Материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления пользователям Интернета и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав.
© 2018 - 2024
О Г Л А В Л Е Н И Е
В В Е Д Е Н И Е
ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
1. Микроскопический (бактериоскопический) метод исследования.
2. Противомикробные мероприятия (стерилизация, дезинфекция, антисептика, асептика).
3. Классификация питательных сред.
4. Культуральный метод исследования.
5. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.
6. Схема выделения чистой культуры клостридиальных анаэробов.
7. Схема выделения чистой культуры неклостридиальных анаэробов.
8. Схема идентификации микроорганизмов.
9. Определение биохимических свойств микробов.
10. Биологический метод исследования.
11. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.
12. Методы изучения генетики микробов.
13. Методы изучения нормальной микрофлоры.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
1. Микробиологическая диагностика пневмококковых инфекций.
2.Общие принципы диагностики острых кишечных инфекций, вызванных микробами
семейства энтеробактерий
3. Лабораторная диагностика кишечного иерсиниоза.
4. Клебсиеллы. Лабораторная диагностика склеромы и озены.
5. Лабораторная диагностика холеры.
6. Кампилобактерии. Кампилобактериозы. Методы диагностики.
7. Пищевые отравления бактериальной природы. Методы диагностики.
8. Лабораторная диагностика газовой гангрены, столбняка и ботулизма.
9. Серологическая диагностика сифилиса.
10. Лабораторная диагностика хламидиозов.
11. Микоплазмы и микоплазмозы.
ОБЩАЯ И ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ
1. Методы культивирования вирусов.
2. Принципы диагностики вирусных инфекций.
3. Лабораторная диагностика гепатитов.
4. Лабораторная диагностика СПИДа.
ДРУГИЕ ИНФЕКЦИИ
1. Классификация грибов. Микозы. Методы диагностики.
2. Возбудители мадуромикоза.
3. Возбудитель пневмоцистоза.
4. Возбудитель донованоза.
5. Возбудитель язвы Бурули.
6. Возбудитель мелиоидоза.
В В Е Д Е Н И Е
Медицинская микробиология является одной из наиболее важных областей знаний широко используемых во врачебной практике. Студенты медики нуждаются в изучении микробиологии для успешной диагностики и лечения заболеваний. Инфекционная заболеваемость в мире до сих пор остается очень распространенной, в ее структуре постоянно происходят существенные изменения, появляются новые возбудители, изменяется характер течения хорошо известных заболеваний. В последние десятилетия в фундаментальной и прикладной микробиологии накоплены новые научные факты, разработаны новые методы исследований. В связи с этим весьма важно, чтобы в обучении студентов медицинской микробиологии дать достаточно полные знания как о биологии микроорганизмов, так и о методах их выделения из разнообразных материалов, идентификации, методах диагностики инфекционных заболеваний, а также интерпретации полученных данных.
В представленном пособии к практическим занятиям для студентов Минского медицинского института по микробиологии представлены материалы по общей микробиологии (методы микроскопии, противомикробных мероприятий, выделения чистых культур и их идентификации, изучения нормальной микрофлоры) и частной микробиологии (методы диагностики пневмококковых инфекций и клебсиеллезов, острых кишечных инфекций и пищевых отравлений кампилобактериоза, анаэробной инфекции, сифилиса, хламидиозов и микоплазмозов). Кроме того, рассматриваются методы культивирования и лабораторной диагностики ряда распространенных вирусов и грибов.
В подготовке данного пособия принимали участие большинство сотрудников кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии Минского медицинского института.
ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
Этапы метода
1. Забор материала (гной, мокрота, кровь, моча, испражнения, промывные воды бронхов и желудка, ликвор, содержимое полостей носа, вагины, трупный материал).
2. Транспортировка материала.
3. Приготовление микропрепаратов (фиксация и окраска при необходимости).
4. Микроскопия с оценкой формы, размеров, взаимного расположения микробов и т.д.
5. Заключение.
Оценка метода
Метод прост, широко доступен, быстр, экономичен, но мало чувствителен (около 10 54 0-10 55 0 бактерий в мл) и специфичен (из-за схожести морфологии микроорганизмов разных видов).
СТЕРИЛИЗАЦИЯ
Под стерилизацией понимают совокупность физических или химических способов полного освобождения объектов внешней среды от вегетативных и покоящихся форм патогенных, условно-патогенных и непатогенных микроорганизмов.
