Зміна біосинтезу кортикостероїдів під впливом NAE та дофаміну. N-ацилетаноламіни завдяки ліпотропним властивостям добре поглинаються збагаченими на ліпіди тканинами, зокрема адренокортикальною. Розподіл введеного щурам міченого N-пальмітоїлетаноламіну свідчить про переважне його включення саме до надниркових залоз [Жуков та ін., 2000]. Оскільки стероїдогенез є основною функцією цієї залози, NAE можуть відігравати важливу роль в синтезі кортикостероїдних гормонів. Відповідь кори надниркових залоз на введення NAE в організм може бути пов’язана із зміною функції гіпофізу і вищих регуляторних центрів. Тому дослідження кортикостероїдогенезу було проведено на зрізах надниркових залоз в середовищі, що містило NAE, а також дофамін. Дофамін, який є інгібітором секреції альдостерону, є одним з найменш досліджених модуляторів адренокортикальної функції. Як нейромедіатор, дофамін відіграє важливу роль в регуляції секреції пролактину, який, в свою чергу, виконує регуляторну функцію в клітинах кори надниркових залоз.

В дослідах використовували N-стеароїлетаноламін або суміш N-ацилетаноламінів, в якій більше 60 % складають залишки ненасичених жирних кислот: 6,3 % арахідонової, 1,8 % лінолевої, 7,6 % гондової, 18,4 % олеїнової, 6,4 % пальмітоолеїнової, 16,7 % ейкозапентаенової, 2,7 % докозагексаенової; близько 30 % – ацили насичених жирних кислот: 6,4 % міристинової, 22,4 % пальмітинової, 3,0 % стеаринової, 1,0 % арахінової, 1,4 % бегенової.

Додавання до середовища інкубації N-стеароїлетаноламіну у концентраціях 10^-7 - 10^{-6 М не викликало суттєвих змін щодо включення мітки в альдостерон та кортикостерон. Однак у присутності N-стеароїлетаноламіну в концентрації 10-5 М мічення гормонів підвищувалось.}

Вплив дофаміну на включення мітки холестерину в альдостерон і кортикостерон залежав від його концентрації (рис. 8). В концентрації 10^-7 – 10^{-6 М дофамін не впливав на включення холестеринової мітки в кортикостерон. Мічення альдостерону мало тенденцію до зростання при концентрації дофаміну 10-6 М. Вірогідним пригнічення мічення кортикостерону і альдостерону ставало при концентрації дофаміну 10-5 М. Потрібно зазначити, що це гальмування відбувається лише при досить високій концентрації дофаміну.}

Аналіз особливостей сумісної дії дофаміну та NAE проведено з використанням таких концентрацій сполук, котрі самі по собі не змінювали включення мітки в альдостерон і кортикостерон – 10^{-6 М (рис. 9). Дофамін у використаній концентрації дещо збільшував включення мітки в альдостерон, але не в кортикостерон.}

Встановлено, що кожен з препаратів NAE потенціював включення ³Н-холестерину в кортикостероїди за дії дофаміну. При цьому радіоактивність альдостерону та кортикостерону зростала в порівнянні з контролем на 60-80 %. Для альдостерону суттєве підвищення включення ³Н-холестерину досягалось тільки при додаванні суміші ненасичених NAE.

За контроль (100 %) слугували проби, що не містили NAE і дофаміну. Порівняння з контролем: * – р < 0,05, критерій Стьюдента, + – р < 0,05, непараметричний U-критерій Вілкоксона-Манна-Уїтні; n=3.

Не існує чітких односпрямованих результатів, які б характеризували вплив NAE на процеси стероїдогенезу в корі надниркових залоз людини і експериментальних тварин. Проте не викликає сумнівів той факт, що NAE мають адреномодуляторні властивості. Ми показали, що N-ацильовані етаноламіни in vitro суттєво збільшували секрецію 11-ОКС в адренокортикальній тканині самок щурів, проте утворення 11-ОКС зрізами надниркових залоз людини та самців щурів в присутності NAE пригнічувалось (дані не наведені). Питання залежності відповіді на NAE від статі тварин обговорювати вкрай важко, тому що характер впливу статевих гомонів на синтез кортикостероїдів в корі надниркових залоз не досліджено ґрунтовно. Статеві відмінності щільності місць зв’язування каннабіноїдів та зміни їх рецепції під впливом статевих гормонів було знайдено в деяких структурах мозку, але фізіологічна роль цих відмінностей залишається нез’ясованою [De Fonseca et al., 2005].

