В течение многих лет ВЖХ являлась основным методом для количественного определения глобального уровня метилирования ДНК. Стандартная методика включает в себя гидролиз ДНК до дезоксирибонуклеотидов под воздействием комбинации дезоксирибонуклеазы I и нуклеазы Р1, превращение дезоксирибонуклеотидов в дезоксирибонуклеозиды путем обработки щелочной фосфатазой и разделение продуктов методом ВЖХ в обращенной фазе. Идентификация и количественное определение цитозина и 5-метилцитозина проводится относительно внешних контролей, содержащих стандартизированные образцы азотистых оснований, по поглощению ультрафиолетового света с длиной волны 254 нм.

Модификация описанного метода подразумевает разделение продуктов гидролиза ДНК посредством высокоразрешающего капиллярного электрофореза. По сравнению с ВЖХ, этот метод является более простым, быстрым и экономичным. Чувствительность обоих методов невысока (≤5мкг), и может оказаться недостаточной при изучении образцов опухолевых тканей. Значительное повышение чувствительности возможно при комбинации жидкостной хроматографии или капиллярного электрофореза с масс-спектрометрией.

Альтернативой описанным подходам, требующим наличия специфического дорогостоящего оборудования, может служить тонкослойная хроматография. В данном случае ДНК гидролизуется эндонуклеазой рестрикции MspI с сайтом узнавания CCGG, после чего освободившиеся внутренние цитозины этого тетрануклеотида подвергаются радиоактивному мечению. После гидролиза ДНК до мононуклеотидов нуклеазой Р1 радиоактивно меченые цитозинмонофосфат и 5-метилцитозинмонофосфат разделяются на хроматографических пластинах и проводится замер интенсивности соответствующих пятен. К сожалению, такой упрощенный метод позволяет лишь грубо оценить соотношение цитозина и метилцитозина в геноме, поскольку анализируются только нуклеотиды, входящие в состав сайта узнавания рестриктазы MspI.  

Количественное определение цитозина, метилированного ДНК-метилтрансферазами in vitro.

Методы этой группы основаны на искусственном метилировании неметилированного цитозина в составе геномной ДНК с последующим количественным анализом эффективности реакции. В соответствии с оригинальной методикой, геномная ДНК предварительно обрабатывается бактериальной ДНК-метилтрансферазой SssI, использующей S-аденозилметионин в качестве донора метильных групп для метилирования интактных CpG-динуклеотидов. Реакция проводится в присутствии S-аденозилметионина, меченого тритием, после чего образец ДНК иммобилизуется на нитроцеллюлозной мембране. Эффективность включения радиоактивной метки определяется сцинтилляционным счетчиком и отражает количество неметилированных CpG-динуклеотидов в исходном образце ДНК. Несмотря на простоту исполнения, метод не лишен недостатков технического плана. Прежде всего, это недостаточная воспроизводимость результатов вследствие нестабильности как S-аденозилметионина, так и метилтрансферазы SssI. Другой проблемой является негомогенность растворов ДНК, приводящая к неточностям при замерах концентрации. Для повышения гомогенности препараты ДНК рекомендуется предварительно гидролизовать рестриктазами, сайты узнавания которых не содержат CpG-динуклеотидов.

Использование разных метилтрансфераз позволяет решать различные задачи в рамках определения полногеномного метилирования ДНК. Так, для определения количества гемиметилированных CpG-пар в ДНК из тканей в предраковом состоянии, разработана методика с применением человеческой рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы DNMT1, субстратом для которой, в отличие от SssI, является именно гемиметилированная ДНК. Изящный подход к изучению временных характеристик распространения общего деметилирования и накопления CpG-динуклеотидов, деметилированных на обеих цепях ДНК, в процессе озлокачествления, основан на параллельном применении метилтрансферазы DNMT1 и эндонуклеазы рестрикции HpaII, которая гидролизует исследуемый образец только по сайтам узнавания (CCGG), содержащим неметилированные CpG-динуклеотиды на обеих цепях ДНК.