Целями стерилизации являются: 1) предупреждение заноса микроорганизмов в организм человека при медицинских вмешательствах, 2) создание и поддержание асептической и безмикробной (гнотобиотической) среды, 3) исключение микробного обсеменения (контаминации) питательных сред, культур клеток, реагентов при микробиологических и иммунологических исследованиях, 4) предупреждение микробной биодеградации (разрушения) лекарственных, диагностических, продовольственных и иных материалов.
В медицинской практике стерилизации подвергают медицинский инструментарий и аппаратуру, лекарственные и диагностические препараты, перевязочный и шовный материал, белье, предметы ухода за больными, питательные среды, лабораторную посуду; при создании гнотобиотической зоны - воздух помещения, оборудование и все остальные объекты зоны (боксы, палаты и др.).
Процесс стерилизации объектов состоит из следующих этапов: 1) дезинфекция, 2) очистка, 3) сборка, группировка, размещение в стерилизаторе, 4) собственно стерилизация, 5) сушка, 6) контроль за стерилизацией, 7) хранение стерилизованных материалов.
Стерилизующие агенты и режимы стерилизации. Большинство объектов стерилизуют насыщенным паром под давлением в специальных аппаратах (паровых стерилизаторах, автоклавах). В зависимости от стерилизуемых материалов температура насыщенного пара устанавливается от 110 5о 0С до 138 5о 0С, давление - от 0,4 до 2,5 атм., экспозиция - от 3 до60 мин. Наборы инструментов, текстильные изделия в свертках, простые питательные среды стерилизуют при режиме 1 атм. (121 5о 0С) 15-30 мин. Чувствительные к температуре материалы стерилизуют при более низком давлении (0,4-0,5 атм.), устойчивые к ней - при более высоком (2,5 атм.). Стерилизация сухим жаром в аэростерилах также высокоэффективна, но высокая температура (160-180 5о 0С), длительные сроки экспозиции (1-2 часа) и сухой горячий воздух могут вызвать повреждение стерилизуемых материалов. Поэтому сухим жаром стерилизуют предметы из термостабильных материалов (стекло, металл и др.), а также гидрофобные вещества. Термолабильные материалы стерилизуют 3-4-кратным (дробным) прогреванием текучим паром при 100 5о 0С по 1 часу с перерывами в 1 сутки, в течение которых материал находится в термостате (для прорастания спор).
Крупногабаритные изделия, предметы из термолабильных и разнородных материалов стерилизуют в герметических контейнерах (например, ЭТО-стерилизаторах) парами формальдегида, этиленоксида, а также растворами формалинэтилалкоголя, формалинизопропана при экспозиции в 6-24 часа (химическая стерилизация). В заводских условиях медицинские изделия, в основном одноразовые, часто стерилизуют гамма-лучами 0,2-4,5 М рад (лучевая стерилизация). Жидкости можно простерилизовать пропусканием через мелкопористые фильтры, воздух помещений - пропусканием через бактерицидные фильтры, а также многократным «промыванием» помещения ламинарным потоком стерильного воздуха.
Эффективность стерилизации проверяют биологическим, химическим, механическим методами.
ДЕЗИНФЕКЦИЯ
Под дезинфекцией понимают совокупность способов полного, частичного или селективного уничтожения потенциально патогенных для человека микроорганизмов на объектах внешней среды с целью предупреждения передачи возбудителей болезней от больных и микробоносителей здоровым людям.
Дезинфекция в очагах инфекционных заболеваний (квартира, дом, больничное, служебное помещение и др.) ставит цель селективного уничтожения возбудителя конкретной болезни, например, в очаге туберкулеза - возбудителя туберкулеза, дифтерии - возбудителя дифтерии, гепатита - возбудителя гепатита и т.д. Дезинфекции в этом случае подвергается та группа объектов, которая служит фактором передачи возбудителя этой болезни. Она бывает заключительной, когда инфекционный больной госпитализируется в инфекционную больницу, и текущей, когда больной остается в очаге на какой-то период времени.
В больницах, детских, общественных учреждениях ежедневно или периодически проводится профилактическая дезинфекция, ставящая цель резкого снижения численности популяции всех потенциально патогенных для человека микробов на всех объектах помещения. В лечебных учреждениях особое внимание обращают на дезинфекцию инструментария, аппаратов, белья, предметов ухода, воздуха, выделений от больных.
