| Ингредиенты | Номера пробирок | ||
| 1 | 2 | 3 | |
| Испытуемая сыворотка | 0,5 | 0,5 | — |
| Антиген | 0,5 | — | 0,5 |
| Физиологический раствор | — | 0,5 | 0,5 |
| Комплемент | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| В термостат при 37 °С на 1 час | |||
| Гемолитическая сыворотка | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Эритроциты барана | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| В термостат при 37 °С на 30-60 минут | |||
Результаты РСК учитывают дважды: после инкубации в термостате и на следующий день (через 18-20 часов). Интенсивность реакции оценивают по 4-баллъной системе:
++++ полная задержка гемолиза: жидкость над эритроцитами не окрашена, эритроциты в осадке;
+++ неполная задержка гемолиза: жидкость над эритроцитами слабо-розового цвета, значительный осадок эритроцитов;
++ частичная задержка гемолиза: жидкость красная, осадок эритроцитов;
+ слабая задержка гемолиза, жидкость интенсивно-красная, незначительный осадок эритроцитов;
± следы задержки гемолиза: гемолиз почти полный, при взбалтывании со дня поднимается незначительный осадок в виде облачка;
— полный гемолиз: лаковая кровь, осадок отсутствует.
Результаты опыта РСК
1 2 3
Рис.6. 1-опыт, 2-контроль сыворотки, 3-контроль антигена.
11. Иммунофлуоресцентный метод. Получение диагностических люминесцирующих сывороток и их применение: прямой иммунофлуоресцентный метод; непрямой иммунофлуоресцентный метод
а) Прямой иммунофлуоресцентный метод.
Приготовить на предметном стекле из исследуемой культуры бактерий тонкий мазок (в густом мазке не удается отметить свечение отдельных клеток). Границы мазка отметить с тыльной стороны восковым карандашом. Подсушить препарат на воздухе и погрузить его в стаканчик с 96° этиловым спиртом для фиксирования на 15 минут, а затем вновь подсушить на воздухе. После этого нанести на мазок каплю люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении. (Рабочее разведение сухих люминесцирующих сывороток указано на этикетке ампулы). Препарат обрабатывается сывороткой в течение 15-20 минут при комнатной температуре. По окончании окраски каплю сыворотки стряхивают, а препарат промывают в течение 10 минут проточной водопроводной водой, затем подсушивают на воздухе и наносят на него каплю разведенного глицерина (9 частей глицерина +1 часть физиологического раствора). Накрывают препарат покровным стеклом, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой.
Микроскопию производят в люминесцентном микроскопе. При этом используют специальное нефлуоресцирующее иммерсионное масло.
При наличии в исследуемом материале бактерий, по отношению к которым люминесцирующая сыворотка содержит антитела, на темном фоне препарата обнаруживается специфическое яркое желто-зеленое свечение по периферии бактериальных клеток. Посторонние бактерии не светятся.
Для оценки интенсивности специфического свечения используют четырехкрестовую систему:
++++ сверкающая флуоресценция желтовато-зеленого цвета с четко выраженной формой клеток;
+++ яркая флуоресценция желто-зеленого цвета;
++ и + заметная, но слабо выраженная флуоресценция.
Положительным результатом считается флуоресценция, оцениваемая
на ++++ и +++.
Иммунофлуоресцентный метод является методом ускоренной ориентировочной диагностики и должен сопровождаться полным бактериологическим исследованием.
б) Непрямой иммунофлуоресцентный метод предусматривает использование единой флуоресцирующей сыворотки - антиглобулиновой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов. Как правило, диагностические специфические сыворотки являются кроличьими, поэтому флуоресцирующая антиглобулиновая сыворотка реагирует с любыми специфическими антителами (кроличьими глобулинами), которые при этом играют роль антигенов. Кроличьи глобулины (специфические антитела) связываются с гомологичными антигенами. На образовавшихся комплексах фиксируются флуоресцирующие антиглобулиновые антитела и вызывают их свечение в люминесцентном микроскопе.
12. Применение методов иммуносорбентного анализа твердой фазы: применение иммуноферментного метода (ИФМ); применение радиоиммунного метода (РИМ).
В основе методов иммуносорбентного анализа твердой фазы лежит сорбция антител (для обнаружения неизвестного антигена) или антигена (для обнаружения соответствующих антител) и специфических антител, меченных ферментом (ИФМ) или изотопом (РИМ). Чувствительность этих методов значительно превышает чувствительность обычных иммунологических реакций, поэтому они приобрели самое широкое распространение. Практически эти методы могут быть использованы для диагностики любого инфекционного заболевания. С помощью этих методов можно определять как антигены, так и антитела к ним. Методика постановки этих реакций включает три последовательных этапа.