Слід відзначити, що вплив суміші NAE, яка містила похідні етаноламіну з насиченими і з ненасиченими залишками жирних кислот, на мічення альдостерону був виразнішим, ніж у випадку використання N-стеароїлетаноламіну (рис. 9). Очевидно, властивості залишків жирної кислоти, що входять у склад NAE, мають значення у визначенні реакції адренокортикоцитів. Це, в свою чергу, може свідчити про те, що дія NAE не обмежується впливом на мембрани, а й може впливати на месенджерні механізми або на стероїдогенез безпосередньо. Зростання включення мітки ³H-холестерину до кортикостероїдів під впливом NAE може пояснюватись збільшенням проникнення вільного міченого холестерину до зрізів.

Одним із можливих механізмів впливу NAE може бути зміна транспорту електронів від NADPH на цитохром Р450, який забезпечує реакції гідроксилювання стероїдів. У дослідах in vitro виявлено зниження синтезу 11-ОКС зрізами надниркових залоз самців щурів при додаванні NAE [Гула та ін., 2000]. Перенесення електронів на штучні акцептори, цитохром С та дихлорфеноліндофенол в цих же умовах не змінюється. Це дозволяє вважати, що процес перенесення електронів від NADPH на цитохром Р450 під впливом NAE не змінюється, а гальмування стероїдогенезу у присутності NAE може обумовлюватись зниженням активності аденілатциклази. Пригнічення аденілатциклазної активності і зниження рівня cAMP є найбільш вивченим механізмом переносу сигналів від канабіноїдних рецепторів СВ1 [Felder et al., 1995; Maccarrone et al., 2001]. Встановлено, що активація канабіноїдних рецепторів, сполучених з G_(i/0)-cубодиницею GTP-зв’язуючого білка, призводить до інгібування аденілатциклази і пригнічення ефектів, залежних від cAMP-залежної протеїнкінази А.

Роль циклічних нуклеотидів, протеїнкіназ А і С в реалізації ефектів N-ацилетаноламінів в адренокортикоцитах. Дослідження впливу етаноламінів, N-ацильованих сумішшю жирних кислот, на продукцію cAMP корою надниркових залоз людини дозволило показати, що помітне зниження вмісту cAMP в адренокортикальній тканині спостерігається вже при концентрації NAE 0,3 мкг/мл, при збільшенні концентрації NAE вміст cAMP продовжує зменшуватись і становить 0,083 ± 0,005 пмоль/мг тканини при концентрації NAE 33 мкг/мл. В контрольних пробах вміст cAMP становить 0,200 ± 0,012 пмоль/мг тканини. Рівень cGMP за цих умов залишається незмінним.

Для з’ясування можливості модуляції стероїдогенезу за рахунок змін активності ПКА і ПКС ми провели пряме визначення впливу NAE на активність ферментів в субклітинних фракціях. Суміш N-ацильованих похідних етаноламіну змінює активність ПКA у субклітинних фракціях кори надниркових залоз людини, як це видно з табл. 6.

Таблиця 6

Вплив NAE на активність ПКА і ПКС (нмоль субстрату х хв^-1 х мг^-1 білка) у субклітинних фракціях зрізів умовно нормальної тканини кори надниркових залоз людини

Примітка. * – вірогідно по відношенню до контролю, p < 0,05; критерій Стьдента; n=4.

У цитозольній фракції клітин спостерігається вірогідне зниження активності ферменту, починаючи з концентрації NAE 3,3 мкг/мл. При збільшенні концентрації NAE до 33 мкг/мл протеїнкіназна активність знижується на 34 % у порівнянні з контрольними пробами. У досліджених концентраціях NAE in vitro не впливає на активність ПКА у мембранній фракції адренокортикоцитів.

Внесення суміші NAE до середовища інкубації в жодній з досліджуваних концентрацій не впливає на активність ПКС в цитозольній фракції клітин кори надниркових залоз (табл. 6). У мембранній фракції зростання протеїнкіназної активності спостерігається тільки при одній концентрації NAE - 3,3 мкг/мл.

