Источником отдельных клеток являются клеточные суспензии в жидкой питательной среде, мацерация (мацерация - размягчаю; разъединение клеток в результате растворения межклеточного вещества) тканей растений, изолированные протопласты после восстановления ими клеточной стенки. Причем изолированные протопласты являются идеальными отдельными клетками.

Культивирование отдельных клеток позволяет получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость при выращивании клонового материала. Отдельные клетки важны для клоновой селекции мутантных, гибридных, трансформированных линий. Обычно в эти клетки вводят маркерные гены или создают маркерные признаки для обеспечения селективных условий отбора.

Мацерированные клетки ткани растения являются хорошей моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и отдельной клетке. Вместе с тем при культивировании этих клеток на среде, стимулирующей деление клеток, они дифференцируются и образуют колонии каллусных клеток. Для получения отдельных мацерированных клеток используют специальные мацерирующие ферментативные препараты.

Отдельные клетки также могут быть получены из суспензий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлуюориметра или путем последовательных разбавлений.

Индукция делений отдельных клеток возможна при применении очень богатой питательной среды, причем объем среды должен быть минимальным. Однако даже при соблюдении всех этих условий процент разделившихся клеток остается очень низким. Более эффективны методы «кормящего слоя» или «ткани-няньки». Для создания «кормящего слоя» берут суспензию клеток того же вида растения. Клеточная суспензия должна находиться в ранней стадии ростового цикла. Каллусная культура, служащая «тканью-нянькой», также должна быть в стадии активного роста. При достижении колонией, выросшей из отдельной клетки, размера 0,5-1 мм, она может быть перенесена для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно либо на фильтр, помещенный на поверхность питательного агара. Использование «кормящего слоя», «ткани- няньки» или минимального объема среды, в которую помещается отдельная клетка, связано с явлением, называемым «действие фактора кондиционирования». Несмотря на многочисленные попытки определить природу веществ, индуцирующих деление отдельной клетки и механизм действия фактора кондиционирования, данный вопрос окончательно не решен.

11.4. Протопласты растительных клеток

11.4.1. Методы выделения растительных протопластов

Протопласты растений - это ограниченные мембраной цитоплазматические образования, несущие внутриклеточные органоиды, характеризующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять активный метаболизм и выполнять биосинтез и трансформацию энергии. Впервые выделение растительных протопластов было осуществлено в 1892 году Дж. Клеркером.

Наиболее простыми, хотя длительными и трудоемкими методами получения растительных протопластов являются механические. При этом фрагмент растительной ткани вносят в концентрированный раствор сахарозы, выдерживают до тех пор, пока протопласты не сожмутся и не отойдут от клеточных стенок, а затем аккуратно рассекают эпидермис, и протопласты выходят в среду. Однако при применении даже модифицированных механических методов можно получить только ограниченное число протопластов.

Принципиально отличный метод получения изолированных протопластов - энзиматический, при котором для удаления клеточной стенки используют ферменты. В сравнении с механическим методом ферментативное выделение протопластов имеет определенные преимущества. В этом случае сравнительно быстро и одновременно можно получать большое количество протопластов, которые не подвергнуты сильному осмотическому сжатию. При этом клетки становятся более интактными.

Для удаления клеточной стенки используются ферментные препараты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы - чаще всего грибного или бактериального происхождения. В результате обработки тканей ферментными препаратами образуется смесь, содержащая протопласты, обломки разрушенных клеток и целые клетки. Чтобы отделить протопласты от примесей, суспензию фильтруют через нейлоновые фильтры, а затем подвергают центрифугированию в мягких условиях.

