Для проведения исследования используем препарат «Фолиевая кислота» (Борисовский ЗМП, Беларусь), таблетки по 0,001 г (рис. 1).

Рисунок 1. ЛП фолиевой кислоты.

Для идентификации и количественного определения кислоты фолиевой используют химические и физико-химические методы.

В химическом анализе кислоты фолиевой применяют реакции окисления, комплексообразования, кислотно-основные свойства растворов. При окислении необходимо строгое соблюдение температурного режима.

Так, например, для испытания подлинности кислоты фолиевой ГФ X рекомендует использовать ее свойство легко окисляться перманганатом калия при нагревании до 80-85°С. Избыток реактива удаляют действием раствора пероксида водорода, смесь фильтруют и наблюдают характерную голубую флуоресценцию фильтрата в УФ-свете при 254 нм. Испытание основано на образовании n-амино-бензоилглутаминовой и птериновой кислот.

ГФ X и МФ для установления подлинности ЛП кислоты фолиевой рекомендуют использовать УФ-спектроскопию. Спектр поглощения 15 мкг/мл раствора препарата в растворе гидроокиси натрия (0,1 моль/л) при наблюдении в области от 230 до 380 им имеет три максимума (при 256, 283 и 365 нм) и три минимума (235, 265, 332 нм). Поглощение при этих длинах волн составляет соответственно 0,82, 0,80 и 0,28 (для измерения предпочтительно использовать кювету с толщиной слоя 2 см и сделать пересчет на поглощение в кювете с толщиной слоя 1 см). Отношение поглощения слоя толщиной 1 см при 256 нм к поглощению при 365 нм — от 2,80 до 3,00.

Для установления подлинности используют также метод ТСХ. На пластинку Плазмахром или Армсорб УФ-254 наносят растворы испытуемой кислоты фолиевой и ее ГСО. Хроматографируют восходящим методом в системе растворителей этанол-м-пропанол-раствор аммиака (60:20:20). Детектируют в УФ-свете при 365 мм. Положение и размер пятен должны быть идентичны.

По МФ в качестве адсорбента используют силикагель Р-1, а в качестве подвижной фазы смесь 2 объемов 1-пропанола Р, 1 объема этанола (~750 г/л) ИР и 2 объемов аммиака (~260 г/л) ИР. На пластинку наносят отдельно по 2 мкл каждого из двух растворов в смеси 9 объемов метанола Р и 1 объема аммиака (~260 г/л) ИР, содержащих: (А) 0,50 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 0,50 мг стандартного образца фолиевой кислоты в 1 мл. Вынимают пластинку из хроматографической камеры, дают ей высохнуть на воздухе и оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (365 нм). Основное пятно, полученное на хроматограмме с раствором А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности пятну, полученному с раствором Б.

Наличие в птериновой части молекулы кислоты фолиевой подвижного атома водорода в гидроксильной группе и третичных атомов азота позволяет получать нерастворимые в воде окрашенные внутрикомплексные соли с катионами меди (II), свинца, серебра, кобальта, железа (III).

Для идентификации кислоты фолиевой и определения содержания примесей в ней ряд авторов рекомендует апробировать метод обращено-фазной ВЭЖХ. В работе применяли жидкостные хроматографы: LC-20 фирмы"Schimadzu" (Япония) с диодно-матричным и флуоресцентным детекторами; SERIES 200 фирмыPerkin Elmer (США) с УФ детектором. В качестве неподвижной фазы предлагают использовать С-Фенил, С-18 или любой сильный анионообменник. В качестве подвижной фазы – ИПХ-A в Н₂О/метанол (70:30) или 1М Na₂HPO₄ (рН=3)/ацетонитрил (20:80). Для повышения селективности обнаружения в ряде случаев используются электрохимические детекторы.

Для качественного и количественного анализа кислоты фолиевой в лекарственных  формах применяется также фотоэлектроколориметрический метод анализа, основанный на образовании азокрасителя из образующейся при окислении перманганатом калия пара-аминобензоилглутаминовой кислоты, которую диазотируют и азосочетают образовавшуюся соль диазония с N-(1-нафтил)этилендиамином. Интенсивность окраски образовавшегося азокрасителя измеряют на фотоэлектроколориметре со светофильтром, имеющим максимум пропускания 550 нм.

Спектрофотометрическое определение кислоты фолиевой может быть выполнено при длине волны 365 нм (растворитель 0,1 М раствор гидроксида натрия) или 320 нм (растворитель 5 М раствор серной кислоты). Указанную методику используют для установления допустимого содержания примесей свободных аминов в кислоте фолиевой (без предварительного окисления испытуемого лекарственного вещества). ФС допускает не более 1% примесей свободных аминов. В качестве стандартного образца используют n-аминобензойную кислоту.

Методика фотоколориметрического определения кислоты фолиевой по МФ отличается тем, что гидрирование осуществляют, действуй порошком цинка в присутствии хлороводородной кислоты. Параллельно ставят контрольный опыт.

Описано обратное алкалиметрическое определение кислоты фолиевой. Растворяют навеску в избытке 0,1 М раствора гидроксида натрия, а затем медленно титруют 0,1 М раствором соляной кислоты. Используют либо смешанный индикатор (фенолфталеин с метиленовым синим), либо тимолфталеин. Параллельно определяют содержание свободной n-аминобензоилглутаминовой кислоты, извлекая ее из кислоты фолиевой этанолом.

Полярографическое определение кислоты фолиевой основано на ее способности легко восстанавливаться в среде карбоната натрия до 7,8-дигидрофолиевой кислоты. Полученный раствор 7,8-дигидрофолиевой кислоты помещают в ячейку полярографа, термостатированную при 25°, пропускают ток азота в течение о минут и снимают полярограмму, начиная с 0,6 в. Содержание безводной фолиевой кислоты в препарате в процентах вычисляют по соответствующей формуле.

Рядом авторов установлены условия разделения и количественного определения кислоты фолиевой в элюенте на основе смеси 1% раствора диэтиламина, 1% раствора триэтиламина и фосфорной кислоты (рН=6,7) на сорбенте с фазой С-18 при высоких коэффициентах удерживания без традиционного применения ион-парных реагентов. При этом хроматографическая система характеризуется хорошей симметрией пиков (менее 1,2), высокой селективностью (более1,1) и разрешением (более 3,8) при времени анализа25 мин.

ГФ и МФ рекомендуют определять в препарате кислота фолиевая содержание воды. По ГФ навеску ЛП сушат до постоянного веса в вакууме при температуре 110°С и остаточном давлении 15—20 мм рт. ст. Потеря в весе не должна превышать 8,5%. По МФ содержание воды в кислоте фолиевой определяют по методу К. Фишера (не менее 70 и не более 90 мг/г).

По ГФ Х сульфатная зола из 0,5 г препарата не должна превышать 0,3% и должна выдерживать испытание на тяжелые металлы (не более 0,001 % в препарате).

По МФ определяют содержание свободных аминов: отношение поглощения А_Т испытуемого раствора Т₂ к поглощению А_В контрольного раствора В₁, измеренное при количественном определении, не должно быть более 6.