Продукт расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции можно исследовать с помощью традиционной блот-гибридизации по Саузерну, если анализу подвергается достаточно большое количество образца (около 10мкг). Продукты гидролиза фракционируют путем электрофореза в агарозном геле, переносят на нейлоновую мембрану и гибридизуют с радиоактивной пробой, представляющей собой фрагмент исследуемого гена. В случае метилирования изучаемых сайтов, фрагменты, полученные в результате обработки ДНК метилчувствительным изошизомером, будут отличаться по размеру от фрагментов, полученных с использованием неметилчувствительного фермента. Фракция негидролизованной ДНК, пропорциональная уровню метилирования исследуемого локуса, может быть оценена количественно путем анализа изображения, однако чувствительность описанного метода невысока.

Использование ПЦР для детекции продуктов расщепления ДНК позволяет значительно увеличить чувствительность анализа продуктов рестрикции. В случае если праймеры фланкируют сайт рестрикции, исследуемый фрагмент амплифицируется только при отсутствии расщепления ДНК по этому сайту. Чтобы определить количество метилированных молекул в тотальной ДНК, необходимо провести амплификацию в полуколичественном формате, например, с применением флуоресцентно меченых праймеров.

 Для предупреждения ложноположительных результатов, возникающих из-за неполного гидролиза, необходимо предпринимать ряд предосторожностей. Поскольку доступность ДНК для рестрикции обычно уменьшается вследствие наличия примесей, наилучшим способом обеспечения полноты гидролиза является тщательная очистка ДНК с применением протеиназы К. Возможно использование для контроля параллельного гидролиза ДНК двумя изошизомерами, однако следует учитывать, что различные ферменты могут инактивироваться примесями неодинаково. Включения контрольного фрагмента ДНК, заведомо крайне редко метилируемого в геноме, в такую реакцию обычно достаточно для контроля полноты расщепления ДНК (рис.3).

Метилчувствительная ПЦР идеально подходит для анализа метилирования индивидуальных генов. В то же время многие ДНК-диагностические процедуры предполагают исследование нескольких генов (локусов) в рамках одного теста. Решение этой задачи при помощи традиционного подхода проведения многолокусной ПЦР в одной пробирке применительно к анализу метилирования наталкивается на препятствие в виде особенностей первичной структуры CpG-островков. От достаточно индивидуальных кодирующих областей генов CpG-островки отличаются сниженной информативностью нуклеотидных последовательностей, что не позволяет осуществлять дизайн удовлетворительно уникальных праймеров для ПЦР-анализа. Как следствие, проведение многолокусной метилчувствительной ПЦР чревато образованием неспецифических продуктов реакции, затрудняющих анализ и интерпретацию результатов диагностики (рис.4).

Заметное повышение специфичности анализа достигается при использовании для анализа метилирования многих локусов технологии ДНК-микрочипов. Положительный эффект обеспечивается дополнительным этапом анализа – гибридизацией ПЦР-продуктов со специфичными ДНК-зондами. Однако, несмотря на то, что консенсусной («коровой») последовательности CpG-островка как такового не существует, степень гомологии между различными CpG-островками значительно выше, чем между различными индивидуальными кодирующими последовательностями ДНК. Такая пониженная информативность последовательностей CpG-островков в случае применения ДНК-микрочипов создает технические проблемы, вызванные перекрестной гибридизацией зондов. В целом, любые технологии ДНК-анализа метилирования ДНК, включающие в себя этап гибридизации (будь то отжиг праймеров или гибридизация зондов на последовательностях CpG-островков), исключительно требовательны к дизайну многолокусных реакций, а их специфичность прогрессивно снижается по мере увеличения количества локусов, анализируемых в рамках одного теста.

Один из подходов, позволяющих избежать этапа гибридизации ДНК в процессе анализа метилирования, - адаптер-опосредованная ПЦР фрагментов ДНК, полученных в результате гидролиза метилчувствительными рестриктазами. Такой подход активно эксплуатировался в методиках, направленных на поиск дифференциально метилированных локусов геномов. Секвенирование полученных таким образом амплификатов приводило к идентификации участков ДНК, аномально метилированных/деметилированных, например, в образцах злокачественных опухолей. Секвенирование генома человека и развитие методов биоинформатики позволяет использовать взаимообратный алгоритм для анализа метилирования большого количества известных локусов в одной пробирке, удачно избегая при этом проблем, связанных с перекрестной гибридизацией С,G-обогащенных последовательностей ДНК. Примером может служить использование усовершенствованной нами технологии амплификации интерметилированных сайтов (АИМС) для определения статуса метилирования десятков локусов в рамках одного исследования.

Вкратце, суть метода АИМС заключается в следующем. На первом этапе геномную ДНК обрабатывают метилчувствительной рестриктазой SmаI, которая формирует фрагменты с «тупыми» концами. Метилированные сайты узнавания, оставшиеся интактными, затем расщепляются нечувствительной к метилированию рестриктазой ХmаI, формирующей фрагменты с «липкими» концами. Последние способны взаимодействовать в реакции лигирования с адаптерами и амплифицироваться в ходе полимеразной цепной реакции. ПЦР всей совокупности лигированных фрагментов проводят с радиоактивно мечеными праймерами, комплементарными адаптеру. В результате реакции нарабатывается значительное количество фрагментов ДНК различной длины, визуализацию которых проводят методом радиоавтографии (рис.5).

Нами радиоактивный метод детекции заменен разделением флуоресцентно меченых продуктов АИМС капиллярным электрофорезом. Таким образом, результаты АИМС фактически переходят в плоскость цифровой информации, доступной для компьютерного анализа без предварительной оцифровки сигнала.

Для предсказания всех возможных вариантов продуктов АИМС разработана компьютерная программа AIMS in silico, позволяющая осуществлять обоснованный дизайн экспериментов с учетом целей исследований и доступности оборудования и анализировать результаты с учетом геномной локализации дифференциально метилированных фрагментов ДНК. Обработка данных капиллярного электрофореза, корреляция различных электрофореграмм и их дифференциация, отражающая позиции аномально метилированных/деметилированных фрагментов ДНК обеспечивает компьютерная программа PeakPick (рис.6).

Анализ продуктов АИМС на электрофореграммах проходит относительно двух референсных систем. Первая представляет собой стандартный набор фрагментов ДНК маркера молекулярного веса, традиционно используемый при фрагментном анализе ДНК капиллярным электрофорезом. Второй референс представлен полным набором всех продуктов АИМС, получаемых с тотально метилированной геномной ДНК («полная репрезентация» АИМС). Первая референсная система обеспечивает позиционирование продуктов реакции по длинам в нуклеотидах, вторая позволяет соотнести аномально метилированные фрагменты ДНК, выявленные в анализируемом образце, с конкретными, заранее определенными локусами генома.

На сегодняшний день адаптер-опосредованная ПЦР, в частности, в формате АИМС, - единственная мультилокусная система метилчувствительного анализа ДНК, полностью свободная от проблем, связанных с перекрестной гибридизацией C,G-обогащенных участков ДНК с пониженной информативностью нуклеотидных последовательностей.