Рис.1. Золотистый стафилококк	Рис.2. Эпидермальный стафилококк

1. Вскрытие мыши, зараженной на предыдущем занятии, и исследование ее органов

Вскрытие мыши. Инструменты стерилизуются кипячением. Труп мыши фиксируется на лотке с застывшим парафином брюшком кверху и дезинфицируется путем обжигания шерсти и кожи в области предполагаемых разрезов.

Делается продольный разрез кожи от лобка до нижней челюсти, а затем в стороны конечностей. После этого отсепаровывается кожа и изучается состояние подкожной клетчатки, лимфатических узлов, наличие кровоизлияний с помощью пинцета приподнимают слегка брюшную стенку и делают на ней надрез, после чего осторожно, чтобы не повредить кишечника, вскрывают брюшную полость. Изучают состояние внутренних органов брюшной полости, наличие в ней экссудата.

Печень, селезенку, почки стерильным пинцетом извлекают и помещают в стерильную чашку Петри для последующего микроскопического исследования. Далее вскрывается грудная полость, для чего пинцетом приподнимают грудину, рассекают диафрагму и с помощью ножниц отсекают грудину вместе с участком ребер таким образом, чтобы стали доступны легкие и сердце.

Раскаленным пинцетом прижигают стенку сердца (она при этом фиксируется с помощью другого пинцета) и кончиком пастеровской пипетки прокалывают стенку сердца. Отсасывают из сердца кровь и тут же делают посев в МПБ и на косячок МПА. Изучают состояние легких, обращают внимание на наличие экссудата в плевральной и околосердечной полостях. Для выделения чистой культуры возбудителя делается посев также из селезенки и печени (если нужно, то из других органов) на МПБ и МПА.

Мазки-отпечатки или препараты-оттиски готовят на одном стекле по определенной схеме:

из печени - № I;

из легких - № 2;

из селезенки - № 3;

из лимфатического узла - №.4;

на конце стекла делают один сплошной мазок из крови сердца.

Приготовить препараты-оттиски из органов мыши: печени, легких, селезенки, лимфатического узла, крови. Окрасить препарат-оттиск по способу Ионэ для обнаружения капсул. Отметить, соответствуют ли обнаруживаемые в препаратах микроорганизмы тем, которые использовались для заражения мыши. Составить протокол вскрытия мыши с указанием в нем обнаруженных изменений в органах трупа. Сделать необходимые зарисовки.

 Протокол вскрытия мыши.

1. Внешний осмотр____________________________________________________

2. Состояние подкожной клетчатки______________________________________

3. Состояние лимфатических узлов______________________________________

4. Грудная полость____________________________________________________

а) легкие___________________________________________________________

б) сердце___________________________________________________________

в) медиастинальные лимфатические узлы_______________________________

5. Брюшная полость___________________________________________________

а) печень_____________________________________________________________

б) селезенка_________________________________________________________

в) почки с надпочечниками____________________________________________

6. Примечание________________________________________________________

4. Фагоцитоз

а) Методика постановки опыта фагоцитоза: белой мыши внутрибрюшинно вводят 1-2 мл стериального МПБ, раздражение которым брюшины приводит к скоплению в брюшной полости большого количества лейкоцитов. Через 4-5 часов в брюшную полость мыши вводят шприцем или пастеровской пипеткой 0,5-1 мл густой взвеси суточной культуры стафилококка. Через 8-10 минут капилляром пастеровской пипетки прокалывают брюшную стенку и из брюшной полости набирают экссудат. Из экссудата готовят препараты-мазки, подсушивают, фиксируют в смеси Никифорова и окрашивают метиленовым синим. При микроскопии в мазке видны бледно-голубые лейкоциты, в их цитоплазме - синие стафилококки.

б) промикроскопировать готовые препараты-мазки гонококков из гнойных выделений больного. Зарисовать картину фагоцитоза микроорганизмов.

Рис.3. Препарат оттиск из органов мыши;  окраска по Ионэ	Рис.4. Фагоцитоз гонококков Окраска____________

5. Реакция фагоцитоза. Постановка опсоно-фагоцитарной реакции.

