Дрожжи обладают многими свойствами, характерными для клеток высших эукариот, и поэтому рассматриваются как экономически наиболее выгодная эукариотическая система для продукции белков человека и животных. Кроме того, благодаря относительной простоте своей организации дрожжи являются замечательной лабораторной моделью, позволяющей изучать на молекулярном уровне такие фундаментальные биологические процессы, как митоз, мейоз, секреция и посттрансляционная модификация белков и др. Пекарские дрожжи S. cerevisiae являются наиболее изученными в биохимическом и генетическом плане эукариотическими организмами. Это обусловлено тем, что для них применимо большинство методов, разработанных для манипуляций с бактериальными культурами.

У кишечный палочки бактериальные гены, включенные в геном, как правило, экспрессируются достаточно легко, давая мРНК и белок в силу того, что в сигнальных последовательностях, управляющих процессами транскрипциии трансляции у различных прокариотических организмов, много общих черт. Что касается экспрессии генов эукариот в бактериях, то она происходит крайне редко, если не создавать специальные условия, поскольку регуляторные участки эукариот отличны от таковых у бактерий. Регуляторные (сигнальные) участки не узнаются бактериальными РНК-полимеразами, что приводит к замедлению транскрипции. При клонировании геномной ДНК, эукариотической клетки экспрессия генов не происходит из-за отсутствия у бактерий системы сплайсинга. Следовательно, для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот необходимо, чтобы данные гены находились под контролем прокариотических регуляторных элементов.

Целесообразней встраивать ген в подходящий вектор для экспрессии, который содержит регуляторные элементы, способствующие активной экспрессии встроенного гена после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. Например, к таким эффективным регуляторным участкам принадлежит промотор гена р-лактамазы (ген устойчивости к ампициллину, входящий в состав плазмиды pBR322).

(Из того, что я прочитал я понял, что хоть дрожжи и являются эукариотами -- их система сплайсинга отличается. Она более простая и проходит сплайсинг не совсем полностью. Также, их гены имеют намного меньшую длину нуклеотидов. Тут можно подумать, что, возможно, некоторые гены могут быть экспрессированы кишечной палочкой, НО! Регуляторные элементы всё равно нужны. Используют плазмиды, содержащие как бактериальные сигнальные последовательности, запускающие репликацию ДНК в клетках E. coli, так и последовательности, необходимые для инициации репликации в дрожжевых клетках. Такие векторы называют челночными, про них ниже будет. 

А свойство “неполноценного” сплайсинга можно использовать для экспрессии дрожжами генов бактерий, так как они более непрерывны. Для экспрессии нормальных эукариотических генов тоже предпочтительнее брать непрерывные гены. Это может немного не по вопросу, но конкретного использования экспрессии дрожжевых генов с помощью кишечной палочки я не нашёл, но основные моменты описал. А это будет как дополнение -- этим вы сможете показать, что вы весь такой из себя эрудированный и шарящий, но это не точно).

Продолжим отвечать на остальную часть вопроса:

Векторы, способные реплицироваться в клетках-хозяевах разных биологических видов, называют челночными или бинарными. Принципы конструирования и функционирования челночных векторов одинаковы, они должны включать в себя репликоны (Реплико́н — молекула или участок ДНК или РНК, реплицирующийся из одной точки начала репликации) тех генетических систем, в которых будет происходить репликаця челночного вектора.

Примерами челночных векторов являются плазмидные ДНК, способные реплицроваться в клетках высших (жив. и растений) и низших организмов. Необходимость использования челночных векторов в генной инженерии связана с тем, что наработку в препаративном количестве векторной ДНК для проведения генно-инженерных манипуляций удобно проводить в бактериальных клетках, тогда как получение биологически активных продуктов клонированных генов высших организмов во многих случаях возможно только в клетках своего или близкого вида, в которых эти гены экспрессируются в природных условиях, т.е. в своем обычном генетическом окружении.

ДНК очень легко ввести в клетки дрожжей. Для этого ферментативным способом удаляют целлюлозную клеточную стенку и получают так называемые «сферопласты». Сферопласты затем инкубируют с ДНК, CaCl2 и полимерным спиртом (например, полиэтиленгликолем), который делает мембрану проницаемой и создает тем самым возможность для проникновения ДНК в клетки. После этого сферопласты инкубируют в среде, содержащей агар, где они восстанавливают клеточную стенку.

У дрожжей известны три вида плазмид, которые можно использовать в качестве векторов. Это 2m (мю) и 3m (мю, я не нашёл символ просто) (длина соответственно 2 и 3 мкм), а также митохондриальная (длина 24 мкм) ДНК. В след. Вопросе тоже каснёмся этой темы.

