дцРНК: РНК-вирусы, генно-инженерные конструкции, длинные шпильки в составе транскриптов, двунаправленная транскрипция (в смысловой и антисмысловой ориентации) мобильных элементов и участков ДНК, транскрипция инвертированных повторов.

РНК-интерференция или РНК-сайленсинг – это группа механизмов сиквенс-специфического подавление экспрессии генов у эукариот (замалчивание генов). Механизм основан на комплементарных взаимодействиях между мРНК и одноцепочечными РНК (оцРНК), процессируемыми из небольших молекул двухцепочечной РНК (дцРНК). Эти короткие оцРНК объединяются с белками и формируют комплекс, который связывается с комплементарными последовательностями в мРНК или ДНК и подавляет экспрессию генов с помощью разрезания мРНК, ингибирования трансляции или изменения структуры хроматина. Т.е. подавление экспрессии может происходить как на уровне транскрипции, так и посттранскрипционно. Во всех случаях необходимы сходный набор белков и короткие (~22 н.) РНК. РНК-сайленсинг обнаружен у представителей всех крупных таксонов эукариот.

Открытие: для создания более насыщенного цвета в петунию вводили генную конструкцию, содержащую кодирующую последовательность гена хальконсинтазы CHS, который участвует в синтезе пигмента. Происходило подавление экспрессии как трансгенных, так и эндогенных копий гена CHS. Оно сопровождалось деградацией соответствующих мРНК. Это косупрессия или посттранскрипционным

замалчиванием гена (PTGS).

Исследовали фенотипический эффект инъекций оцРНК и дцРНК гена unc-22 в гонады Caenorhabditis elegans. Ген unc-22 кодирует миофиламентный белок. Снижение активности этого гена ведет к судорожным движениям. Инъекции дцРНК, но не оцРНК индуцировало судорожный фенотип у потомства.\

Механизм: Фермент Дайсер связывается с дцРНК и разрезает её на короткие фрагменты в 21-23 п.н. – siРНК

(small interfering RNA). Короткие дцРНК связываются с ферментативным комплексом RISC (RNA-induced silencing complex). Цепи дцРНК разделяются за счет хеликазной активности. Активная цепь остается в составе зрелого комплекса RISC, вторая удаляется. siРНК-RISC связывается с мРНК- мишенью и нуклеазная активность комплекса RISC разрезает мРНК, что приводит к её последующей деградации клеточными нуклеазами.

Функция – защита организмов от вирусов и мобильных элементов, поддержание стабильности генетического материала, подавление активности мобильных элементов (дрозофила,

растения), экспериментальным методом функциональной геномики и медицины.

Нематода: короткий жизненный цикл (50 часов!), известное число клеток (959 клеток), гаплоидный набор 5 аутосом, Х-хромосома, геном секвенирован, ~10 млн.п.н., 19 тыс. генов

Плазмиды, кодирующие двунитевые РНК были введены в E.coli. Синтез дцРНК индуцировали IPTG  (изопропилтиогалактозид). Личинок помещали на чашки с подложкой из E.coli, которой они питаются.

Взрослых червей затем помещали на такие же чашки для откладки яиц. На следующем этапе взрослых животных удаляли и у потомства анализировали эмбриональную гибель и фенотипы.

Была создана библиотека, содержащая 16757 клонов E.coli, продуцирующих индивидуальные двуцепочечные РНК, каждая из которых гомологична определенному гену C.elegans. С помощью РНК-интерференции удалось подавить функцию 86% генов C.elegans (всего предсказано 19457 генов). Идентифицированы мутантные фенотипы для 1722 генов, 2/3 из них ранее не были связаны с фенотипом. Инактивация около 10% генов приводила либо к гибели эмбрионов или личинок, либо к слабому росту личинок, стерильности, морфологическим дефектам и некоординированному движению взрослых.

Вопрос №86

РНК-сайленсинг. Образование и основная функция miРНК. Гены miРНК. Биологическая роль miРНК.

