Фундаментальные науки:

- физиология растений (регенерация, гормоны, культуры клеток и тканей);

- биохимия;

- генетика и селекция (андрогенез и мутагенез);

- кибернетика;

- информатика;

- микробиология (синтез АК, азотфиксаторы, векторы);

- инженерная энзимология.

Прикладные науки:

- иммобилизованные клетки и ферменты;

- молекулярная биология (структура генома, экспрессия генома);

- БАВ.

Требования к продуцентам. Отбор продуцентов для биотехнологического процесса.

Промышленный штамм должен удовлетворять следующим требованиям (по Л.И.Воробьевой, 1987):

а) способность к росту на дешевых питательных средах,

б) высокая скорость роста и образования целевого продукта,

в) минимальное образование побочных продуктов,

г) стабильность продуцента в отношении производственных свойств,

д) безвредность продуцента и целевого продукта для человека и окружающей среды;

е) быть устойчивым к фагам и другой посторонней микрофлоре;

ж) желательно, чтобы продуценты были термофильными и ацидофильными (или алкалофильными), т.к. легче предохранить ферментируемый субстрат от контаминации посторонней микрофлорой;

з)  целевой продукт биосинтеза должен легко выделяться из субстрата.

Во многих биотехнологических процессах используют ограниченное число микроорганизмов, которые классифицируются как GRAS («generally recognized as safe» обычно считаются безопасными). К GRAS относят микроорганизмы непатогенные, нетоксичные и в основном не образующие антибиотики, поэтому при разработке нового биотехнологического процесса следует ориентироваться на данные микроорганизмы, как базовые объекты биотехнологии.

К таким микроорганизмам относят бактерии Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, другие виды бацилл и лактобацилл, виды Streptomyces. Сюда также относят виды грибов родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus и дрожжей Saccharomyces и др.

         Отбор продуцентов для биотехнологического процесса.

Определение способности синтезировать целевой продукт - главный критерий при отборе продуцентов.

1. Выделение микроорганизмов из природных источников. Отбирают пробы из мест обитания микроорганизмов (почва, растительные остатки и т.д.).

а) Получение накопительных культур. Образцы вносят в жидкие питательные среды специального состава, создают благоприятные условия для развития продуцента (температура, РН, источники энергии, углерода,
азота и т.д.).

б) Выделение чистых культур. На плотные питательные среды засевают образцы проб из накопительных культур. Изолированные колонии или клоны,
при пересеве - чистые культуры, состоящие из клеток одного вида про­дуцента.

2. Подбор микроорганизмов из имеющихся коллекций. Например, продуцентами антибиотиков чаще являются актиномицеты, этанола -дрожжи.

3. Лабораторные штаммы, изменённые в результате селекции или индуцированных мутаций. Основной контингент промышленных микроорганизмов представлен искусственно селекционно-выведенными штаммами. Отбор случайных мутаций применяют тогда, когда не известен путь синтеза метаболита и его регуляция. Этот метод отбора всегда осуществляется в несколько последовательных этапов, поэтому его часто называ­ют ступенчатым отбором. Суть метода заключается в следующем:

•     Исходная культура обрабатывается мутагеном, взятым в нескольких дозах.

•     Отбирают 100 клонов, выросших после воздействия каждой отдельной дозы мутагена и определяют уровень продукции метаболита.

Уровень продукции выражают в процентах по отношению к уровню продукции исходной культуры и распределяют в вариационном ряду.

•     Полученные вариационные ряды, число которых соответствует числу примененных доз, сравнивают с контрольным рядом.

•     Отбирают плюс ­варианты и оценивают их продукционную способность в нескольких повторах.

•     Выбирают варианты, дающие максимальную продукцию, и еще раз проверяют их уровень продукции после 2–3 пересевов на агаризованной среде.

•     Все данные суммируются и обрабатываются статистически.

•     Выбирают вариант, уровень продукции которого достоверно превышает уровень продукции исходного штамма.

Последовательные этапы отбора, проводимого непосредственно по количественному признаку, позволяют «собрать» в геноме продуцента группу мутаций, сочетание которых и обеспечивает высокий уровень продукции. Такой подход широко применяется для получения сверхпродуцентов аминокислот и особенно антибиотиков. С большим эффектом он применялся в течение многих десятилетий. Классическим примером является создание Висконсинской серии продуцентов пенициллина, которая была осуществлена в США на штамме Penicillum chrysogenum с применением различных физических и химических мутагенов. Селекция штаммов этой серии, продолжавшаяся более 30 лет, позволила повысить уровень продукции пенициллина в несколько тысяч раз по сравнению с уровнем исходного штамма.

4. Штаммы, полученные методами генной или клеточной инженерии.

8.

9. Получение трансгенных организмов.

 К наи­более важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК сле­дует отнести следующие:

1. Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами, что в значительной степени ускоряет выделение различных генов и манипуляции с ними.

2. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фраг­менте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида;,

3. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания.                                   

4. Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий.

5. Генетическая инженерия, позволяющая получать модифицированные версии генов и затем внедрять их в клетки или организмы.

Технология рекомбинантных ДНК оказала существенное воздействие на всю клеточную биологию, позволяя решать такие задачи, как определение строения и функций не только белков, но и индивидуальных доменов, а также расшифровывать механизмы регуляции экспрессии генов, получать многие белки, участвую­щие в регуляции обменных процессов, клеточной пролиферации и развитии организма.