Метод ДВЖХ был разработан как технология детекции мутаций и позднее адаптирован для определения изменений в паттернах метилирования ДНК. В первоначальном протоколе мутантные ампликоны и ампликоны дикого типа анализировались путем хроматографии в обратной фазе в условиях частичной денатурации с последующей детекцией в УФ или анализом флуоресценции.

Для определения различий в метилировании после обработки бисульфитом натрия интересующую область ДНК амплифицируют с недискриминирующими праймерами и ампликоны переносят на колонки для ДВЖХ. Ампликоны, полученные с метилированной последовательности имеют более высокое содержание CG-пар и, соответственно, медленнее плавятся, элюируясь из колонки позже, чем продукты амплификации неметилированной последовательности. Недостатки метода заключаются в необходимости наличия специального дорогостоящего оборудования и использовании токсичных веществ. В настоящее время имеется мало информации о чувствительности МС-ДВЖХ.

Анализ метилирования ДНК – один из важнейших инструментов изучения нормального функционирования генома и молекулярных основ патогенеза заболеваний человека. Однако на сегодняшний день получение достоверной информации о характере метилирования генома и его отдельных участков остаётся далеко не тривиальной задачей. С одной стороны, клеточная гетерогенность большинства тканей затрудняет определение паттернов метилирования отдельных типов клеток; с другой, ни одна из современных методик не позволяет получить исчерпывающие и однозначные сведения о характере метилирования ДНК. Выше были представлены основные методы анализа метилирования с указанием главных преимуществ и недостатков, знание которых необходимо при планировании конкретных экспериментов. Выбор того или иного метода определяется техническими возможностями лаборатории, задачами исследования, а также количеством и качеством доступного биологического материала.

Количественные и качественные характеристики образцов ДНК – серьёзные факторы, ограничивающие выбор метода анализа метилирования. Ряд методик подразумевает использование не менее 1мкг ДНК высокого качества, которая может быть получена только из свежих образцов тканей или культур клеток. Возможности изучения метилирования ДНК, экстрагированной из архивных образцов, таких, как парафиновые блоки, сильно ограничены вследствие высокой степени деградации матрицы. Дальнейшая деградация ДНК в ходе бисульфитной обработки значительно снижает количество интактных молекул ДНК, доступных для ПЦР-анализа, что приводит к необходимости использования ПЦР с вложенными праймерами. При этом низкая стартовая концентрация матрицы может привести к неравновесной амплификации метилированных и неметилированных аллелей, вследствие чего точная количественная оценка результатов становится практически невозможной.

В случае ген-специфического анализа метилирования, когда объектом исследования, как правило, является аномальное метилирование CpG-островков, необходимо, прежде всего, определить, какая степень разрешения достаточна для получения поставленной в эксперименте задачи. Так, диагностика болезней импринтинга, при которых наблюдается полное отсутствие метилированных либо неметилированных аллелей, не требует ни обширного исследования паттернов метилирования, ни точного количественного анализа. В этом случае достаточно применения методик, основанных на обработке ДНК метил-чувствительными рестриктазами с последующим анализом рестриктов блот-гибридизацией по Саузерну или ПЦР. Более точные и чувствительные методики, обычно основанные на бисульфитной модификации ДНК, используются для выявления и детальной характеристики метилированных аллелей в ДНК из образцов стареющих или раковых тканей, а также в свободной ДНК из неопластических и предраковых образований, обнаруживаемой в плазме крови и других биологических жидкостях.

К сожалению, протоколы, основанные на бисульфитной модификации ДНК, до сих пор далеки от совершенства, как в плане простоты исполнения, так и в плане четкости и воспроизводимости результатов. Как указывалось выше, ряд артефактов может возникать вследствие неполной конверсии цитозина и случайной конверсии 5-метилцитозина исходной матрицы. Эффективность исследований, основанных на анализе бисульфит-модифицированной ДНК, в значительной степени зависит от дизайна праймеров для метил-специфической ПЦР и/или секвенирования. Удовлетворительные результаты даёт использование для дизайна праймеров компьютерной программы MethPrimer, доступной на Интернет-сайте http://www.ucsf.edu/urogene/methprimer.

Мощным инструментом выявления типов клеток, аномально метилированных в составе различных тканей, является анализ ДНК из клеток, разделенных методами микродиссекции или проточной цитофлуориметрии. Внедрение подобных новейших технологий анализа может значительно расширить представления о роли метилирования ДНК в процессах нормального развития, старения и патогенеза заболеваний человека и повысить эффективность и точность ДНК-диагностики на основе анализа метилирования.

Рекомендованная литература.

1. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В., Бабенко О.В., Васильев Е.В., Землякова В.В., Жевлова А.И., Дрозд О.В. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях. Молекулярная биология. – 2004. - Том 38. - №2. - с. 213-223.       

2. Esteller, Manel (Ed.): DNA Methylation: Approaches, Methods and Applications.

CRC Press, 212 pp (2005).

3. Ushijima T: Detection and interpretation of altered methylation patterns in cancer cells. Nat. Rev. Cancer. – 2005. - Vol. 5, No. 3, Р. 223-231.

4. Zuo Tao, Benjamin Tycko, Ta-Ming Liu, Huey-Jen L Lin, Tim H-M Huang

Methods in DNA methylation profiling. Epigenomics. – 2009. - Vol. 1, No. 2, P. 331-345.