Процедура T-bags (чайные пакетики Хоугтена)

Эта процедура разработана Хоугтеном в 1986 г. Она использовалась в комбинаторном синтезе для получения 150 пептидов за один раз. Полимерная подложка (обычно 100 мг) помещается в полипропиленовую сетчатую упаковку размером 3 на 4 см, похожую на одноразовый чайный пакет. Каждый пакет имеет метку. Эти пакеты затем помещаются в полиэтиленовую контейнер, который выступает как реакционный сосуд.

В случае пептидного синтеза в различные полиэтиленовые контейнеры добавляются различные аминокислоты. В этом случае все пакеты в одном контейнере приобретают связанные со смолой аминокислоты. После этого все пакеты из каждого контейнера собираются в один сосуд для снятия защиты и промывания. Это позволяет провести снятие защиты за одни раз, избегая необходимости снимать защиты отдельно для каждой аминокислоты. После этого пакеты перераспределяются между контейнерами и происходит добавление следующей аминокислоты, затем снятие защиты и промывание, перераспределение для добавления следующей аминокислоты и так далее. Объединенные процедуры снятия зашиты и промывания проходят достаточно быстро. Достоинством этого метода является то, что он дешев и может быть осуществлен без дополнительного оборудования. Основная проблема заключается в том, что он осуществляется вручную и это ограничивает качество и скорость, с которой могут быть получены новые структуры. Поэтому в фармацевтической промышленности сейчас используется автоматизация параллельного синтеза.

Автоматический параллельный синтез

Автоматические синтезаторы могут справляться с параллельным синтезом 42, 96 или 144 структур, в зависимости от числа используемых реакционных ячеек. Твердая подложка используется в форме трубки или иголки (4 мм диаметр и 40 мм длины) которая помещается в каждую реакционную пробирку или ячейку.

Методы комбинаторного синтеза

Основные принципы

Комбинаторный синтез часто используется для получения смесей продуктов. Для этого используется широкий набор исходных материалов и реагентов. Это не значит, что все возможные исходные материалы сразу помещены один реакционный сосуд. Планирование комбинаторного синтеза означает стремление к минимизации труда и максимизации числа получаемых структур.

Для примера, предположим, что мы хотим синтезировать все возможные дипептиды из пяти различных аминокислот. Используя традиционную химию их можно получать по одному. Таким образом, 25 возможных дипептидов будут получены в 25 отдельных экспериментах.

Однако используя комбинаторную химию все они могут быть получены с гораздо меньшим трудом. Если все пять различных аминокислот отдельно связать с гранулами смолы, то эти гранулы затем могут быть смешаны вместе. Таким образом, можно получить все возможные дипептиды путем взаимодействия со второй аминокислотой за пять экспериментов. Например, в одном эксперименте пять различных аминокислот будут реагировать с глицином, давая пять из 25 возможных дипептидов:

Эта смесь затем может быть протестирована на биологическую активность. Если результаты положительные, то усилия будут направлены на идентификацию того дипептида, который проявляет активность. Если активности нет, то эта смесь будет отставлена и отправлена на хранение. Полученные смеси не выбрасываются. Хотя они и не содержат соединения-лидера, но они могут содержать лидер для другой области медицинской химии. Все эти смеси как активных, так и не активных соединений, образующихся при комбинаторном синтезе, сохраняются и носят название “комбинаторных библиотек”. Последовательная обработка связанных аминокислот другими кислотами из приведенного набора даст 5 смесей состоящих из 25 пептидов.

Мы привели пример получения 25 соединений за пять синтезов. Однако, используя комбинаторный синтез имеется возможность получения тысяч или даже миллионов соединений.

Принцип “смешай и раздели”

В случае когда генерируются большие количества различных структур очень важно минимизировать объем работ. В этом случае очень хорошие результаты дает так называемый принцип смешивания и разделения (mix and split method). Этот принцип лучше проиллюстрировать на примере. Предположим, что мы хотим получить все возможные трипептиды из трех различных аминокислот (например, Gly, Val, Ala). Для это применим метод смешивания и разделения:

Стадия 1 – свяжем каждую аминокислоту с твердой подложкой

Стадия 2 – смешаем все гранулы вместе и поделим смесь на три равные части

Стадия 3 – проведем реакции каждой части с разными аминокислотами

Стадия 4 – выделим все гранулы, смешаем затем их все вместе и поделим
на три равные части. Каждая часть сейчас содержит все 9 возможных дипептидов

Стадия 5 – проведем реакции каждой порции с тремя аминокислотами

В результате мы получили все 27 возможных трипептида всего за три эксперимента вместо 27 по классической схеме. В этом примере происходило связывание между собой аминокислот, но по эту стратегию можно использовать для связывания вместе и других мономерных единиц или комбинации химических структур.