Виходячи з отриманих даних, виявлені прямі стимулювальні ефекти N-ацилетаноламінів на стероїдогенез в корі надниркових залоз можуть пояснюватись залученням ПКС до перенесення регуляторних сигналів NAE в адренокортикоцитах. Привертає увагу той факт, що для суміші NAE концентрація 3,3 мкг/мл виявилася найбільш біологічно активною в дослідах in vitro як в корі надниркових залоз людини, так і самок щурів. Можливо, ПКС не є єдиною протеїнкіназою, що активується NAE в адренокортикоцитах. Для деяких типів клітин існують дані щодо активації анандамідом, 2-арахідоноїлгіцеролом та D9-тетрагідроканабінолом протеїнкіназ, що активуються мітогенами, а також кінази фокальних контактів [Lepicier et al., 2003].

Вплив NAE на апоптичні процеси в умовно нормальній та пухлинній тканинах надниркових залоз людини. Вважається, що при пошкодженні багатьох тканин і, в першу чергу, нервової тканини та серцевого м’язу утворюються NAE, які виконують захисну функцію щодо пошкодженої тканини. Стабілізаційні ефекти NAE щодо травмованих тканин можуть бути пов’язані з їх протекторним впливом на клітинні мембрани. Нашу увагу NAE привернули такими ефектами, як здатність викликати і посилювати апоптоз та пригнічувати проліферацію у різних типах тканин [Гула та ін., 2006; Maccarrone et al., 2002], в тому числі і в пухлинній тканині надниркових залоз людини [Kostyuchenko et al., 2005]. Проте, незважаючи на проведені дослідження, антипроліферативний та проапоптичний ефекти NAE в різноманітних пухлинах кори надниркових залоз вивчені ще дуже недостатньо.

Тому метою наступного етапу досліджень було визначення залежності ступеня фрагментації ДНК в деяких пухлинних тканинах надниркових залоз людини від вмісту NAE (N-стеароїлетаноламіну та суміші ненасичених NAE) в інкубаційному середовищі (табл. 7). In vitro суміш NAE, що містила похідні етаноламіну здебільшого з ненасиченими залишками жирних кислот, не змінює фрагментацію ДНК в умовно нормальній тканині у випадках альдостером та андростером. Водночас в умовно нормальній тканині у випадку феохромоцитом сумарний об’єм фрагментів ДНК зростає майже в два рази (табл. 7).

Очевидно, реакція тканини надниркових залоз у значній мірі визначається її генетичними особливостями і, відповідно, біохімічними змінами, що відбуваються в тканині внаслідок патологічного перетворення. Слід відзначити, що ступені фрагментації ДНК у пухлинних і умовно нормальних ділянках у межах однієї залози тканин кори надниркових залоз, одержаних від хворих альдостеромою, феохромоцитомою, андростеромою в значній мірі різняться між собою (табл. 7). Різна інтенсивність апоптичних явищ у клітині може пояснюватися перебудовою генетично детермінованих процесів у патологічно змінених клітинах у порівнянні з нормальною тканиною [Bernini et al., 2002].

Таблиця 7

Порівняльна характеристика інтенсивності апоптичних процесів (%) у пухлинних і умовно нормальних ділянках в межах однієї залози під впливом суміші NAE

Примітка. За 100 % прийнята фрагментація ДНК за умов інкубації без NAE, ** – вірогідна різниця з контролем без NAE, р < 0,01, критерій Стьюдента; n = 4.

Найбільш чутливими до дії NAE пухлинами виявилися альдостероми, фрагментація ДНК в них збільшується більш ніж на 30 % порівняно з умовно нормальною тканиною. У випадку андростером фрагментація ДНК залишається без змін, у випадку феохромоцитом чутливою до дії NAE є умовно нормальна тканина надниркових залоз. Відомо, що при феохромоцитомі істотно посилюється кортикостероїдогенез в прилеглій адренокортикальній тканин [Wolf et al., 2005]. Цей факт може бути поясненням встановленого нами збільшення фрагментації ДНК під впливом NAE майже на 100 % саме у випадку феохромоцитоми (табл. 7).

Той факт, що N-ацильовані похідні етаноламіну здатні вибірково вражати пухлинну тканину альдостером, помітно не впливаючи і не завдаючи шкоди нормальній, може бути підґрунтям для розробки нових підходів оптимізації хіміотерапії пухлин надниркових залоз.