Продукція cAMP та cGMP, активність ПКА та ПКС в корі надниркових залоз людини під впливом естрадіолу. Дослідження молекулярних механізмів дії естрогенів призвело до появи нових теорій, більш чітко окреслило етапи реалізації ефектів стероїдних гормонів. До останнього часу вплив естрогенів на клітини-мішені пов’язували виключно з геномними ефектами, що не потребують залучення вторинних посередників для внутрішньоклітинного перенесення регуляторних сигналів. Зараз розглядається участь в цих процесах декількох месенджерних систем, серед яких важливе місце відводять cAMP-залежному каскаду.

При визначенні вмісту сумарних 11-ОКС у середовищі інкубації ми показали дозозалежне збільшення продукції стероїдів зрізами кори надниркових залоз людини під впливом естрадіолу. Максимальний рівень синтезу кортикостероїдних гормонів спостерігається через 4 год інкубації при концентрації естрадіолу 100 мкМ і становить 6212 ± 841 нмоль/л у порівнянні з 2363 ± 271 нмоль/л у контрольних пробах (р < 0,01; n=10; критерій Фішера). Наші дослідження показали, що культивування адренокортикальних клітин новонарождених поросят в середовищі з 17b-естрадіолом також призводить до суттєвого збільшення продукції 11-ОКС.

Утворення cAMP тканиною кори надниркових залоз людини вірогідно збільшується через 3 год інкубації.

Ці зміни стають ще істотнішими через 4 год інкубації, коли спостерігається 7-разове збільшення продукції cAMP. Рівень cGMP не змінювався ні за умов використання різних концентрацій естрадіолу, ні за умов різних термінів інкубації.

Дослідження впливу естрадіолу на активність ПКА та ПКС в субклітинних фракціях кори надниркових залоз людини дозволило продемонструвати, що інкубація з естрадіолом-17β протягом 4 год у концентрації 10 мкМ не призводить до активації ПКА ні в мембранній, ні в цитозольній фракціях (табл. 3). При збільшенні концентрації до 100 мкМ протеїнкіназна активність у мікросомній фракції зростає більш ніж на 50 % порівняно з контролем. Визначення активності ПКС в мікросомній фракції показало, що естрадіол активує цю кіназу. Активність ПКС збільшується на 50 % у мікросомній фракції зрізів кори надниркових залоз за умов дії естрадіолу (100 мкМ) (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив 17b-естрадіолу in vitro на активність ПКА і ПКС (нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1білка) у субклітинних фракціях зрізів умовно нормальної тканини кори надниркових залоз людини

Примітка. * – різниця з контролем є вірогідною, р < 0,05; критерій Стьюдента; n = 5.

Продемонстровані шляхи пострецепторної передачі регуляторних сигналів естрадіолу за умовах in vitro на первинній культурі клітин надниркових залоз поросят і зрізах кори надниркових залоз людини залишають відкритим питання щодо тотожності цих шляхів на рівні цілісного організму. Відомо, що природні та синтетичні естрогени активно використовуються для лікування раку простати у чоловіків [Tammela, 2004], тому дослідження ефектів естрадіолу на інтактних та кастрованих експериментальних тваринах можуть дозволити певну екстраполяцію на зміни функції надниркових залоз у людини.

Після 3 днів введення естрадіолу спостерігалось істотне зростання рівня сумарних 11-ОКС у плазмі крові як інтактних, так і орхіектомованих щурів (табл. 4). Показано, що введення 50 мкг естрадіолу інтактним тваринам призводить до збільшення рівня кортикостероїдів у 1,5 рази порівняно з інтактними тваринами, що отримували ін’єкції олії. При введенні 100 мкг естрадіолу цей показник зростає більш ніж у 2 рази. Подібний ефект естрадіолу спостерігався і у кастрованих тварин. У контрольних орхіектомованих щурів рівень 11-ОКС був нижчим, ніж у інтактних (яким вводили сливову олію). Збільшення концентрації кортикостероїдних гормонів під впливом естрадіолу було подібним в обох експериментальних групах. Виходячи з цих даних можна стверджувати, що рівень тестостерону в організмі не має помітного впливу на зміни функції адренокортикальних клітин під впливом естрадіолу. Ні орхіектомія, ні замісне введення тестостерону щурам не призводили до змін концентрації вільного холестерину або його ефірів, які є попередниками синтезу кортикостероїдів [Duda et al., 1985].

