Для получения посевного материала используют исходную музейную культуру продуцента, которая поступает в заводскую лабораторию из научно-исследовательского института или с посевной станции. Как правило, посевной материал, содержащий молодые, растущие клетки микроорганизмов из начальной стадии спорообразования (споры, конидии), поступает в пробирках на скошенных агаризованных средах, в виде чистых культур в ампулах. Каждая производственная культура имеет паспорт, в котором указаны продуцент и его коллекционный номер, серия и дата изготовления, средняя активность серии и срок годности. В паспорте представлена характеристика среды для выращивания и хранения культуры. Полученный посевной материал подвергают тщательному микробиологическому и биохимическому контролю, так как от его активности и чистоты зависит дальнейший производственный цикл.

В зависимости от вида продуцента, его физиолого-биохимических особенностей приготовление посевного материала (до стадии производственной ферментации) проходит в несколько этапов: исходная культура > скошенная агаризованная среда > выращивание на качалке в колбах на жидкой питательной среде (одна-две стадии) > посевные аппараты (одна - несколько стадий) > стадия производственной ферментации.

Исходную культуру при оптимальных температурах выращивают в пробирках на скошенной агаризованной питательной среде. Для микроскопических грибов, актиномицетов выращивание длится до наступления обильного (72-120 ч) спорообразования, для бактериальных культур наиболее благоприятный возраст устанавливают экспериментально.

Выращенную культуру (1-5% к объему) с поверхности скошенной агаризованной среды стерильно смывают водой и переносят в колбы Эрленмейера на 750 мл, содержащие 50-100 мл жидкой питательной среды. Засеянные колбы выращивают на качалке (120-240 об/мин) при температуре 28-30 °С в течение 18-36 ч. Выращивание на качалке при перемешивании (встряхивании) увеличивает скорость роста культуры, что связано с интенсификацией массообмена. Эту стадию выращивания контролируют по морфологическим показателям микроорганизма. Наилучшие результаты дает культура, которая находится в стадии физиологической зрелости в конце логарифмической фазы роста. Для повышения титра клеток в инокуляте и увеличения количества посевного материала культуру выращивают в несколько стадий.

Готовую культуру стерильно переносят в посевной аппарат (малый инокулятор) с предварительно простерилизованной питательной средой. Посевной аппарат оснащен мешалкой, аэрирующим устройством, а также контрольно-измерительной аппаратурой для регулирования температуры, pH среды, уровня пенообразования и т. д. Вместимость посевного аппарата может быть различной (0,1-10 м3), а количество стадий выращивания определяется объемом производства и нормой расхода посевного материала для каждого продуцента.

Ниже приведены характеристики типовых аппаратов с механическим перемешиванием, используемых в качестве посевных.

Большое значение имеет качество посевного материала. Перенос микробных клеток из одной стадии выращивания в другую желательно осуществлять тогда, когда рост популяции происходит с максимальной скоростью, т. е. в фазе так называемого экспоненциального роста. Коэффициент перехода от одного аппарата к другому будет зависеть от конкретных условий выращивания каждого микроорганизма. Если этот переход осуществляется в фазе экспоненциального роста, то типичным коэффициентом перехода по отношению к объему последующей используемой аппаратуры для практических расчетов следует принимать величину, равную 10.

20. Классификация и характеристика способов и процессов культивирования микроорганизмов, продуцентов БАВ

Классификация способов и процессов культивирования микроорганизмов

Характеризуя микроорганизмы, следует отметить 4 разновидности роста, типичные для бактерий, дрожжей, микроскопических грибов и вирусов.??Бактерии размножаются непосредственно делением клеток, когда в процессе роста клетка удваивает свою массу и количество всех составляющих ее компонентов.

Основные положения обратимого равновесного автокаталитического роста популяции микроорганизмов можно сформулировать следующим образом:

· размножение микроорганизмов определяется протеканием двух противоположных процессов -- образования и гибели клеток, т.е. синтеза и деструкции;

· скорость образования микроорганизмов (синтеза биомассы) пропорциональна все увеличивающейся в процессе их культивирования концентрации X и уменьшается с уменьшением концентрации лимитирующего субстрата S;

· скорость отмирания клеток (деструкции биомассы) пропорциональна квадрату их концентрации;

· концентрация питательных веществ, необходимых для размножения микроорганизмов, определяется содержанием в питательной среде одного или нескольких лимитирующих компонентов;

· продукты лизиса погибших клеток (Sx) в кинетическом отношении (количественно, но не качественно) эквивалентны исходному субстрату.

Классификация способов и систем культивирования микроорганизмов

Тема:Биосинтез биологически активных веществ микроорганизмами 

Характеризуя микроорганизмы, следует отметить 4 разновидности роста, типичные для бактерий, дрожжей, микроскопических грибов и вирусов.

Бактерии размножаются непосредственно делением клеток, когда в процессе роста клетка удваивает свою массу и количество всех составляющих ее компонентов. Перед разделением формируются оболочка и мембрана клетки, и родительская клетка делится на две идентичные дочерние клетки, каждая из которых растет точно так же, как исходная клетка.

Дрожжи относятся к одноклеточным грибам. Обычно делятся почкованием, которое включает в себя образование почки на материнской клетке. Она растет до тех пор, пока не достигнет размера материнской клетки. Затем новая клетка отделяется от нее. Исключение составляют дрожжи, которые растут за счет разделения клеток или благодаря образованию гифов. В отличие от деления бактерий в данном случае можно различать материнские и дочерние клетки. Растущая популяция дрожжей в связи с этим и в отличие от бактерий характеризуется непрерывно изменяющимся распределением клеток по возрасту.