Ген lin-4 осуществляет негативную регуляцию трансляции гена lin-14, который инициирует переход в личиночную стадию L2. Ген lin-4 кодирует малую РНК, которая частично комплементарна 7-ми

неодинаковым консервативным сайтам на 3’-нетранслируемом участке мРНК lin-14 и связывается с ними.

Транскрипция этих генов осуществляется РНК-полимеразой II. В результате синтезируются первичные miРНК (pri-miРНК), которые образуют специфические шпилечные структуры. Pri-miРНК процессируются белковым комплексом, содержащим фермент DROSHA (РНКаза III), c образованием pre-miРНК (~70 н.). .Pre-miРНК транспортируется из ядра в цитоплазму при участии Экпортина 5. В цитоплазме pre-miРНК

процессируется ферментом Дайсер. В результате образуется дцРНК примерно в 22 н. Короткие дцРНК связываются с ферментативным комплексом RISC. Цепи дцРНК разделяются за счет хеликазной активности. Активная цепь остается в составе зрелого комплекса RISC, вторая удаляется. miРНК-RISC связывается с комплементарными последовательностями в 3’-нетранслируемом участке мРНК-мишени и

репрессирует её трансляцию. Комплементарность неполная.

Микро РНК кодируются генами. Размер генов варьирует от сотен до тысяч п.н. Гены, как правило, расположены в межгенном пространстве белок-кодирующих генов (транскрибируются независимо), но могут находится в интронах или экзонах (транскрибируются в составе других генов. Несколько генов микроРНК могут транскрибироваться в единую полигенную мРНК.

Автономная транскрипция – 1 шпилька и полигенный транскрипт, который после процессинга даст несколько  miРНК. Гены miРНК расположен в интроне или в экзоне другого гена (белок-кодирующего гена и котранскрибируется с ним).

Зрелая miРНК может быть локализована как на 5’-, так и на 3’-плече шпилечной структуры. В ряде случаев оба плеча могут генерировать функциональную miРНК

Все клеточные процессы: эмбриональное развитие, дифференцировка, старение, клеточный цикл, метаболизм, апоптоз, канцерогенез, ….. У человека идентифицировано ~ 1900 генов miРНК и > 35000 мишеней. Биологическая функция – тонкая регуляция экспрессии генов, в

основном, на постранскрипционном уровне. Для miРНК характерны индивидуальные паттерны экспрессии, органо-, ткане-специфичность, зависимость от стадии развития организма.Изменения экспрессии miРНК ассоциированы со многими болезнями. Гены miРНК сами могут действовать, как опухолевые супрессоры или онкогены. Поэтому они являются биомаркерами и могут использоваться в терапевтических целях. Изменения в miРНК выявлены во всех типах рака. Поэтому профилирование miРНК служит диагностическим и прогностическим инструментом.

Вопрос №88.                                                                                                            

Генетическая инженерия. Суть технологии. Теоретические основы генетической инженерии. Задачи генной инженерии. Почему необходимо изучать генетическую инженерию. Схема типичного эксперимента по молекулярному клонированию ДНК.

Генетическая инженерия – использование основ и методов молекулярной генетики и молекулярной биологии для конструирования организмов с заданными наследственными свойствами. Суть технологии – создание рекомбинантных ДНК и введение их в реципиентные клетки.

Теор основы: ДНК и РНК – носители генетической информации. Установлены общие принципы воспроизведения макромолекул в живых организмах: репликация, транскрипция, трансляция. Универсальность генетического кода. Открытие процесса рекомбинации ДНК. Открытие плазмид и рестриктаз.

Задачи генной инженерии: Создание генетических конструкций для изучения фундаментальных проблем. Получение биопродуцентов. Создание трансгенных организмов с новым сочетанием признаков. Генетическая коррекция. Генотерапия. Сохранение и рациональное использование генофондов.

