Если целевым продуктом является биомасса клеток, например, кормовые или пекарские дрожжи, необходимо их концентрирование (сгущение). При этом широко применяют флотацию, с помощью которой увеличивают концентрацию дрожжей в 4—6 раз. Основной движущей силой флотации являются всплывающие пузырьки газа, которые захватывают клетки и выносят их на поверхность. В результате над слоем отработанной культуральной жидкости образуется пенный слой, в котором сконцентрированы дрожжи. Процесс проводят в специально предназначенных для этой цели емкостных аппаратах — флотаторах, в которые нагнетают воздух и, в зависимости от их конструкции, диспергируют его через барботер или эжектор, пену гасят в специальной части аппарата с помощью пеногасителя и выводят сконцентрированную суспензию дрожжей.

Для последующего концентрирования дрожжей широко приме­няют сепарирование, например, с помощью сепаратора — сгустителя, непрерывного действия тарельчатого типа СОС-501К-3. Для сгущения суспензии дрожжей от 20—30 г/л до 550—600 г/л необходимо последовательное сепарирование в 2—3 ступени.

Методы извлечения целевых продуктов из клеток зависят от свойств изолируемых веществ. Полиеновые антибиотики, например; экстрагируют органическими растворителями из нативных клеток, тогда как эндоферменты получают из разрушенных (дезинтегрированных) клеток. На рис. 5.2 представлена схема процесса выделения L-аспарагиназы. Клетки отделяют на дисковой центрифуге (позиция 4), позволяющей концентрировать от 6 г/л до 120 г/л по массе сухих веществ. Разрушение клеток проводят в. гомогенизаторе (позиция 5) при двукратном пропускании высвобождается до 97% фермента. От остатков клеток освобождаются после добавления этанола (позиция 9) до 30% концентрации с последующей фильтрацией на ротационном фильтре (позиции 10). Затем фермент осаждают метанолом при его концентрации в маточнике 50% (позиция 11), фильтруют (позиция12), растворяют вводе и переосаждают (позиция 13) при концентрации метанола 60%. Осадок центрифугируют (позиция 12), снова растворяют в воде (позиция 14) и концентрируют ультрафильтрацией (позиция 16), затем выделяют с помощью-сефадекса ДЕАЕ-А50 (позиция 19), осаждают этанолом (0,6 объема) при рН 5,0 (позиция 27) и собирают в корзинчатой центрифуге (позиция 28). Осадок еще раз растворяют.в воде (позиция 29), стерилизуют фильтрацией через мемб­рану (позиция 30), разливают (позиция 32) и подвергают сублимационной сушке (позиция 34).

Рисунок 5.2 – Схема процесса выделения L-аспарагиназы: 1,5,17 — промежуточные емкости, 2, 6,15, 18, 26—-насосы, 3 — теплообменник, 4 — дисковая центрифуга, 7 — аппарат для получения суспензии микробных клеток, 8 — гомогенизатор, 9 — аппарат для спиртового осаждения остатков клеток и белка, 10— ротационный фильтр, 11 — аппарат для осаждения фермента метанолом, 12 — центрифуга, 13 — аппарат для переосаждения фермента, 14 — аппарат для растворения фермента, 16 — аппарат для ультрафильтрации, 19 — колонка с сефадексом, 20, 21 — емкости для буферных растворов, 22, 23 — насосы, для подачи буферных растворов, 24, 25 — емкости для сбора фракций, 31 — аппарат для осаждения фермента, 28 — центрифуга, 29 — аппарат для переосаждения, 30 — стерилизующая мембрана, 31 — осадитель, 32 - кювета, 33 - фасовочное устройство, 34 — сублимационная сушилка.

Выделение большей части продуктов микробного синтеза из культуральной жидкости начинают при их содержании около 1,5%. Чтобы иметь возможность выделить вещество, используя осажде­ние, кристаллизацию или высушивание, необходимо оперировать с растворами, содержащими 15—20% целевого продукта. Вот почему приходится применять разномасштабное оборудование по ходу процесса: вначале необходимы емкости в несколько десятков м3, высокопроизводительное оборудование непрерывного или полунепрерывного действия, а завершают процесс небольшими аппаратами вместимостью порядка нескольких сотен и даже десятков литров с периодической загрузкой и выгрузкой, или лабораторное оборудование.

Технологические показатели фильтрации культуральных жидкостей определяются свойствами их как дисперсных систем. Клетки микробов-продуцентов, например, грибов чаще всего образуют микроколонии различной плотности размером 16—600мкм. Фильтрационные свойства жидкости обусловлены размерами отдельных гиф, типом микроколоний, характером роста мицелия. Эти факторы зависят от вида и штамма биообъекта, условий его культивирования.

Пенициллы и аспергиллы образуют легко фильтруемую био­массу, поэтому для получения нативного раствора в этом случае применяют барабанные вакуум-фильтры— аппарат непрерывного действия с фильтрующим основанием, расположенным на наружной цилиндрической поверхности горизонтального вращающегося барабана, частично погруженного в суспензию.

Культуральные жидкости после ферментации проактиномицетов представляют собой густые суспензии с относительной вязко­стью 50—1000и с высоким содержанием твердой фазы. Они практически не расслаиваются при стоянии. Характерной особенностью и других бактериальных суспензий является изменчивость их фильтрационных свойств как во времени, так и от одной операции до другой.