Повышение эффективности трансформации плазмидами дрожжей с помощью дополнительных точек начала репликации (элементов автономной репликации, ЭАР). Стабилизация дрожжевых плазмид введением центромерной (CEN) ДНК дрожжей.

У дрожжей известны три вида плазмид, которые можно использовать в качестве векторов. Это 2m (мю) и 3m (мю, я не нашёл символ просто) (длина соответственно 2 и 3 мкм), а также митохондриальная (длина 24 мкм) ДНК.

В 1967 г. опубликовали статью, в которой сообщили, что при электронно-микроскопическом анализе препарата общей дрожжевой ДНК выявляется кольцевая двухцепочечная ДНК с контурной длиной около 2 мкм. Дальнейшие исследования в разных лабораториях показали, что большинство (около 75 %) лабораторных штаммов S. сerevisiae содержат этот класс внехромосомных молекул ДНК. Обнаруженная кольцевая ДНК была названа двухмикронной плазмидой, а в дальнейшем — Scpl. На гаплоидную клетку приходится в зависимости от штамма от 30 до 200 копий Scpl. Плавучая плотность Scpl в градиенте концентрации хлорида цезия такая же, как и у хромосомной ДНК.

Плазмида Scpl является прекрасной модельной системой для изучения контроля экспрессии эукариотических генов и репликации хромосом. Зная молекулярно-биологическую организацию данной плазмиды, можно эффективно использовать ее для создания молекулярных векторов, последующего конструирования гибридных ДНК и введения их в клетки дрожжей. В 1979 г. обнаружили, что в ядре клеток дрожжей-сахаромицетов находится небольшое число молекул кольцевой двухцепочечной ДНК с контурной длиной около 3 мкм. Как выяснилось, данная плазмида представляет собой автономно реплицирующуюся полную копию одного хромосомного набора генов рибосомной РНК. В зависимости от штамма S. Cerevisiae плазмида Iμ присутствует в ядре в количестве от 1 до 19 копий. Полагают, что внехромосомные гены рибосомной РНК в виде автономной кольцевой ДНК могут быть промежуточной формой при амплификации генов рРНК дрожжей. Такая внехромосомная форма генов рРНК выявлена также у целого ряда других низших эукариот. Обнаружение внехромосомных плазмид и подробное исследование их структурно-функциональной организации дало мощный толчок работам по созданию молекулярных векторов и использованию S. cerevisiae для клонирования генов. Данная эукариотическая система предоставляет экспериментаторам принципиально новые возможности по сравнению с бактериальными клетками. Генно-инженерные манипуляции на S. Cerevisiae стали реальны лишь после того, как экспериментально была доказана возможность генетической трансформации дрожжевых клеток. Трансформирующая ДНК может сохраняться в дрожжевых клетках либо путем интеграции с хромосомой, либо путем автономной репликации в виде эписомы. Судьба введенной в клетки ДНК определяется присутствием или отсутствием в ней элементов автономной репликации (ЭАР). Высокоэффективная эписомная трансформация достигается включением в кольцевую плазмиду сегмента ДНК, содержащего точку начала репликации, что обусловливает независимую репликацию эписомы в дрожжевых клетках. Включение в плазмиду ЭАР во многих случаях позволяет довести эффективность трансформации популяции сферопластов дрожжей до 1%. Последовательности ЭАР были выделены из эндогенной дрожжевой плазмиды (2µ-кольца) и из клонированных сегментов дрожжевой хромосомы. Они состоят, по крайней мере, из 60 нуклеотидных пар, обогащены АТ парами и содержат каноническую последовательность АААС/ТАТААА. Интересно, что в качестве ЭАР в дрожжевых плазмидах функционируют также определенные клонированные сегменты ДНК кукурузы, дрозофилы и других организмов. Во всех случаях последовательности служат сигналом для экстрахромосомной репликации ДНК, введенной в дрожжевые клетки, однако пока нет четких доказательств того, что они инициируют репликацию хромосомной ДНК у дрожжей или других организмов.

Плазмиды, содержащие центромерные области, предложено называть векторами YCp-типа. Главным преимуществом этих векторов является их высокая митотическая и мейотическая стабильность. К недостаткам следует отнести низкую копийность в клетке и соответственно низкую дозу клонированного гена.

Разработанный метод клонирования и отбора центромерных участков хромосом в клетках дрожжей позволил впервые изолировать центромеры эукариотических хромосом и изучить их структурную организацию.

Центромера -- участок хромосомы, обеспечивающий правильное расхождение хромосом в митозе и мейозе в результате взаимодействия с элементами аппарата веретена клетки. Используя описанный выше метод, удалось клонировать в составе плазмид центромеры всех хромосом S. cerevisiae.

(В след. вопросе дополнение к вказанному).