Схема типичного эксперимента по молекулярному клонированию: Получение фрагмента или фрагментов ДНК, конструирование in vitro рекомбинантных молекул, введение их в клетку, отбор клонов, несущих рекомбинантную молекулу.

Вопрос №89

Системы рестрикции и модификации ДНК. Характеристика рестриктаз II типа. Приведите структуру любого шестичленного палиндрома и липких концов фрагментов, при условии, что рестриктаза режет эту последовательность между 1-м и 2-м нуклеотидами. Общие принципы конструирования рекомбинантных молекул с использованием рестриктаз.

Получение фрагментов ДНК - эндонуклеазы рестрикции узнают в ДНК специфические для каждого фермента последовательности нуклеотидов и разрезают ее. Роль систем рестрикции-модификации заключается в защите клеток от проникновения чужеродной ДНК Рестриктазы типа II узнают и раcщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии.

Тип II: Состоят из двух белков – R (рестрикция) и M (метилирование), которые функционируют независимо.

Разрезание нуждается только в Mg+2. Сайты узнавания могут быть симметричными или несимметричными.

Расщепляют ДНК в сайте узнавания или на определенном расстоянии от него.

Сайт узнавания BamHI: G’GATCC/CCTAG’G

Sau3A: ‘GATC/CTAG’

PstI: CTGCA’G/G’ACGTC

HpaI: GTT’ACC/CCA’TTG

Образуются выступающие липкие концы.

Фосфатный: у BamHI

Гидроксильный: у PstI

Тупой: у HpaI

ДНК-лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между соседними 3’-OH и 5’-фосфатными концами ДНК.

Есть молекула с А и В с сайтами узнавания BamHI. Обрабатывают рестриктазой, получили липкие концы. Смешали, лигазой сшили.

Вопрос №90

Понятие о векторах. Основные и дополнительные свойства векторов. Клонирование в генетической инженерии. Отбор рекомбинантных молекул на примере клонирования в плазмидном векторе с инсерционной инактивацией.

Клонирование – это использование процедур манипулирования ДНК для получения множественных копий гена или фрагмента ДНК. Клонирование достигается с помощью перемещения фрагмента ДНК в векторную молекулу.

Вектор (векторная молекула) – молекула ДНК, способная переносить чужеродную ДНК и обеспечивать ее поддержание в реципиентных клетках: плазмиды и вирусы (фаги).

Вектор должен: автономно реплицироваться в клетках какого-либо хозяина, иметь селективный маркер (маркеры), иметь уникальный сайт (сайты) клонирования, не утрачивать способности к автономной репликации в рез-те инсерции чужеродной ДНК.

Вектор должен: стабильно поддерживаться в клетках, быть мультикопийным, быть небольшого размера, иметь сайты рестрикции внутри генов устойчивости к антибиотикам (для плазмидных векторов).

По происхождению: плазмидые, фаговые: на основе фага λ, на основе однонитевых фагов.

Есть векторы для клонирования и векторы клонирования для ПЦР. pGEMT-easy: несёт бета-галактозидазу. Если вставка произошла, мы разрываем её ген. Галактозидаза  помимо лактозы расщепляет X-Gal. этот Х гал содержит краситель, который при расщеплении х гала высвобождается и окрашивает колонию. вот мы внесли вектор в клетку. Если вектор вставился, то бетагалактозидаза осталась разорваной=> она ничего не расщепляет, колония не окрашена. Если же вектор не вставился, то он замклутся в кольцо=>бетагалактозидаза восстановится и будет расцеплять Х гал=> колония окрасится в синий. Если вставки не произошло, то клетки синие,

Есть плазмида с генами устойчивости к ампицилину и стрептомицину. В гене стрептомицина есть сайт рестрикции. Берём чужеродную ДНК с 2 сайтами рестрикции. Рестриктазим, потом сшиваем. Получаем рек и нерек ДНК. Трансформируем клетку. Клонируем. Рекомб клоны не стойчивы к стрептомицину.

Вопрос №91.