Глава 4. Методы анализа метилирования ДНК

Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б.

Метилирование геномной ДНК в целом, и, в особенности, регуляторных участков генома – одна из важнейших характеристик аппарата наследственности. Аномальное метилирование сопряжено с рядом серьёзных патологических состояний, от врождённых пороков развития до онкологических заболеваний. Всплеск интереса к изучению эпигенетической регуляции функционирования геномов стимулировал разработку десятков методов, позволяющих оценивать метилирование как тотальной ДНК, так и отдельных её участков. В этой главе представлены основные принципы и конкретные методики изучения метилирования ДНК, проведён сравнительный анализ методов и очерчены области их возможного практического применения. Каждый метод характеризуется определенными особенностями, что позволяет подобрать технологию, оптимальную для решения конкретной задачи в изучении метилирования ДНК. Все методы можно разделить на группы на основании характера получаемой информации: первая группа включает методы определения уровней метилирования геномов в целом, вторая – методы исследования статуса метилирования специфических последовательностей, третья предполагает полногеномный скрининг метилирования CpG-динуклеотидов, четвертая позволяет идентифицировать новые «горячие точки метилирования», т.е. области ДНК, аномально метилированные в патологически измененной ткани (рис 1). К диагностическим относятся в основном первые две группы методов; они и будут наиболее подробно описаны ниже.

Методы исследования уровней метилирования геномов

Эта группа методов подразумевает определение относительного содержания общего цитозина и метилцитозина в составе геномной ДНК. В основе современных подходов лежат: полный ферментативный гидролиз ДНК с последующим высокоразрешающим разделением продуктов для определения содержания нуклеотидов; химическая (обработка бисульфитом натрия и хлорацетальдегидом) или биохимическая (использование ДНК-метилтрансфераз) модификации цитозина и 5-метилцитозина; либо использование специфических антител к 5-метилцитозину.

Химическая модификация 5-метилцитозина хлорацетальдегидом.

Метод основан на измерении флуоресценции производного 5-метилцитозина, полученного в результате ряда химических модификаций исходного образца. На первом этапе ДНК обрабатывается бисульфитом натрия, конвертирующим молекулы цитозина в урацил. Молекулы 5-метилцитозина устойчивы к действию бисульфита натрия и остаются интактными. Модифицированная таким образом ДНК подвергается депуринизации в кислой среде, и пурины удаляются преципитацией нитратом серебра или очисткой на хроматографической колонке. Последующая инкубация образца с хлорацетальдегидом приводит к образованию производного 5-метилцитозина, обладающего выраженной флуоресценцией, которая соответствует содержанию метилированного цитозина в исследуемом образце и определяется количественно с помощью флуориметра. Описанная технология является привлекательной альтернативой описанным выше вариантам биохимической модификации ДНК в силу своей экономичности, удовлетворительной воспроизводимости результатов и отсутствия необходимости в применении радиоизотопов.

Иммунохимический анализ.

Для определения общего уровня метилирования иммунохимическим методом геномная ДНК подвергается денатурации, иммобилизуется на нитроцеллюлозной мембране и инкубируется в присутствии моноклональных антител к 5-метилцитозину. Последующая повторная инкубация с флюоресцеин-коньюгированными антителами и флуоресцентное сканирование позволяют определить степень метилирования образца, которая пропорциональна интенсивности окраски.

Для картирования паттернов метилирования на хромосомах в отдельных клетках применим метод флуоресцентной микроскопии. Хромосомные области с особенно высоким содержанием 5-метилцитозина, такие как прицентромерные регионы, обладают большей флуоресценцией. Необходимым условием количественного определения метилирования ДНК иммунохимическим методом является неспаренное состояние 5-метилцитозина, что достигается депуринизацией ДНК путем ее обработки серной кислотой.

Основные принципы ген-специфического анализа метилирования.

В то время как изучение глобального метилирования ДНК может быть проведено на нативных препаратах ДНК, современные методы анализа ген-специфических паттернов метилирования требуют осуществления первоначальной амплификации исследуемой последовательности. Поскольку ДНК-полимераза в ходе синтеза ДНК не различает цитозин и 5-метилцитозин, в процессе полимеразной цепной реакции и клонирования информация о метилировании утрачивается. Ряд ферментов и химических соединений, таких как, метилчувствительные рестриктазы, бисульфит (HSO₃^-), гидразин (N₂H₄), перманганат (MnO₄^-), могут быть использованы для модификации оснований, что позволяет различить цитозин и 5-метилцитозин в ходе последующего анализа. Все методы ген-специфического анализа метилирования, описанные ниже, основаны на применении либо метилчувствительных рестриктаз, либо бисульфита. Методы, основанные на обработке гидразином и перманганатом используются достаточно редко в силу низкой специфичности и разрешающей способности.

Бисульфитный анализ.

При обработке геномной ДНК бисульфитом натрия происходит дезаминирование неметилированного цитозина с образованием урацила, при этом 5-метилцитозин дезаминированию не подвергается. В результате подобной трансформации двухцепочечная спираль ДНК превращается в две некомплементарные одноцепочечные нити (рис.2Б). Бисульфитиндуцированные различия последовательностей в образцах ДНК с разным содержанием 5-метилцитозина позволяют в дальнейшем дифференцировать метилированную и неметилированную ДНК. Обработанная бисульфитом ДНК может быть напрямую использована для ПЦР-анализа, в котором урациловые и тиминовые остатки будут амплифицироваться как тимин и только 5-метилцитозиновые остатки амплифицируются как цитозин.