Мицелиальные грибы растут путем удлинения и разветвления грибных цепочек. Рост идет от конца мицелия («вершинный рост») путем образования «мостиков» между клетками. В зависимости от физико-химических условий мицелий может быть длинным и объемным, коротким и сильно разветвленным и представлять собой смесь указанных форм.

Микробные вирусы, или фаги, не подчиняются законам обычного роста. Они требуют наличия организма — «хозяина», который может относиться к бактериям, дрожжам, микроскопическим грибам и клеткам высших форм.

Основные положения обратимого равновесного автокаталитического роста популяции микроорганизмов можно сформулировать следующим образом:

размножение микроорганизмов определяется протеканием двух противоположных процессов — образования и гибели клеток, т.е. синтеза и деструкции;

скорость образования микроорганизмов (синтеза биомассы) пропорциональна все увеличивающейся в процессе их культивирования концентрации X и уменьшается с уменьшением концентрации лимитирующего субстрата S;

скорость отмирания клеток (деструкции биомассы) пропорциональна квадрату их концентрации;

концентрация питательных веществ, необходимых для размножения микроорганизмов, определяется содержанием в питательной среде одного или нескольких лимитирующих компонентов;

продукты лизиса погибших клеток (Sx) в кинетическом отношении (количественно, но не качественно) эквивалентны исходному субстрату;

процесс размножения в условиях периодического способа культивирования заканчивается установлением равновесия, при котором скорости синтеза и деструкции биомассы равны, а поэтому концентрации микроорганизмов и субстрата не меняются во времени.

Компоненты питательной среды по характеру их превращения в процессе размножения и влиянию на кинетику роста популяции можно разделить на две группы:

вещества, которые при включении в структуру клеток и последующем лизисе погибших клеток не претерпевают изменений, и не исключают возможность их повторного использования в метаболическом обмене при образовании новых микроорганизмов;

вещества, которые в процессе синтеза биомассы претерпевают такие превращения, что их повторное использование микроорганизмами в качестве субстрата невозможно.

20. Классификация и характеристика способов и процессов культивирования микроорганизмов, продуцентов БАВ

Методы культивирования микроорганизмов

Для культивирования микроорганизмов применяют поверхностный или глубинный способы.

При поверхностном способемикроорганизмы выращивают чаще всего на твердых (рыхлых, увлажненных до 30-80%, например, отрубях) или жидких (реже) питательных средах. В первом случае рост идет на поверхности твердых частиц и в порах, заполненных водой или воздухом, перемешивание отсутствует. Если среда жидкая, то кюветы с ней помещают в вентилируемые воздухом камеры. Культура микроорганизмов потребляет кислород непосредственно из газовой фазы ^__ воздуха.

Поверхностным способом выращивают аэробные микроорганизмы (например, плесневые грибы).

Глубинный способ характеризуется тем, что микроорганизмы развиваются во всей толще жидкой питательной среды в специальных аппаратах (ферментаторах). Метод применим как для выращивания аэробных (аэрация среды обязательна), так и анаэробных микроорганизмов. Во всех случаях проводят перемешивание питательной среды мешалками.

Культивирование глубинным способом может быть периодическим или непрерывным.

Сущность периодического способа заключается в том, что весь объем питательной среды загружают в аппарат сразу, добавляют культуру микроорганизмов и при оптимальных условиях ведут процесс до тех пор, пока не накопится нужное количество биомассы (например, при выращивании чистой культуры дрожжей, бактерий; в производстве хлебопекарных дрожжей) или продуктов жизнедеятельности микроорганизмов — метаболитов (например, спирта).

При периодическом культивировании изменяется состав среды (уменьшается концентрация питательных веществ и увеличивается количество метаболитов); скорость роста; морфологические и физиологические свойства культуры. К тому же возникают технологические трудности ^__ циклический ход операций, сменные технологические режимы, что затрудняет контроль и автоматизацию процесса. Эффективность данного способа низкая (70% времени приходится на непроизводительные стадии ^__ лаг-фазу и фазу отмирания).

Эти недостатки устраняются применением непрерывных способов культивирования.

Данные методы характеризуются непрерывным поступлением в ферментатор свежей питательной среды и непрерывным оттоком готовой культуральной жидкости вместе с клетками введенной культуры микроорганизма.

При непрерывном культивировании можно задержать культуру на логарифмической стадии роста (или любой другой), установки могут длительно работать без остановки на дезинфекцию, время производства сокращается, процесс легче автоматизировать.

Различают гомогенно- и гетерогенно-непрерывное культивирование.

Гомогенно-непрерывный способ отличается интенсивным перемешиванием содержимого в ферментаторе, благодаря этому все параметры в любой точке аппарата и в вытекающей из него среде одинаковы.

Гетерогенно-непрерывный способ характеризуется незначительным перемешиванием среды или полным его отсутствием. При этом состав среды в любой точке аппарата различен, однако показатели системы в целом не изменяются во времени.

Гомогенные методы культивирования чаще всего используют для накопления биомассы микроорганизмов, гетерогенные __ для проведения собственно процесса брожения.

Все непрерывные процессы осуществляют в одном аппарате или в батарее, соединенных последовательно между собой ферментаторов.