Обнаружение антигена с помощью ИФМ и РИМ.
Первый этап - адсорбция специфических антител твердой фазой, в качестве которой обычно используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых микротитраторных панелей. Антитела нековалентно связываются со стенками лунок, но у них сохраняются свободными активные центры, и они способны поэтому специфически реагировать с соответствующим антигеном.
Второй этап - связывание антигена из суспензии исследуемого материала за счет реакции антитело-антиген, происходящей на границе твердая фаза - жидкость. После этого луночки промывают раствором, содержащим слабый неионный детергент, для удаления из системы других, неспецифически связанных с антителами компонентов.
Третий этап - обработка твердой фазы с фиксированными на ней комплексами антитело - антиген специфическими антителами против данного антигена, но меченными либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется из системы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале искомого антигена на поверхности твердой фазы формируется комплекс: антитело-антиген - меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антитела метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Субстратом для пероксидазы служит ортофенилендиамин (ОФД) в смеси с Н202, используемый в виде раствора в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0). Добавление в опытную луночку раствора ОФД приводит к тому, что он подвергается действию персокидазы, фиксированной на антителах, образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интенсивность которой позволяет количественно оценивать результаты опыта фотометрированием.
Радиоиммуный метод (РИМ) предусматривает использование антител, меченных изотопом, поэтому результаты реакции оценивают путем определения радиоактивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактивности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицательных образцов.
Обнаружение специфических антител с помощью ИФМ и РИМ
Для обнаружения антител эти реакции также ставятся в три этапа.
Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенсибилизированные луночки, т.е. на их стенках антигены уже адсорбированы.
Второй этап - добавление в луночки образцов исследуемой сыворотки для обнаружения в них специфических антител к данному антигену. Если они имеются, то вступают во взаимодействие с антигеном и образуют комплекс антиген-антитело.
Третий этап - после отмывания луночек в них добавляют специфические антиглобулиновые антитела (антивидовые, т.е. антитела против человеческих иммуноглобулинов, но меченные ферментом (ИФМ) либо изотопом (РИМ). Результаты реакции оцениваются как указано выше. В качестве контролей используют образцы, заведомо положительные и заведомо отрицательные.
13. Моноклональные антитела и их применение
Моноклональные антитела - антитела, продуцируемые одним клоном антителообразующих клеток. По всем параметрам антитела, вырабатываемые одним клоном, идентичны (по классу иммуноглобулинов; по их типу и антительной специфичности). Они взаимодействуют только с одним антигеном, и это обстоятельство значительно повышает специфичность всех иммунологических реакций, в которых они участвуют. Получение моноклональных антител стало возможным после того, как в 1975 году Кёллером и Мильштейном была разработана методика получения клеточных гибридов -гибридом путем слияния нормальных лимфоцитов иммунизированных животных с культивируемыми в питательной среде клетками миеломных штаммов. Были использованы такие штаммы, которые не содержали фермента гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (поэтому они погибают в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин - ГАТ).
Лимфоциты в такой среде не гибнут. Слияние лимфоцитов с миеломными клетками осуществляется с помощью полиэтиленгликоля. Слившиеся гибридомные клетки получают от лимфоцита способность синтезировать определенные антитела (моноклональные антитела, т.е. антитела одной специфичности) и способность выживания в среде с ГАТ. От миеломного партнера они получают способность размножаться бесконечно in vitro.
Накопившийся гибридомный клон может быть размножен, а синтезируемые им моноклональные антитела могут быть получены в неограниченном количестве.
Уже созданы фирмы по выработке моноклональных антител любой специфичности в качестве уникальных реагентов, диагностических и лечебных препаратов.
Получение лимфоцитарных гибридом включает в себя несколько этапов:
1. Получение миеломкой линии.
2. Получение селезеночных клеток от иммунизированного организма.
3. Создание в культуре условий для того, чтобы хотя бы некоторые клетки одной и другой популяции могли осуществить слияние.
4. Выделение слившихся клеток и накопление их клонов.
5. Отбор заданного клона, его накопление и использование. Накопление клона осуществляется in vitro или путем введения животным.