Этот принцип используется в методе комбинаторного синтеза “одна гранула – одно соединение” (One-Bead – One-Compound или ОГОС). В этом случае одна гранула связывается только с одим типом молекул, хотя их может находиться на этой грануле диаметром 100 микрон до триллиона копий. Этот метод позволяет, с одной стороны, создавать библиотеки олигомеров. Описаны созданные на основе этого метода библиотеки пептидов из 20 природных L-аминокислот, олигонуклеотидов, олигосахаридов, пептоидов, олигокарбаматов, олигомочевин и др.

Другое очень важное направление применения метода ОГОС – получение библиотек небольших молекул. Эти методом созданы библиотеки бензодиазепинов, гидантоинов, кубанов, лактамов, тиазолидинов, тетрагидрофуранов, бензпиранов, изоксазолов, триазолов, циклопентанов, циклогексанов, пиперазинов, дикетопиперазинов, пиридинов, хинолинов, бенимидазолов, хиназолинов, триазинов и др.

Смесь реагентов

Второй синтетический подход, названный методом “смесь реагентов”, предполагает использование избытков реагентов в отношении каждой реакционного цента на твердофазном субстрате. Применение таких смесей реагентов требует полного знания механизма и кинетики процессов, используемых в выполняемых реакциях. Большой избыток поступающих реагентов используется для того, чтобы наблюдалась реакция кинетики псевдопервого порядка. Однако этот подход имеет существенные ограничения. Очень важно, чтобы относительные скорости реакций вводящихся реактивов были приблизительно равными, т.е эти реагенты должны иметь примерно равную нуклеофильность и отсутствие стерических помех. Такие требования довольно трудно выполнять. Тем не менее было обнаружено, что эта концепция хорошо применима к синтезу гетероциклических библиотек типа циклической мочевины и тиомочевины.

Фотолитография

Фотолитография – это техника для миниатюризации комбинаторного синтеза. В синтезе пептидов поверхность твердой подложки состоит из аминогрупп, защищенных фотолабильной нитровератрилоксикарбонильной защитной группой (NVOC). Используя маску – защищая часть поверхности от облучения светом, удается снять защиту в экспонированной области.

После этого плата обрабатывается аминокислотой и в результате реакция протекает только в той области на плате, где предварительно была снята защита. Плата затем промывается для удаления избытка аминокислоты. Затем процесс может повторен в другой области платы, используя другую маску и таким образом различные пептидные цепи могут быть построены на различных частях платы, последовательность которых известна по записям на используемых масках.

Затем проводится инкубация платы с белком рецептора, для определения активного соединения, которое закреплено в соответствующем положении платы. Удобный метод для осуществления этого процесса – это использование платы с флуресцентно-меченым рецептором. В этом случае только в присутствия активного соединения будет наблюдаться флуоресценция. Интенсивность флуоресценции может быть измерена методом флуоресцентной микроскопии и, таким образом, можно определить сродство синтезированного соединения к рецептору. Альтернативным способом может быть использование радионуклидов или хемолюминисценции.

Возможности этого метода очень высоки. При 20-микронном разрешении может быть приготовлена плата, на которой находится 250 000 различных соединений на квадратном сантиметре.

В случае пептидного синтеза общие операции, такие как снятие защиты и промывание, производятся путем погружения платы в большие бани, но связывание производится в ячейках, таким образом, чтобы каждая ячейка содержала уникальную аминокислоту.

Добавление реагента и удаление его избытка, а также нагревание и охлаждение реакционных смесей, может осуществляться автоматически. Такие синтезаторы подходят как для множественного параллельного синтеза индивидуальных соединений, так и для параллельного синтеза смесей, содержащих различные, но структурно подобные соединения.