Дезинфицирующие средства. В подавляющем большинстве случаев для целей дезинфекции используют химические вещества, которые носят название дезинфектанты. Дезинфектанты должны обладать широким спектром действия, микробоцидным эффектом, хорошо растворяться в воде и образовывать с ней или с воздухом стойкие активные растворы, суспензии, эмульсии, аэрозоли, туманы, обладать низкой токсичностью и аллергенностью, сохранять активность в обеззараживаемой среде, не повреждать обеззараживаемые объекты, не иметь неприятного запаха, быть экологически чистыми. Чаще применяют хлорсодержащие соединения (гипохлорид кальция, гипохлорид натрия, хлорамин и др.), препараты фенола, глюконат хлоргексидина, формальдегид и глютаральдегид, алкоголи, четвертичноаммониевые соединения, перекись водорода, надмуравьиная и надуксусная кислоты, персепт, виркон.
Выбор дезинфектанта, его концентрации, лекарственной формы (раствор, аэрозоль, эмульсия, суспензия, порошок, паста, лаки, краски и др.), экспозиции (время действия) зависит от требуемой степени дезинфекции, спектра и уровня чувствительности микроба-воз-будителя, вида дезинфекции, объекта дезинфекции, условий, в которых протекает процесс дезинфекции. Среди последних важное значение имеет температура рабочей формы дезинфектанта, которая должна быть не ниже 20 5о 0С (200 С ?).
Дезинфекция должна сопровождаться выборочным бактериологическим и иным контролем. Дезинфицирующий эффект может быть достигнут также с помощью сжигания объекта, прокаливания в пламени, воздействия горячего воздуха или пара в камерах, кипячения в воде, ультразвука, ультрафиолетового облучения, гамма-лучей, очистки, стирки, мытья, выколачивания, вытряхивания, протирания, проветривания.
АНТИСЕПТИКА
Под антисептикой понимают совокупность способов уничтожения или подавления жизнедеятельности потенциально опасных для здоровья человека организмов на интактных или поврежденных коже, слизистых оболочках и в полостях с целью профилактики (профилактическая) и лечения (терапевтическая антисептика) инфекционных процессов.
Выделяют следующие категории профилактической антисептики: 1) антисептика свежих ран, 2) хирургическая антисептика рук, 3) гигиеническая антисептика рук, 4) антисептика операционного поля, 5) антисептика пупочной раны, глазных инфекций, опрелостей и ссадин кожи новорожденных, 6) предупреждение послеродового мастита, микоза стоп и других инфекций кожи и слизистых оболочек.
Терапевтическая антисептика применяется с целью: 1) подавления жизнедеятельности микробов-возбудителей местных инфекционных процессов и предупреждения сепсиса, 2) предупреждения повторного попадания микробов в патологический очаг и развития суперинфекции, реинфекции и вторичной инфекции.
Процесс антисептики состоит из следующих этапов: 1) очистка места нанесения антисептика от грязи, сала, сгустков крови, слизи, инородных частиц, 2) хирургическая обработка (при антисептике ран), 3) внесение антисептического препарата, 4) изоляция обработанного антисептиком участка от повторного проникновения микробов.
Используемые для целей антисептики факторы называют антисептическими средствами. Их подразделяют на: 1) химические антисептики, 2) биологические антисептики (бактериофаги и препараты из бактерий-антагонистов), 3) физические и механические факторы (хирургическая обработка, промывание, дренирование, сорбция и др.).
Антисептические препараты относятся к следующим классам химических веществ: хлор, йод и другие галогены; органические и неорганические кислоты; перекись водорода и перманганат калия; формальдегид и спирты; фенол и его препараты; соли тяжелых металлов; красители; катионные и анионные поверхностно-активные вещества; нитрофурановые, сульфаниламидные, 8-оксихинолиновые, хинолоновые, имидазольные и др. соединения.
Готовые лекарственные формы антисептиков прежде всего должны вызывать гибель (бактерицидный эффект) или задерживать рост и размножение (бактериостатический эффект) микробов и не должны оказывать повреждающее действие на организм человека. Кроме того, к ним предъявляются требования: не снижать противомикробную активность в присутствии патологических и физиологических субстратов, обладать достаточно широким спектром действия, хорошо растворяться в липидах, быть недорогими, экологически чистыми в производстве и стабильными при хранении.
Перед применением антисептика с целью лечения от больного выделяют возбудитель болезни и определяют его чувствительность к дезинфектанту. При выборе антисептика для профилактической антисептики ориентируются на спектр и уровень естественной чувствительности микробов, которые обитают в месте нанесения антисептика.
