Среди дрожжей наиболее полно изучен вид S. сerevisiae. У этого вида в гаплодных клетках содержится 17 хромосом, в их составе идентифицировано несколько сотен генов. Большинство штаммов дрожжей содержат автономно реплицирующуюся кольцевую ДНК длиной 2 мкм. Плазмида Scp1 S.cerevisiae содержит около 6300 пар оснований и имеет 50-100 копий на клетку. Ее гибриды с плазмидами обычно используют в качестве векторов. Работа с дрожжами облегчается тем, что подобно бактериям они могут расти в жидкой среде и давать колонии на твердой среде, а также имеют короткое время генерации (несколько часов) вследствие малого размера генома. В дрожжевых плазмидах селективные маркеры не обнаружены, поэтому в качестве векторов их стали применять лишь после включения в них определенных хромосомных генов дрожжей. Наиболее подходящими для таких целей оказались гены, функционально активные и в клетках E.coli, т.е. исправляющие соответствующие бактериальные дефекты.

Известны 5 типов дрожжевых векторов. Векторы типа YIp (Yeast Integrating plasmid) являются фактически бактериальными векторами, так как дрожжевая ДНК в них представлена только одним из генов. Они не способны реплицироваться в дрожжевых клетках, но осуществляют их трансформацию путем интеграции в хромосому через рекомбинацию дрожжевого гена с гомологичным участком и путем замены хромосомного гена на векторный с помощью двойного кроссинговера. Векторы типа YEp (Yeast Episomal plasmid) сконструированы на базе 2-микронной ДНК. Эти челночные векторы позволяют клонировать чужеродные гены в клетках E.coli и затем исследовать их экспрессию в дрожжевых клетках. Частота трансформации дрожжей векторами YEp на три порядка выше по сравнению с таковой векторами первого типа, но получаемые при этом трансформанты нестабильны. Векторы типа YRp (Yeast Replicating plasmid) имеют хромосомные репликаторные последовательности ars (autonomously replicating sequence), которые были найдены около генов trp1(ars1) и arg4 (ars2), а также в других участках дрожжевых хромосом. Однако они слабо обеспечивают самостоятельную репликацию векторов, поэтому полученные с их помощью трансформанты дрожжей нестабильны. Наиболее перспективны для клонирования генов векторы типа YCp, содержащие, кроме хромосомных репликаторов ars1 и ars2, центромеры дрожжевых хромосом. В настоящее время для конструирования таких векторов применяют центромеры 3-й (CEN3) и 11-й (CEN11) хромосом. Поскольку центромера обеспечивает физическую связь хромосомы с нитями веретена, векторы YCp проявляют стабильность при митозе и мейозе. Векторы типа YLp являются линейными мини-хромосомами. Их получают путем введения в кольцевые плазмиды YCp теломер (специфические нуклеотидные последовательности) и последующей линеаризации плазмид. Процедура выделения ДНК в клетки дрожжей довольно проста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, полуая так называемые сферопласты. Их инкубируют с ДНК в присутствии CaCl₂ и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкубация сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных рекомбинантными плазмидами, основана на применении в качестве клеток- хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, в которой отсутствует тот или иной питательный компонент. Векторная плазмида содержит гены, которые при попадании в клетку- хозяина придают ей этот недостающий признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать колонии на обедненной среде. Применяя приемы, аналогичные использовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках.

Вторая часть вопроса:

Дрожжи-сахаромицеты (Saccharomyces cerevisiae) входят в число излюбленных объектов экспериментальной биологии. Данный низший эукариотический организм удобен в работе, имеет относительно небольшой геном и прекрасно изучен генетически и биохимически.

Дрожжи обладают многими свойствами, характерными для клеток высших эукариот, и поэтому рассматриваются как экономически наиболее выгодная эукариотическая система для продукции белков человека и животных. Кроме того, благодаря относительной простоте своей организации дрожжи являются замечательной лабораторной моделью, позволяющей изучать на молекулярном уровне такие фундаментальные биологические процессы, как митоз, мейоз, секреция и посттрансляционная модификация белков и др. Важное направление исследований открывает также возможность введения мутаций в клонированные дрожжевые гены с последующей встройкой таких генов в нормальные положения генома для изучения влияния мутаций на функции генов. Такая «обратная генетика» имеет большое значение для тонкого молекулярно-генетического познания S. cerevisiae, а также изучения организации и функционирования генетических элементов эукариот в целом. Пекарские дрожжи S. cerevisiae являются наиболее изученными в биохимическом и генетическом плане эукариотическими организмами. Это обусловлено тем, что для них применимо большинство методов, разработанных для манипуляций с бактериальными культурами. Дрожжи можно выращивать на простых питательных средах, в том числе агаризованных, в обычной бактериологической посуде. Кроме простоты культивирования дрожжи характеризуются высокой скоростью размножения и наличием небольшого числа стадий в цикле развития, смена которых легко контролируется в эксперименте. Будучи типичными эукариотами, дрожжевые клетки представляют собой удобную модель для изучения молекулярных основ наследственности и изменчивости высших организмов. Большое внимание дрожжи привлекли к себе как объекты генно-инженерных экспериментов, направленных на создание высокоэффективных технологий биосинтеза различных белков высших эукариот. У дрожжей-сахаромицетов подробно изучен клеточный цикл. Одно из преимуществ S. cerevisiae как экспериментальной системы — простота и надежность ее генетического анализа. Дрожжевые штаммы могут существовать как стабильные гаплоиды, что значительно упрощает, по сравнению с большинством диплоидных эукариотических систем, получение мутантов. Так как диплоидные штаммы также генетически стабильны, легко выяснить, является ли определенная мутация доминантной или рецессивной, и классифицировать мутанты со схожим фенотипом по группам комплементации. Размер хромосом у дрожжей-сахаромицетов значительно меньше, чем у высших эукариот, и находится в интервале от 250 до 2200 тпн. Это позволяет разделить дрожжевые хромосомы методом пульс-электрофореза. Относительно небольшой размер генома у дрожжей объясняется низким содержанием в их ДНК повторяющихся последовательностей.

(Да, вы где-то это уже видели. Вторая часть вопроса немного пересекается по смыслу с вопросом 57, так что не обращайте внимание на повторения).