Источником получения протопластов, помимо фрагментов растительных тканей, являются клеточные суспензии и каллусные культуры. Выделение протопластов достаточно легко выполнимая и технически хорошо отработанная процедура, однако сложность заключается в получении жизнеспособных протопластов и их дальнейшем культивировании. Успех процесса зависит от многих факторов - состава и качества ферментов, рН среды, выбора осмотического раствора, состояния растительного материала, а также применяемых методов получения и культивирования протопластов. Для стабильного получения большого количества протопластов важны стандартные условия выращивания исходных растений или клеток, определение оптимального для выделения протопластов возраста растения или органа, температуры, освещения, питания. Для получения протопластов из суспензионных клеточных культур наилучшей является поздняя логарифмическая фаза роста, когда клеточные стенки лучше всего поддаются ферментативному разрушению, а протопласты наиболее жизнеспособны.

11.4.2. Культивирование растительных протопластов

Для культивирования протопластов можно использовать метод жидких капель, при котором суспензия протопластов (в виде капель в жидкой среде) помещается в пластиковые чашки Петри. Метод обеспечивает хороший газообмен и диффузию в раствор экскретируемых продуктов и позволяет добавлять свежий раствор в нужной концентрации. Однако в этом случае протопласты агрегируются в центре каждой капли и образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений. Метод также неудобен, если требуется исследовать развитие индивидуальной колонии протопластов.

Другой распространенный метод - метод агаровой культуры, при котором определенный объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем аналогичной среды, содержащей 1 % агар-агара, расплавленного и охлажденного до 45°С. Чашки заклеивают пленкой (парафильмом) и культивируют при 28°С. Протопласты фиксированы в одном положении и отдалены один от другого. Этот метод имеет важное преимущество, позволяя наблюдать все этапы развития конкретного протопласта: формирование клеточной стенки, деление клеток, рост и развитие растения. Недостаток этого метода заключается в том, что возможно некоторое повреждение протопластов при смешивании с теплым агар-агаром.

Одним из вариантов данной методики является использование «кормящих» протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или гамма-излучения, которые смешиваются с жизнеспособными протопластами. Причем доза облучения выбирается такой, чтобы клетки утратили способность к клеточному делению, но поддерживали и стимулировали рост других клеток. Этот метод позволяет культивировать суспензию протопластов более низкой концентрации, чем та, что обычно необходима для их роста.

Похожим является метод совместных культур, используемый для трудно культивируемых протопластов. Такие протопласты культивируются совместно с протопластами, отличающимися быстрым ростом. Успех культивирования основан на активных веществах, которые выделяются быстрорастущими видами.

Удобным вариантом метода жидких капель является культивирование в малом объеме (до 1 мкл) единичных протопластов (микроизоляция). В микрокаплях соотношение объема клетки к объему питательной среды такое же, как в культуре плотностью около1000 кл/мл.

По питательным потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клетками. Поэтому питательные среды подобны таковым для клеточных культур. Поскольку центральная проблема при культивировании растительных объектов на искусственных питательных средах - создание определенной буферной емкости смеси, то обычно используют сопряженные пары солей, в которые объединяют химически и физиологически кислые и щелочные соли. К основным сопряженным парам относятся соли, содержащие азот и фосфор. Среды содержат железо в хелатной форме и сахарозу как источник углерода. Для индукции деления протопластов эффективно добавлять в среду цитокинины. Температура культивирования является видоспецифичной и варьирует в широких пределах. Температурный режим должен строго выдерживаться, так как протопласты чувствительны даже к незначительным отклонениям от оптимальной температуры. Оптимальные значения освещенности могут варьировать от абсолютной темноты до яркого света. Существенным фактором культивирования является плотность засева протопластов. При низкой плотности протопласты часто не делятся, в то время как при очень высокой возникают затруднения на поздних этапах культивирования из-за появления в ростовой среде токсичных продуктов обмена. Оптимальная плотность протопластов в культуре составляет103 -105 кл/мл.

Таким образом, используя разнообразные методы, учитывая характерные особенности исходного материала и соблюдая все условия, можно осуществить культивирование растительных протопластов, добиваясь получения целого растения из единичных протопластов. Разработка техники культивирования растительных клеток, получения и культивирования растительных протопластов послужила основой для создания методов биологического конструирования растений с заданными свойствами.