В больничных стационарах в связи с широким распространением устойчивых к антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам вариантов бактерий устанавливают систематический контроль за их распространением.
АСЕПТИКА
Асептика - это совокупность противомикробных мероприятий, направленных на предупреждение развития инфекционного заболевания во время медицинских вмешательств или нарушений технологического процесса при микробиологических исследованиях и производстве различных материалов.
В медицинской практике асептические условия создаются при производстве хирургических вмешательств, приеме родов, эндоскопических процедурах, парентеральном введении лекарств и других медицинских вмешательствах, а также при больничном содержании лиц с высоким риском развития инфекции. Для этого инструментарий, перевязочный и шовный материал, инъекционные растворы, халаты, маски, перчатки, дренажи и другие соприкасающиеся с раной объекты стерилизуют; руки лиц, принимающих участие в медицинском вмешательстве, операционное поле пациента подвергают антисептической обработке; воздух помещений, в которых проводят асептические мероприятия, и все, что в них находится, дезинфицируют; асептическая зона с помощью шлюзов или аналогичных приспособлений изолируется от смежных помещений.
В микробиологической практике асептика включает: 1) забор материала для исследования стерильным инструментарием и в стерильную посуду в условиях, исключающих его микробную контаминацию посторонней микрофлорой; 2) предупреждение контаминации материала во время его доставки в лабораторию; 3) использование стерильных петель, пипеток, питательных сред, посуды, реактивов и других объектов в процессе микробиологических исследований; 4) предупреждение контаминации микробных культур с рук, волос, одежды лабораторного работника, а также с нестерильных объектов внешней среды; 5) работу в стерильных боксах, ламинарном потоке стерильного воздуха, в зоне пламени спиртовки или газовой горелки. Несоблюдение указанных мер приводит к неправильному заключению о виде выделенной культуры и ее свойствах, что, в свою очередь, ведет к ошибочному диагнозу и неадекватным мерам терапии и профилактики.
III. Заключение
По совокупности признаков в сравнении со свойствами эталонных (типовых) штаммов указывается вид выделенного из материала микроорганизма.
Оценка метода:
Достоинства: относительно высокая чувствительность и точность, возможность определить численность микробов в исследуемом материале, а также чувствительность к антибиотикам.
Недостатки: относительная длительность, метод дорогостоящий.
ФЕРМЕНТЫ-ТОКСИНЫ
Гемолизины - ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают 7 b 0-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний, 7a 0-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как 7 g 0-гемолиз.
Цитотоксины- ферменты оказывающие токсический эффект на клетки мишени. Цитотоксичность токсина В анаэробных микроорганизмов определяют на культуре клеток. С этой целью 1 гр испражнений разводят в фосфатном буфере 1:1О вес/объем, центрифугируют 3О минут при 4ООО об/мин. Супернатант фильтруют на фильтре 2О нм и вносят в монослой культуры клеток МакКоя и инкубируют при 37 5о 0С 24-48 часов до достижения токсического эффекта (округление клеток).
Иммунохимическое определение продукции токсинов. Используется, как правило, иммуноферментный метод определения многих экзотоксинов - дифтерийного, холерного, стафилококкового и др. Для этого применяются тест-системы на основе моноклональных антител к определенному экзотоксину.
Плазмокоагулаза - фермент, свертывающий плазму крови животных. Определяют в пробирочной реакции. В 1 мл цитратной плазмы кролика или человека (цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором) размешивают петлю суточной агаровой культуры микроба. Смесь инкубируют в термостате при 37 5о 0С. В положительных случаях через 2-4 часа плазма свертывается (появляется сгусток).
Лецитиназа - см. выше.
ОКСИДО-РЕДУКТАЗЫ
1. Определение оксидаз. На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 минуты).
2. Определение каталазы. Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки водорода.
3. Определение дегидраз. О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки). К столбику сахарного агара (донатор водорода) добавляют краситель (акцептор водорода) и засевают микробную культуру уколом. В положительных случаях растущий на такой среде микроб ее обесцвечивает.
4. Определение спектра коротко-цепочечных жирных кислот (КЦЖК). Анаэробные микроорганизмы продуцируют промежуточные продукты включающие короткоцепочечные жирные кислоты и спирты, спектр (профиль) которых различен у разных видов микроорганизмов и позволяет проводить идентификацию микроорганизмов до уровня рода.