При этом на всех этапах образующиеся клетки необходимо консервировать в жидком азоте, чтобы в любое время можно было вернуться к любому этапу и сохранить на будущее нужные клоны.
В качестве миеломных клеток чаще всего используются мышиные или крысиные клеточные линии. Гибридомы создают не только на основе В - лимфоцитов, обеспечивающих возникновение культур, синтезирующих моноклональные антитела, но и на основе Т - лимфоцитов. Уже сконструированы культуры Т - гибридом, синтезирующие лимфокины.
Контрольные вопросы
1. Какие компоненты участвуют в реакции агглютинации?
2. Как ставится ориентировочная реакция агглютинации на стекле?
3. Для чего нужен контроль при постановке реакции агглютинации?
4. По каким признакам определяется степень агглютинации в пробирках?
5. Как производится оценка степени агглютинации?
6. Для чего необходим контроль в реакции агглютинации?
7. При какой степени агглютинации реакция считается еще положительной?
8. Какие компоненты участвуют в реакции преципитации?
9. Какова методика постановки реакции кольцепреципитации?
10. Для каких целей используется реакция преципитации в агаре?
11. Какова методика постановки реакции преципитации в агаре?
12. В чем заключается сущность реакции пассивной гемагглютинации?
13. В чем заключается сущность реакции латекс-агглютинации?
14. Какие преимущества имеет РПГА?
15. Какие компоненты участвуют в РПГА?
16. Что такое сенсибилизированные эритроциты?
17. Как определяют результаты РПГА?
18. Какова методика постановки реакции пассивной гемагглютинации?
19. Что такое комплемент?
20. Какую роль играет комплемент в реакциях иммунной сыворотки?
21. Как получают гемолитическую сыворотку?
22. Какова методика постановки реакции гемолиза?
23. Что такое гемолитическая (индикаторная) система?
24. Если конечным результатом РСК является гемолиз - реакция положительная или отрицательная?
25. Какие компоненты участвуют в РСК?
26. Для чего необходимо определение рабочих доз антигена и комплемента?
27. Как определяют рабочую дозу комплемента?
28. Почему испытуемая сыворотка должна быть инактивирована?
29. Как ставят основной опыт РСК?
30. Если в сыворотке больного отсутствуют антитела к антигену, каким будет результат РСК?
31. Что называется титром гемолитической сыворотки?
32. В каком разведении берется в основной опыт гемолитическая сыворотка?
33. Какие контроли используются в РСК?
34. Какова классификация форм приобретенного иммунитета?
35. Каковы различия между искусственным активно и искусственным пассивно приобретенным иммунитетом?
36. Какой иммунитет создается при введении гамма-глобулина?
37. Какие условия хранения иммунопрепаратов?
38. Как получают химические вакцины?
39. Как готовят анатоксины?
40. Как получают иммунные диагностические сыворотки?
41. Какими свойствами обладают иммунные сыворотки?
42. Как получают лечебно-профилактические сыворотки?
43. Как производят очистку лечебно-профилактических сывороток?
44. Какие преимущества имеет гамма-глобулин перед сыворотками?
45. В каких единицах дозируются антитоксические сыворотки?
46. В каких единицах дозируются анатоксины?
47. Каковы методы введения аллергенов?
48. Каковы способы введения вакцин?
49. Как готовят аутовакцины, каково их назначение?
50. На чем основаны методы иммуносорбентного анализа твердой фазы?
51. С какой целью используются иммуноферментные методы?
52. Каким образом с помощью ИФМ можно обнаружить антитела в исследуемой сыворотке?
53. Каким образом с помощью ИФМ можно обнаружить антиген в исследуемом материале?
54. Как ставится реакция латекс-агглютинации и как она оценивается?
55. Что такое моноклональные антитела и каковы их преимущества перед обычными иммунными сыворотками?
56. Как получают моноклональные антитела?
57. Из каких основных этапов складывается постановка реакций иммуноферментного метода и радиоиммунного метода?
58. Что такое гибридомы и как их получают? Какие клетки скрещиваются для получения гибридом?
59. Какая разница между антигенным и антительным эритроцитарным диагноетикумом?
60. Каковы преимущества и недостатки иммунофлуоресцентного метода?
61. Почему препараты-мазки при этом методе исследования не должны быть слишком густые?
62. В чем состоит сущность иммунофлуоресцентного метода исследования?
63. Каково различие между прямым и непрямым методами иммунофлуоресцентного исследования?
ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ 9
Дата: 2019-03-05, просмотров: 312.