Таблиця 4

Вплив естрадіолу бензоату (Е2) in vivo на вміст сумарних 11-гідроксикортикостероїдів у плазмі крові самців щурів (нмоль/л)

Примітки:

*, ** – різниця з контролем є вірогідною, відповідно р < 0,05 і р < 0,01;

+ – різниця між інтактними і орхіектомованими тваринами є вірогідною, р < 0,05; критерій Стьюдента.

Оскільки найважливішими етапами переносу сигналу основного регулятора функції кори надниркових залоз – АКТГ є активація аденілатциклази та cAMP-залежної протеїнкінази А, ми досліджували вплив естрадіолу in vivo на активність ПКA у субклітинних фракціях кори надниркових залоз. Відомо, що ПКА відіграє суттєву роль у найважливіших етапах стероїдогенезу: відщепленні бокового ланцюга холестерину цитохромом Р450_scc, активації білка StAR, транспорті вільного холестерину до внутрішнього шару мембрани мітохондрій [Gallo-Payet et al., 2003; Richards, 2001]. Визначення активності ПКА в субклітинних фракціях показало, що триденне введення естрадіолу призводить до істотного зростання активності ПКА як у цитозольній, так і у мікросомній фракціях кори надниркових залоз інтактних та орхіектомованих щурів (табл. 5). Вірогідність змін була вищою у мікросомній фракції. Ми визначали також активність ПКС, яка може брати участь в опосередкуванні регуляторних сигналів естрогенів (табл. 5). Активність ПКС вірогідно збільшується як в цитозольній фракції адренокортикоцитів, так і, ще в більшому ступені, в мікросомній фракції надниркових залоз інтактних і орхіектомованих щурів, що отримували естрадіол.

Таблиця 5

Вплив естрадіолу бензоату (Е2) in vivo на активність протеїнкіназ А та С у субклітинних фракціях кори надниркових залоз самців щурів (нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1 білка)

Примітки:

*, ** – різниця з контролем є вірогідною, відповідно р < 0,05 і р < 0,01; критерій Фішера; + – різниця між інтактними і орхіектомованими тваринами є вірогідною, р < 0,05; критерій Стьюдента.

Естрадіол підвищує активність ПКС в мікросомній фракції кори надниркових залоз у 1,7 рази в групі інтактних тварин та у 2,0 рази в групі орхіектомованих тварин. Зміни рівня кортикостероїдів і активності ПКА та ПКС під впливом естрадіолу бензоату є подібними у інтактних та кастрованих самців щурів, що дозволяє зробити висновок: видалення сім’яників не впливає на відповідь надниркових залоз на естрогени. Таким чином, отримані дані дозволяють вважати, що збільшення синтезу кортикостероїдів та активація ПКА і ПКС у субклітинних фракціях адренокортикоцитів інтактних та орхіектомованих щурів внаслідок дії естрадіолу свідчить про причетність естрогенів до регуляції функції кори надниркових залоз і про залучення протеїнкіназ до перенесення регуляторного сигналу естрадіолу в адренокортикальних клітинах.

Отже, естрадіол in vitro та in vivo посилює продукцію кортикостероїдних гормонів в корі надниркових залоз і збільшує рівень cAMP, який, в свою чергу, є активатором cAMP-залежної ПКА. У субклітинних фракціях клітин збільшується активність ПКА і ПКС, що свідчить про участь цих ферментів в реалізації ефектів естрогенів в корі надниркових залоз. Узагальнюючи наші результати і дані інших дослідників [Aronica et al., 1994; Seval et al., 2006] можна висловити припущення, що регуляція стероїдогенезу естрогенами в корі надниркових залоз зумовлена здебільшого cAMP-залежною системою. Ймовірною є також участь систем, до яких залучена ПКС. Отримані дані дозволяють розширити розуміння сукупності негеномних механізмів, за якими естрогени здатні чинити контроль метаболічних процесів в адренокортикальній тканині.

