5.1. Методы изучения конформационного состояния биомолекул и надмолекулярных комплексов

 Для исследования структуры биополимеров в кристаллическом состоянии используют метод рентгено-структурного анализа (РСА). РСА дает прямую информацию о расположении атомов в молекулах и кристаллах. В его основе лежит взаимодействие рентгеновского излучения с электронами вещества, в результате которого возникает дифракция рентгеновских лучей с длиной волны ~ 0,1 нм. Последние рассеиваются на электронных оболочках атомов. Интерференция волн, рассеянных веществом, приводит к возникновению дифракционной картины (регистрируется рентгенограмма). Условие дифракции (отражения) дается формулой Брэгга - Вульфа: nλ = 2d∙sinθ, где λ - длина волны; d - расстояние между кристаллическими плоскостями; θ - угол между направлением падающего луча и кристаллической плоскостью. Главная идея рентгеноструктурного анализа состоит в определении расстояний d на основании дифракционной картины, получаемой для рентгеновских лучей с известной λ. Подробные сведения о строении вещества можно получить только при изучении кристаллов, так как их атомы расположены периодически.

 Бурному развитию молекулярной биофизики способствовало применение рентгеноструктурного анализа для исследований пространственной структуры белков и нуклеиновых кислот (ДНК). В настоящее время рентгенография высокого разрешения осуществлена для многих белков. Расшифровка сложных рентгенограмм белков и нуклеиновых кислот - трудная и длительная работа, которую проводят с использованием компьютера.

 Для исследования структуры биополимеров в кристалле используют также метод нейтронографии. Принцип этого метода аналогичен РСА, но вместо рентгеновских лучей используют поток нейронов.

Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) - резонансное поглощение энергии электромагнитных колебаний в сантиметровом или миллиметровом диапазоне длин волн веществами, содержащими парамагнитные частицы (молекулы, атомы, ионы, свободные радикалы, слабо связанные с атомом электроны). Явление ЭПР было открыто Е.К. Завойским в 1944 г. На основе этого явления был разработан один из методов радиоспектроскопии - метод ЭПР.

Изменение ЭПР-спектра спиновых зондов дает информацию о состоянии окружающих его молекул. По форме спектра ЭПР можно определить микровязкость — вязкость ближайшего окружения спинового зонда. Так, в частности, определяют микровязкость липидного слоя мембран, его изменение при разватии ряда патологий, влияние лекарственных препаратов на ПОЛ мембран.

 Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) - резонансное поглощение электромагнитной энергии веществом, обусловленное переориентацией системы магнитных моментов атомных ядер в постоянном магнитном поле. ЯМР был открыт и объяснен Ф. Блохом и Э. Перселлом в 1946 г. ЯМР, как и ЭПР, - один из методов радиоспектроскопии, так как частота электромагнитных волн, вызывающих переходы между энергетическими состояниями при резонансе, соответствует радиодиапазону. ЯМР высокого разрешения представляет собой стандартный метод изучения строения органических молекул, используемый также для исследования механизма и кинетики химических и биохимических реакций. Спектроскопия ЯМР находит все более широкое применение в биофизике и в медицине. Так, методы ЯМР были эффективно использованы при анализе конформационных свойств биополимеров, взаимодействий белков с фармакологическими веществами, взаимодействий белок - лиганд (гемопротеиды), антиген – антитело. Исследование методом ЯМР осуществляется без разрушения образца и поэтому его можно проводить на живых объектах. Такой метод называют ЯМР-интроскопией или магнито-резонансной томографией (МРТ). Он позволяет различать кости, сосуды, нормальные ткани и ткани со злокачественной патологией. ЯМР-интроскопия, например, отличает изображение серого вещества мозга от белого, опухолевых клеток от здоровых. Это эффективный метод диагностики заболеваний, которые связаны с изменением состояний органов и тканей.

 Можно выделить разделы оптической молекулярной спектроскопии, каждый из которых связан с определенным спектральным диапазоном. Так, энергия квантов инфракрасного излучения достаточна лишь для изменения вращательного и колебательного состояний молекул, что используют в методах микроволновой и инфракрасной (ИК) спектрометрии. ИК-спектрометрия широко используется для изучения структуры различных соединений (как неорганических, так и биомакромолекул), что обусловлено четкой взаимосвязью между химическим строением и составом исследуемого соединения и характеристическим для него поглощением излучения. Лазерная спектроскопия - раздел оптической спектроскопии, методы которой основаны на использовании лазерного излучения. Применение лазерного излучения позволяет стимулировать квантовые переходы между определенными уровнями энергии атомов и молекул. Благодаря высокой монохроматичности излучения лазеров с перестраиваемой частотой удается измерять истинную форму спектральных линий вещества, не искаженную аппаратной функцией спектрального прибора. Из-за высокой монохроматичности и когерентности излучение лазера переводит значительное число частиц из основного состояния в возбужденное, что повышает чувствительность метода. Успешно разрабатываются методы регистрации отдельных атомов и молекул. Лазерная спектроскопия дает возможность изучать быстропротекающие (~ 10-6 – 10-12с) процессы возбуждения в веществе. Лазерная спектроскопия широко внедряется в биологию, химию и медицину, особенно для исследования короткоживущих продуктов химических и биологических реакций. Измерение интенсивности потока, рассеянного дисперсной системой, также можно связать с концентрацией определяемого вещества и реализовать метод фотонефелометрии.66 В некоторых случаях молекулы при поглощении квантов энергии могут испускать излучение в более длинноволновой области спектра. Использование такого рода электронных спектров испускания (фотолюминесценции) для химико-аналитических целей составляет основу другого метода - флуориметрии. К методам оптической молекулярной спектрометрии относятся также метод рефрактометрии (основан на использовании явления преломления света веществом) и поляриметрии (использует способность оптически активных соединений вращать плоскость поляризации света).

 Вопросы и задания для самоподготовки

1. Какие методы используют для изучения структуры белков в кристаллическом состоянии?

2. В чем сущность методов ренгеноструктурного анализа и нейтронографии? В чем достоинства и недостатки этих методов?

3. Применение оптических методов (спектрофотометрия, рефрактометрия, люминесцентные методы, метод флуоресцентных зондов) для изучения действия лекарственных веществ, контроля качества лекарств.

 Рекомендуемая литература

1. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика : учеб. для вузов / А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я. Потапенко. – М., 2003. – С. 357- 360; 496-504.