залоз вважається каскад, пов’язаний з Са²⁺/кальмодулін-залежною протеїнкіназою [Ganguly et al., 1992; Condon et al., 2002]. Проте істотна кількість накопичених фактів не відповідає класичній схемі регуляції кортикостероїдогенезу, що свідчить про необхідність поглибленого дослідження регуляції стероїдогенних процесів в адренокортикоцитах, зокрема іонами калію.

Таким чином, перелік модуляторів адренокортикальної функції постійно зростає і регуляція функції кори надниркових залоз в організмі на сьогодні виглядає значно складнішою, ніж це уявлялося раніше. Поліморфність протеїнкіназних каскадів, їх взаємодія, включення внутрішньоядерних механізмів забезпечують адекватну регуляцію функції адренокортикоцитів. У зв’язку з цим стає зрозумілим, що з’ясування місця кожного з регуляторів адренокортикальної функції у комплексному механізмі регуляції функції надниркових залоз та простеження поетапної передачі сигналу первинних месенджерів за участю клітинних протеїнкіназ є важливим питанням молекулярної ендокринології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась в рамках наукової тематики лабораторії гормональної регуляції обміну речовин відділу патофізіології Інституту ендокринології ім. В.П. Комісаренка АМН України (№ держреєстрації UА 01003067 Р, тема “Розробка підходів до підвищення ефективності лікування хвороби Іценка-Кушинга, пухлин надниркових залоз людини, а також раку молочної залози та простати” 1992-1994 рр.; № держреєстрації 0198U001283, тема “Роль метаболізму фосфоліпідів в перенесенні сигналів агоністів та модуляторів в клітинах кори надниркових залоз” 1998-2000 рр.; № держреєстрації 0101U000618, тема “Аналіз біохімічних механізмів перенесення регуляторних сигналів у клітинах кори надниркових залоз тварин та пухлин надниркових залоз людини” 2001-2004 рр.; № держреєстрації 0105U000732, тема “Пострецепторна регуляція функції надниркових залоз різними модуляторами в умовах норми та патології” 2005-2007 рр.).

Мета дослідження. З’ясувати основні етапи внутрішньоклітинного перенесення сигналів регуляторів та модуляторів адренокортикальної функції – АКТГ, естрадіолу, іонів калію, N-ацильованих похідних етаноламіну для визначення їх впливу на систему функціональної відповіді кори надниркових залоз.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Вивчити внутрішньоклітинні механізми передачі сигналу АКТГ у адренокортикоцитах:

- шлях, пов’язаний з активацією cAMP-залежної протеїнкінази А в тканинах кори надниркових залоз людини;

- процеси активації протеїнкінази С в різних клітинних компартментах адренокортикоцитів та розподіл різних ізоформ протеїнкінази С за субклітинними фракціями у клітинах пухлин надниркових залоз людини;

- рівень експресії рецепторних тирозинкіназ у пухлинах надниркових залоз людини;

- можливість реалізації ефектів кортикотропіну через МАР-кіназний сигнальний каскад;

- значення ядерних факторів транскрипції jun та fos в реалізації ефектів АКТГ;

- участь АКТГ в реалізації апоптичної відповіді в адренокортикальній тканині.

2. З’ясувати можливість перенесення сигналу естрадіолу негеномним шляхом:

- участь циклічних нуклеотидів, протеїнкіназ А та С, МАР-кіназ та ядерних факторів транскрипції в перенесенні сигналу естрадіолу в клітинах кори надниркових залоз;

- зміни рівня нуклеїнових кислот в основних ланках гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи – гіпоталамусі, гіпофізі та корі надниркових залоз.

3. Дослідити участь в регуляції стероїдогенезу N-ацильованих похідних етаноламіну (NAE) як активаторів внутрішньоклітинних систем перенесення сигналу у корі надниркових залоз:

- вплив NAE на включення міченого холестерину до de novo синтезованих адренокортикоцитами кортикостероїдів;

- вплив різних NAE на процеси стероїдогенезу в корі надниркових залоз за присутності дофаміну;

- роль циклічних нуклеотидів у внутрішньоклітинному перенесенні сигналу NAE;

- зміни активності протеїнкіназ А та С у корі надниркових залоз під впливом NAE;

- участь NAE у регуляції апоптозу в адренокортикальній тканині.

4. Охарактеризувати сигнальні механізми, які можуть відігравати суттєву роль в опосередкуванні ефектів іонів калію:

- участь циклічних нуклеотидів в перенесенні сигналу K⁺;

- зміни активності протеїнкіназ A та С у корі надниркових залоз під впливом іонів калію.

Об’єкт дослідження. Внутрішньоклітинні сигнальні системи, залучені до перенесення сигналів регуляторів та модуляторів функції кори надниркових залоз. Регуляція синтезу кортикостероїдів в корі надниркових залоз модуляторами адренокортикальної функції: кортикотропіном, естрогенами, дофаміном, N-ацильованими похідними етаноламінів, іонами калію.

Предмет дослідження. Системи пострецепторного перенесення сигналів в адренокортикоциті: cAMP-залежної протеїнкінази А, протеїнкінази С, протеїнкіназ, що активуються мітогенами, тирозинкіназ, ядерні транскрипційні фактори.