Необходимо также отметить, что образуемые осадки заметно сжимаемы (показатель сжимаемости 0,9), значит процесс фильтрации не может быть интенсифицирован повышением разности давления из-за соответственно возрастающего удельного сопротивления осадка. Такие суспензии без предварительной обработки культуральной жидкости отфильтровать практически невозможно. Предварительную обработку культуральной жидкости проводят с целью максимального перевода конечного продукта в ту фазу, которой предполагают его выделить, а также для коагуляции коллоидных примесей и, следовательно, улучшения процесса фильтрации, для удаления или связывания в растворимые комплексы тех побочных веществ, которые затрудняют последующий процесс химической очистки. К тому же при коагуляции изменяется структура твердой фазы культуральной жидкости.

Применяют несколько видов коагуляции: неорганическими солевыми электролитами, органическими и неорганическими кис­ лотами, термической обработкой, добавлением веществ, образующих наполнители. Процесс образования хлопьевидного осадка наполнителя протекает с большой скоростью, осадок захватывает гифы мицелия и молекулы белка.

Процесс коагуляции улучшается при использовании комбинированных методов таких, как кислотная и тепловая, электролитная и тепловая коагуляции.

Эффективным методом коагуляции дисперсных систем является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами — флоккулянтами. При этом в отличие от обычной коагуляции, образуются флоккулы или осадки рыхлой структуры, что значительно улучшает процесс фильтрации.

Для получения нативного раствора из труднофильтруемых культуральных жидкостей после коагуляции применяют вакуумбарабанный фильтр с намывным слоем — аппарат полунепрерывного действия. Перед работой на фильтрующую поверхность ба­рабана намывают дренажный слой наполнителя. В качестве наполнителя используют суспензию порошков целлюлозы, перлита (это горная порода, кислое вулканическое стекло, в составе которого находится вода более 1%), древесной муки. Особенность работы такого фильтра (в отличие от вакуум-барабанного) состоит в том, что нож, предназначенный для съема осадка с барабана, имеет специальную микрометрическую подачу. С каждым оборотом барабана нож подается к центру, срезая нафильтрованный осадок вместе с тонким слоем дренажа, обновляя таким образом фильтрующую поверхность; поэтому скорость фильтрации не снижается. На рис. 5.3 представлена схема аппаратурного оформления процесса фильтрации культуральной жидкости на вакуум-барабанном фильтре с намывным слоем.

Рисунок 5.3 - Схема аппаратурного оформления процесса фильтрации на вакуум-барабанном фильтре с намывным слоем: Г — аппарат для суспензии вспомогательного материала, 2, 4,7 — насосы, 3 — коагулятор, 5 —вакуум-барабанный фильтр с намывным слоем, 6 — ресивер.

Названный выше перлит представляет собой стекловидную горную породу вулканического происхождения, в состав его входят окислы кремния, калия и кальция. Для получения вспомогательного вещества природный перлит нагревают до начала плавления (1000°С). Образуются небольшие бусинки неправильной формы, состоящие из очень большого числа полых ячеек. Для получения вспомогательного фильтрующего материала бусинки измельчаются. Получают порошок с пористостью 85—90% и объемной массой 500—1000кг/м3.

Экстракционный метод выделения целевого вещества из нативного раствора основан на различной растворимости разных химических форм этого вещества в воде и органическом растворителе, не смешивающимся с водой. Основной закон экстракции - закон распределения Нернста: в смеси двух жидкостей, нерастворимых или ограниченно растворимых одна в другой, образуются два слоя (или чистые компоненты, или растворы жидкостей). Если в такую систему добавить третье вещество, растворимое в обеих жидкостях, то после достижения равновесия этот третий компонент распределится между обоими слоями, образуя растворы различной концентрации и отношение концентраций в обоих слоях будет постоянным при данной температуре.

Коэффициент распределения — величина, определяемая опытным путем, показывает во сколько раз равновесная концентрация вещества в экстракте больше, чем в обработанном растворе.

Экстракция извлечение продукта из твердого (твердо-жидкофазная) или жидкого (жидко-жидкофазная) образца. К твердо-жидкофазной экстракции относится обливание образца водой с целью извлече­ния из него растворимых веществ, например солей металлов из руд, подвергну­тых бактериальной обработке, или растворимых продуктов из массы субстрата (соломы и т.д.) при твердофазном культивировании. Применяют органические растворители, например, при экстракции клеточной массы ацетоном, переводя­щим в раствор ряд липидных и белковых компонентов.

Жидко-жидкофазная экстракция - добавление органических растворите­лей для извлечения из культуральной жидкости антибиотиков, витаминов, каратиноидов, липидов, некоторых гидрофобных белков. Витамин В12 экстрагируют фенолом и его производными (крезол, другие алкилфенолы, галогениды). Исполь­зуют бензиловый спирт, особенно в щелочных условиях. Фосфолипиды извлека­ют путем экстракции хлороформом.

Полностью избежать нагревания, губительного для многих ценных ве­ществ, позволяют методы холодовой экстракции (криоэкстракции). Она как бы нивелирует различие между твердым субстратом и культуральной жидкостью, поскольку и то и другое находится в замороженном состоянии. Криоэкстракция осуществляется растворителями, кипящими при низких температурах и находя­щимися при комнатной температуре в газообразном состоянии. Криоэкстракция может использоваться в комбинации с криоконсервацией клеток. Урожай клеток длительное время хранится без потери свойств в условиях глубокого заморажи­вания.