По сравнению с методами, основанными на применении метилчувствительных рестриктаз,  исследования, основанные на анализе ДНК, обработанной бисульфитом, имеют ряд преимуществ. Наиболее важным из них является возможность определения статуса метилирования фактически любого CpG-динуклеотида в геноме. При этом существенное ограничение метода заключается в высокой вероятности артефактов реакции, которые могут повлиять на его надежность. Наиболее часто встречающимся артефактом является неполная конверсия цитозина в урацил. Поскольку бисульфит взаимодействует только с неспаренным цитозином, очевидным объяснением неполного превращения может служить недостаточная денатурация ДНК или ее ренатурация в процессе обработки бисульфитом. Для решения подобных проблем были разработаны несколько модификаций первоначального протокола. Предотвращение обратного отжига цепей достигается помещением образцов геномной ДНК в блоки легкоплавкой агарозы, или проведением реакции с бисульфитом в термоциклере с периодическим нагреванием реакционной смеси до 95^оС, либо добавлением в реакционную смесь мочевины в высокой концентрации.

При планировании эксперимента и интерпретации результатов должны учитываться и другие возможные артефакты бисульфтиной реакции. Во-первых, 2-5% метилированных молекул цитозина могут превращаться в тимин в ходе стандартной ночной инкубации. Как предполагается, эта конверсия происходит случайно и становится очевидной только при анализе индивидуальных молекул ДНК. Во-вторых, обработка бисульфитом может приводить к деградации ДНК вследствие частичной депуринизации. Длительная инкубация может привести к обширным повреждениям анализируемой последовательности, что в дальнейшем затруднит амплификацию. В ряде работ было показано, что инкубации с бисульфитом в течение 4 часов достаточно для полного превращения цитозина. В-третьих, при проведении ПЦР с обработанной бисульфитом ДНК, для некоторых пар праймеров показана неодинаково эффективная амплификация метилированной и неметилированной последовательностей. В настоящее время не существует протокола, позволяющего избежать подобных погрешностей ПЦР, хотя одним из путей решения данной проблемы может стать калибровка реакции по образцам с известным соотношением метилированной и неметилированной ДНК.   

Методы, используемые для ген-специфического анализа метилирования.

 Для анализа статуса метилирования специфических генов разработан широкий спектр методов. Методы, основанные на использовании метилчувствительных рестриктаз, как правило, применяются в комбинации с гибридизацией по Саузерну или ПЦР. Анализ метилирования на основе бисульфитного метода преимущественно проводится с использованием технологий, основанных на амплификации ДНК в ПЦР. Некоторые из этих методов были специально разработаны для детекции однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций, приводящих к развитию заболеваний, но в дальнейшем были адаптированы для выявления различий между метилированными и неметилированными аллелями в обработанной бисульфитом ДНК.

Комбинированный бисульфит-рестрикционный анализ ( COBRA).

Метод основан на использовании различий в распознавании ферментом сайта рестрикции в метилированной и неметилированной ДНК, возникающих после бисульфитной модификации (см. рис.10, В). Обработка ДНК бисульфитом может приводить как метилзависимому появлению новых сайтов рестрикции, так и к метилзависимому исчезновению изначально существующих сайтов. Анализируемая последовательность, после обработки бисульфитом, подвергается амплификации с использованием недискриминирующих праймеров, при этом доля молекул, в которых появляется новый сайт рестрикции, содержащий CpG, или сохраняется ранее существующий, отражает уровень метилирования по этому сайту в анализируемой геномной ДНК. Неполная конверсия ДНК и артефакты ПЦР при использовании COBRA, могут приводить к снижению надежности метода. Дополнительным недостатком является ограниченное количество возможных сайтов рестрикции в пределах анализируемого участка, что не позволяет оценить статус метилирования всех CpG-пар, содержащихся в исследуемой последовательности ДНК. 

Глава 4. Методы анализа метилирования ДНК

Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б.

Метилирование геномной ДНК в целом, и, в особенности, регуляторных участков генома – одна из важнейших характеристик аппарата наследственности. Аномальное метилирование сопряжено с рядом серьёзных патологических состояний, от врождённых пороков развития до онкологических заболеваний. Всплеск интереса к изучению эпигенетической регуляции функционирования геномов стимулировал разработку десятков методов, позволяющих оценивать метилирование как тотальной ДНК, так и отдельных её участков. В этой главе представлены основные принципы и конкретные методики изучения метилирования ДНК, проведён сравнительный анализ методов и очерчены области их возможного практического применения. Каждый метод характеризуется определенными особенностями, что позволяет подобрать технологию, оптимальную для решения конкретной задачи в изучении метилирования ДНК. Все методы можно разделить на группы на основании характера получаемой информации: первая группа включает методы определения уровней метилирования геномов в целом, вторая – методы исследования статуса метилирования специфических последовательностей, третья предполагает полногеномный скрининг метилирования CpG-динуклеотидов, четвертая позволяет идентифицировать новые «горячие точки метилирования», т.е. области ДНК, аномально метилированные в патологически измененной ткани (рис 1). К диагностическим относятся в основном первые две группы методов; они и будут наиболее подробно описаны ниже.

Методы исследования уровней метилирования геномов

Эта группа методов подразумевает определение относительного содержания общего цитозина и метилцитозина в составе геномной ДНК. В основе современных подходов лежат: полный ферментативный гидролиз ДНК с последующим высокоразрешающим разделением продуктов для определения содержания нуклеотидов; химическая (обработка бисульфитом натрия и хлорацетальдегидом) или биохимическая (использование ДНК-метилтрансфераз) модификации цитозина и 5-метилцитозина; либо использование специфических антител к 5-метилцитозину.