а) В шприц, объемом в I мл, берут 0,2 мл 3,8%-ного раствора лимоннокислого натрия и отсасывают из краевой вены уха иммунизированного кролика кровь до I мл. После осторожного перемешивания крови с цитратом натрия ее выливают в пробирку и добавляют туда 0,5мл взвеси убитых бактерий. Вновь осторожно перемешивают кровь с бактериями, и пробирку помещают в термостат на 30 минут при 370, после чего готовят препараты-мазки. Для этого хорошо обезжиривают стекло и с помощью пастеровской пипетки осторожно отсасывают слой лейкоцитов, располагающихся в виде сероватой пленки над слоем эритроцитов.

Каплю взятой взвеси лейкоцитов наносят на стекло и готовят мазок таким же образом, как для определения формулы белой крови. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют смесью Никифорова в течение 10 минут и окрашивают синькой Менсона в течение 30 секунд, промывают водой, обсушивают и рассматривают с иммерсионным объективом.

Пример вычисления фагоцитарного числа

Фагоцитарное число равно

б) Для определения опсоно-фагоцитарного числа под микроскопом ведут подсчет бактерий, поглощенных лейкоцитами. Подсчитывают общее количество бактерии, поглощенных 25 лейкоцитами. Частное от деления числа фагоцитированных микробов на 25 является фагоцитарным числом для испытуемой иммунной сыворотки. Таким же образом определяется фагоцитарное число нормальной (неиммунной сыворотки). Отношение фагоцитарного числа иммунной сыворотки к фагоцитарному числу нормальной сыворотки называется опсоническим индексом.

Фагоцитарное число в вашем исследовании равно_______________________

в) Методика определения завершенности фагоцитоза. 18-20-часовая агаровая культура бактерий (1 мл около I млрд. клеток) добавляется к исследуемой крови и смесь выдерживается в течение 30- 45 минут в термостате при 37 °С .

После этого готовят мазки для определения фагоцитарной активности (ОФР).

Оставшуюся смесь (несколько капель) наносят на поверхность слабощелочного агара в чашке Петри, равномерно распределяют по площади 5x5 см и чашку помещают на 2 часа в термостат для подращивания бактерий.

Через 2 часа готовят препараты-отпечатки. Для этого вырезают из части агара, на которую наносили смесь лейкоциты-микробы, пластинку размером 2x4,5 см и помещают ее на предметное стекло той поверхностью, где нанесена смесь. После приготовления отпечатка с помощью пинцета пластинку сбрасывают, но так, чтобы не допустить ее скольжения по стеклу.

Препарат-мазок и препарат-отпечаток фиксируют в смеси Никифорова, окрашивают по Романовскому-Гимза в течение 25-30 минут (краску разводят перед употреблением из расчета 3 капли краски на I мл воды).

Для определения завершенности фагоцитоза в препарате-отпечатке подсчитывают 50 нейтрофилов и определяют процентное соотношение дезинтегрированных (разрушенных) и жизнеспособных клеток среди фагоцитированных микробов в лейкоците.

Погибшие бактерии при этом окрашены в розовый цвет или синий и находятся в разной стадии разрушения. Жизнеспособные клетки-более крупные и окрашены в интенсивно синий цвет.

6. Лизоцим. Действие лизоцима на различные виды бактерий

Опыт действия лизоцима на Micrococcus lysodeikticus.

Для опыта необходимо иметь:

1.Раствор яичного белка в разведении 1:25.

2.Культуру M. lysodeikticus на косячке МПА.

3.Физиологический раствор во флаконе.

4.Пипетки емкостью в I и 5 мл.

5.Две агглютинационные пробирки.

Порядок работы

1. Пометить карандашом по стеклу опытную и контрольную пробирки.

2. В контрольную пробирку налить I мл физиологического раствора.

3. В опытную пробирку налить I мл раствора яичного белка в исходном разведении.

4. Приготовить бактериальную взвесь, для чего в пробирку с культурой M. lysodeikticus внести 5 мл физиологического раствора и, вращая пробирку между ладонями, смыть культуру.

5. В опытную и контрольную пробирки добавить по I мл полученной бактериальной взвеси и поставить пробирки в термостат на 1 час при 37 °С.

6. Через час зарегистрировать результаты опыта, отмечая полное растворение микробов+ + + +, частичное + + и отсутствие лизиса знаком «–».