Методи дослідження. Для досягнення мети та виконання завдань, поставлених у роботі, було використано такі методи: тонкошарову хроматографію, визначення активності ферментів із використанням специфічних субстратів, електрофорез білків у поліакриламідному гелі, імуноблот-аналіз, екстракцію нуклеїнових кислот, полімеразну ланцюгову реакцію, електpофорез ДНК та білків в агарозному гелі, радіоізотопні методи, статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертації досліджені молекулярні механізми залучення месенджерних каскадів різних протеїнкіназ, їх ізоформ у мультифакторному контролі функції кори надниркових за участю кортикотропіну, естрадіолу, іонів калію та N-ацильованих похідних етаноламіну.

Показано, що регуляторна дія АКТГ в корі надниркових залоз людини забезпечується, крім cAMP-залежної протеїнкінази А, месенджерним каскадом протеїнкінази С. Важливою ефекторною ланкою перенесення сигналу кортикотропіну є ядерна протеїнкіназа С, вміст α-ізоформи якої значно збільшується внаслідок дії АКТГ in vitro. Встановлено суттєву роль у трансдукції сигналу АКТГ в адренокортикоцитах сигнального каскаду протеїнкіназ, що активуються мітогенами, а саме кінази JNK, та ядерного фактора транскрипції с-jun, що активується цією кіназою. Під впливом АКТГ виявлені антиапоптичні зміни в клітинах надниркових залоз, на що вказує зниження вмісту каспази-3 і ступеня фрагментації ДНК, значною мірою обумовлені активацією протеїнкінази С.

Доведено можливість прямої дії естрадіолу на функцію кори надниркових залоз. Встановлено факт участі cAMP-залежної протеїнкінази А, протеїнкінази С, протеїнкіназ, що активуються мітогенами (ERK1/2), та ядерного фактора транскрипції с-fos у внутрішньоклітинному перенесенні регуляторного сигналу естрадіолу в адренокортикоцитах.

Встановлено стероїдогенний ефект N-ацильованих етаноламінів у корі надниркових залоз, що дозволяє віднести їх до нового класу адреномодуляторів.

Підтверджена участь протеїнкінази С у К⁺-залежній стимуляції стероїдогенезу в адренокортикоцитах.

Встановлено, що процес транслокації основної ізоформи протеїнкінази С, α-ізоформи, з цитозольної до мікросомної фракції адренокортикоцитів значно посилюється в пухлинах кори надниркових залоз. Вперше встановлено особливості експресії всіх відомих Са²⁺-незалежних ізоформ протеїнкінази С в субклітинних фракціях адренокортикоцитів людини, а також експресію рецепторної тирозинкінази RET в карциномах кори надниркових залоз людини.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведеної роботи доводять участь низки первинних месенджерів в регуляції стероїдогенезу, процесів росту та трансформації в клітинах кори надниркових залоз. Отримані дані можуть бути використані в розробці нових підходів до корекції трофічних та функціональних процесів в надниркових залозах за умов патології. Встановлене посилення апоптозу в адренокортикальній тканині під впливом інгібітору протеїнкінази С – хелеритрину, відкриває нові можливості пошуку і розробки засобів для лікування новоутворень надниркових залоз, скеровані на конкретні сигнальні мішені. Встановлене посилення транслокації α-ізоформи протеїнкінази С до мікросомної фракції адренокортикальних клітин пухлин та надекспресія рецепторних тирозинкіназ в карциномах кори надниркових залоз може використовуватись для розробки додаткових методів діагностики та прогнозування перебігу патологічних станів кори надниркових залоз людини.

Особистий внесок здобувача. Всі результати отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі. Робота виконана автором відповідно до програми наукових досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1991-2007 рр. в лабораторії гормональної регуляції обміну речовин Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України. Дисертантом особисто обґрунтовано концепцію роботи, здійснено пошук та аналіз літературних джерел, розроблено методичні підходи. Текст дисертаційної роботи написано здобувачем особисто. Головні завдання роботи, а також основні наукові положення дисертації і висновки сформульовано разом з науковим консультантом – членом-кореспондентом НАН та АМН України, д.мед.н., проф. М.Д. Троньком. Співучасть співробітників відділу патофізіології у виконанні роботи відображено у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Головні положення дисертаційної роботи було представлено на І науково-практичній конференції молодих вчених-ендокринологів в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (Київ, 2001), VI, VIІ З’їздах ендокринологів України (Київ, 2001; 2007), VIІ, VIІІ, IX Українських біохімічних з’їздах (Київ, 1997; Чернівці, 2002; Харків, 2006), V, VI конференціях імені Я. Парнаса (Київ, 2005; Краків, Польща, 2007), ІV Національному конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004), міжнародній науково-практичній конференції “Сучасний стан і проблеми експериментальної і клінічної медицини” (Тернопіль, 2004), V Всеросійському конгресі ендокринологів (Москва, Російська Федерація, 2006), 2-му з’їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007), засіданні Наукової ради з теоретичної та профілактичної медицини при Президії АМН України (Київ, 27 вересня 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 36 робіт, з яких 1 колективна монографія, 21 стаття у фахових наукових журналах, 14 тез доповідей у матеріалах наукових з’їздів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 299 сторінках друкованого тексту. Робота складається із вступу, аналітичного огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 4 розділів результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, який налічує 534 посилання. Текст дисертації проілюстровано 51 рисунком та 13 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Дата: 2019-05-28, просмотров: 216.

12 3 4 5 6 Следующая ⇒