Изошизомеры бактериальных эндонуклеаз, обладающие различной чувствительностью к 5-метилцитозину, широко используются для определения статуса метилирования цитозина в специфических сайтах. Как правило, один из ферментов, входящих в пару изошизомеров, нечувствителен к присутствию 5-метилцитозина, в то время как другой не расщепляет ДНК по сайту рестрикции, содержащему 5-метилцитозин (рис.2А). Часто используемой при анализе метилирования парой ферментов являются HpaII и MspI, распознающие сайт CCGG, при этом HpaII не узнаёт последовательность, содержащую метилированный цитозин.

Методы, основанные на использовании метилчувствительных рестриктаз, имеют ограничение, обусловленное тем, что они позволяют охарактеризовать только CpG-пары, входящие в сайт рестрикции определенного фермента. К тому же, методы этой группы могут давать ложноположительные результаты вследствие неполного гидролиза ДНК, что может повлечь за собой неверные выводы о характере метилирования изучаемой последовательности.

Бисульфитный анализ.

При обработке геномной ДНК бисульфитом натрия происходит дезаминирование неметилированного цитозина с образованием урацила, при этом 5-метилцитозин дезаминированию не подвергается. В результате подобной трансформации двухцепочечная спираль ДНК превращается в две некомплементарные одноцепочечные нити (рис.2Б). Бисульфитиндуцированные различия последовательностей в образцах ДНК с разным содержанием 5-метилцитозина позволяют в дальнейшем дифференцировать метилированную и неметилированную ДНК. Обработанная бисульфитом ДНК может быть напрямую использована для ПЦР-анализа, в котором урациловые и тиминовые остатки будут амплифицироваться как тимин и только 5-метилцитозиновые остатки амплифицируются как цитозин.

По сравнению с методами, основанными на применении метилчувствительных рестриктаз,  исследования, основанные на анализе ДНК, обработанной бисульфитом, имеют ряд преимуществ. Наиболее важным из них является возможность определения статуса метилирования фактически любого CpG-динуклеотида в геноме. При этом существенное ограничение метода заключается в высокой вероятности артефактов реакции, которые могут повлиять на его надежность. Наиболее часто встречающимся артефактом является неполная конверсия цитозина в урацил. Поскольку бисульфит взаимодействует только с неспаренным цитозином, очевидным объяснением неполного превращения может служить недостаточная денатурация ДНК или ее ренатурация в процессе обработки бисульфитом. Для решения подобных проблем были разработаны несколько модификаций первоначального протокола. Предотвращение обратного отжига цепей достигается помещением образцов геномной ДНК в блоки легкоплавкой агарозы, или проведением реакции с бисульфитом в термоциклере с периодическим нагреванием реакционной смеси до 95^оС, либо добавлением в реакционную смесь мочевины в высокой концентрации.

При планировании эксперимента и интерпретации результатов должны учитываться и другие возможные артефакты бисульфтиной реакции. Во-первых, 2-5% метилированных молекул цитозина могут превращаться в тимин в ходе стандартной ночной инкубации. Как предполагается, эта конверсия происходит случайно и становится очевидной только при анализе индивидуальных молекул ДНК. Во-вторых, обработка бисульфитом может приводить к деградации ДНК вследствие частичной депуринизации. Длительная инкубация может привести к обширным повреждениям анализируемой последовательности, что в дальнейшем затруднит амплификацию. В ряде работ было показано, что инкубации с бисульфитом в течение 4 часов достаточно для полного превращения цитозина. В-третьих, при проведении ПЦР с обработанной бисульфитом ДНК, для некоторых пар праймеров показана неодинаково эффективная амплификация метилированной и неметилированной последовательностей. В настоящее время не существует протокола, позволяющего избежать подобных погрешностей ПЦР, хотя одним из путей решения данной проблемы может стать калибровка реакции по образцам с известным соотношением метилированной и неметилированной ДНК.   

Методы, используемые для ген-специфического анализа метилирования.

 Для анализа статуса метилирования специфических генов разработан широкий спектр методов. Методы, основанные на использовании метилчувствительных рестриктаз, как правило, применяются в комбинации с гибридизацией по Саузерну или ПЦР. Анализ метилирования на основе бисульфитного метода преимущественно проводится с использованием технологий, основанных на амплификации ДНК в ПЦР. Некоторые из этих методов были специально разработаны для детекции однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций, приводящих к развитию заболеваний, но в дальнейшем были адаптированы для выявления различий между метилированными и неметилированными аллелями в обработанной бисульфитом ДНК.