Наиболее часто исследуют уксусную, пропионовую, бутиловую, изобутиловую, валериановую, изовалериановую, капроновую и изокапроновую аминокислоты. Для определения КЦЖК используют метод газо-жидкостной хроматографии. Идентифицируют такие микроорганизмы как актиномицеты, пропионобактерии, эубактерии, бифидобактерии, клостридии (перфрингенс, спорогенес, дифициле, тертиум).
В последние годы в бактериологических лабораториях применяются коммерчески выпускаемые тест-системы для быстрой биохимической идентификации (для определения биохимической активности разных групп микроорганизмов: например, 2О тестов для энтеробактерий и 3O тестов для анаэробов. Схема идентификации включает следующие этапы:
Колонии---Приготовление---Внесение---Инкубация---Учет(+ -)—Интерсуспензии-- суспензии 4 часа 37 5о 0С –претация в среду
В качестве материала для идентификации используют хорошо изолированную колонию на чашке или чистую культуру в пробирке, из которой готовят суспензию в концентрации стандарта оптической плотности N4, затем по 55 мкл данной суспензии вносят в лунки со средами данной тест-системы. Планшета со стрипами инкубируется при 35 5о 0С 4 часа. Учет может осуществляться либо автоматически (используя прибор АТB) или визуально. Результат биохимической реакции оценивают в виде + или - и вносят в референс-таблицу, в которой положительному результату соответствует численное выражение, в результате чего получается определенный числовой профиль, соответствующий специально разработанному индексу аналитического профиля, позволяющему быстро идентифицировать тот или иной микроорганизм.
К АНТИБИОТИКАМ
Для определения чувствительности микроорганизмов применяют три метода: диффузии препарата в агар из бумажных дисков, серийных разведений в бульоне и в плотной питательной среде. Имеются также ускоренные методы.
В качестве критерия чувствительности микробов к антибиотикам избирают их терапевтические концентрации в крови и др. биотопах животного организма после введения определенных доз препарата. Мерой чувствительности микробов является минимальная концентрация препарата (мкг/ед/мл), которая подавляет рост микробов на питательных средах в стандартных условиях постановки опыта (минимальная подавляющая концентрация - МПК).
Метод бумажных дисков
Для проведения этого метода нужны стандартные заводские диски, пропитанные антибиотиками в определенной концентрации и стандартная питательная среда. Из суточной микробной культуры готовят взвесь на физрастворе густой 1 млрд. микробных тел. в 1 мл, которую затем разводят в 10 раз. На поверхность плотной среды наливают 1-2 мл указанной культуры и покачиванием чашки равномерно распределяют ее по всей поверхности среды. Остаток удаляют пипеткой. Среду подсушивают 10-15 мин при комнатной температуре, после чего на поверхность газона стерильным пинцетом накладывают диски (не более 6 на чашку) на расстоянии 2 см друг от друга и от краев чашки. Инкубируют в термостате при 37 5о 0С - 24 часа.
Учет: в падающем свете на фоне темной поверхности измеряют диаметр (с учетом диаметра диска) задержки роста. Оценку результатов проводят по специальной таблице путем сопоставления диаметра зон задержки роста испытанной культуры с пограничными значениями диаметра зоны в таблице. Культуру относят к одной из трех категорий: чувствительная, умеренно-устойчивая и устойчивая. Указанные категории предложены клинической химиотерапией исходя из отношения между МПК и концентрацией препарата в крови при введении терапевтических доз. К чувствительным относят культуры, рост которых подавляется концентрациями препарата, создаваемыми в сыворотке крови больного в процессе назначения обычных доз антибиотика. Умеренно-устойчивыми считаются культуры, подавляемые концентрациями, которые могут быть достигнуты при введении максимальных доз препарата. Устойчивые - культуры, рост которых не подавляется при введении даже максимально допустимых доз препарата.
Указанный метод является полуколичественным. Для получения количественных результатов используют методы серийных разведений.
Питательной среде.