Участь сигнального каскаду, пов’язаного з протеїнкіназами, що активуються мітогенами, в опосередкуванні сигналу естрадіолу. В опосередкуванні впливу естрогенів на клітини-мішені зараз розглядається участь декількох сигнальних систем, серед яких важливе місце відводять крім протеїнкіназ А і С, месенджерним системам, що використовують як вторинні посередники протеїнкінази, що активуються мітогенами. Каскад MAPK/ERK є одним з провідних шляхів сигнальної трансдукції естрогенів, що залучається до реалізації широкого спектру ефектів, спрямованих на проліферацію клітин-мішеней. Показано, що активована естрогенами форма ERK1/2 здатна до транслокації в ядро і прямої взаємодії з ядерними транскрипційними факторами [Edwards, 2005; Lee, McEwen, 2001].

В корі надниркових залоз щурів естрадіол бензоат чинить найбільш виразний вплив на рівень ERK1/2 кінази (рис. 7). За результатом Вестерн-блот аналізу, введення 50 мкг естрадіолу не призводить до змін вмісту ERK1/2 в адренокортикальній тканині порівняно із контрольними тваринами, що отримували ін’єкції олії. Після тридобового введення естрадіолу в дозі 100 мкг цей показник вірогідно зростає в 1,7 рази (рис. 7). Збільшення вмісту JNK кінази спостерігається в адренокортикальній тканині при введенні 100 мкг естрадіолу бензоату. Рівень р38 МАР-кінази при введенні естрадіолу в обох дозах залишається без змін.

В інших типах клітин, зокрема раку молочної залози MCF-7, фосфорилювання р38 кінази і, особливо, ERK1/2 збільшується під впливом 17β-естрадіолу в клітинах [Gutzman et al., 2005].

Потрібно зазначити, що стимульована естрогенами транскрипція полягає в активації експресії низки генів, серед яких протоонкогени c-jun та c-fos [Albanito et al., 2007]. Продукти активації цих генів, білки с-jun і c-fos, утворюючи гомодимерні та гетеродимерні комплекси, входять до складу фактора транскрипції АР-1, який є надзвичайно важливим елементом трансдукції сигналу в ядрі. Ми визначали в адренокортикоцитах щурів рівень білкових факторів транскрипції с-jun та c-fos, які можуть брати участь в опосередкуванні регуляторних сигналів естрогенів в корі надниркових залоз (рис. 7). Максимальний рівень с-fos спостерігається при введенні 100 мкг естрадіолу. В цих умовах рівень білка с-jun в корі надниркових залоз практично не змінюється.

Встановлено, що c-jun та c-fos не єдині ранні протоонкогени|, експресія яких стимулюється естрогенами. 17β-εстрадіол також істотно|суттєво| збільшує рівень експресії мРНК|посилює| протоонкогена| c-myc в ембріональних стовбурових клітинах [Han et al., 2006].

Таким чином, можна зробити висновок, що до перенесення регуляторного сигналу естрадіолу в клітинах кори надниркових залоз можуть бути залучені МАРК ERK1/2 та фактор транскрипції c-fos, який активується цією кіназою.

		А

Рис. 7. Вплив естрадіолу бензоату (Е2) in vivo на вміст ERK1/2 та c-fos у корі надниркових залоз щурів.

Репрезентативні результати імуноблот-аналізу одного з 3-х дослідів (А) та усереднені дані (Б). 1 – контроль, 2 – Е2 50 мкг/тварину, 3 – Е2 100 мкг/тварину. Різниця з контролем є вірогідною, * – p < 0,05; непараметричний U-критерій Вілкоксона-Манна-Уїтні, критерій Стьюдента.