Этот метод более чувствителен и точен. Каждый антибиотик испытывают в трех концентрациях (исходя из уровней чувствительности микроорганизмов), которые добавляют к расплавленному и охлажденному агару. Агар с антибиотиками разливают в три чашки Петри (по одной чашке на каждую концентрацию). Контролем служит чашка с агаром без антибиотика. Посев производят петлей или лучше штампом-репликатором, который позволяет одновременно определить чувствительность к трем концентрациям антибиотика 25-50 культур (в зависимости от числа лунок в штампе). Учет производят спустя сутки роста в термостате. Культура считается чувствительной, если на месте посева нет ни одной колонии. Микроорганизмы, рост которых подавлен всеми 3 концентрациями, рассматривают как чувствительные (в этом случае можно применять антибиотик в терапевтической дозе) - 2-й и 3-й концентрациями, как среднечувствительные (антибиотик можно применять только в увеличенной дозе) - 3-й; как умеренно-устойчивые микроорганизмы (антибиотик можно применять только местно), растущие на всех трех концентрациях относят к устойчивым (антибиотик нельзя применять).
Для примера приведем схему определения чувствительности культуры к пенициллину .
| Концентрация, в ед/мл | МПК | Оценка | ||||
| Антибиотик | Контроль | чувствительности | ||||
| 0.25 | 16 | 128 | в ед/мл | культуры | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| ПЕНИЦИЛЛИН | - | - | - | + | 7, 00, 25 | Чувствительная |
| + | - | - | + | 16 | Средне | |
| чувствительная | ||||||
| + | + | - | + | 128 | Умеренно | |
| устойчивая | ||||||
| + | + | + | + | > 128 | Устойчивая | |
(+) - есть рост микроба, (-) - нет роста
Ускоренные методы
Позволяют получить результат через 3-4 часа. Чаще всего пользуются методом, основанным на изменении окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) среды в процессе роста микроба в присутствии антибиотика.
Ход работы: при использовании метода бумажных исков или серийных разведений антибиотика в агаре через 4-6 часов роста культуры поверхность чашки обрабатывают индикатором, реагирующим на ОВП среды (тетразолий хлорид). В местах роста микроба среда окрашивается в красный цвет, при отсутствии роста микроба цвет среды не меняется. Учет и критерии оценки, как и при обычных методах.
В последние годы разработана специальная тест-система ускоренного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, основанного на посеве теста микроба в жидкую среду, инкубацией 4-6 часов с последующим определением турбидиметрическим методом прироста мутности раствора опытных образцов в сравнении с контрольными.
Серологическая диагностика
Серологическая диагностика начинается с получения сывороток от больных. В них обнаруживаются антитела в реакции агглютинации, гемагглютинации или РСК. Диагноз основан на обнаружении антител в диагностическом титре или нарастании титра антител в динамике болезни.
Диагностика кишечных эшерихиозов (колиэнтеритов).
Цель: выделение чистой культуры эшерихий и отличие ее от условно-патогенных представителей нормальной микрофлоры кишечника.
Метод: бактериологический.
Материал для исследования: фекальные массы.
Схема: 1 - посев на среду Эндо (Левина)
2а - обнаружение окрашенных колоний, микроскопия их по Граму
2б - предварительная дифференциация патогенных эшерихий от условно-патогенных: постановка РА на стекле со смесью сывороток к патогенным серогруппам
2в - положительно реагирующая в реакции агглютинации колония отсевается на среду Олькеницкого
3а - учет изменения среды Олькеницкого: посинение и разрыв всей среды
3б - определение чистоты выделенной культуры
3в - определение серовара патогенной эшерихии (путем постановки р. агглютинации с отдельными ОК-сыворотками на стекле и в пробирках) с живой (определение К-антигена) и убитой кипячением (определение О-антигена) культурой
3г - проба на индол, подвижность и чувствительность к антибиотикам
Серологический метод - постановка реакции агглютинации с сывороткой больного (на 2-ой неделе заболевания).
Бактериологический метод.
Материал для исследования см. выше.
Схема работы (выделение гемокультуры):
1 - посев 10 мл венозной крови в среду Раппопорта;
2а - учет среды Раппопорта: покраснение среды без газа в поплавке - возбудитель брюшного тифа, покраснение с газом в поплавке - возбудители паратифов или сальмонеллезов;
2б - микроскопия роста;
2в - пересев на среды Левина или Плоскирева;
3а - обнаружение бесцветных колоний на этих средах;
3б - микроскопия колоний;
3в - пересев на среду Олькеницкого;
4а - учет роста на среде Олькеницкого (см. выше);
4б - определение чистоты выделенной культуры;
4в - установление антигенной структуры: сначала в РА на стекле с монорецепторными сыворотками к О-антигенам: для группы А - О2, группы В - О4, 5; Д - Н-О9. Затем в такой же реакции с сыворотками к специфическим антигенам (в пределах данной группы);
4г - определение дополнительных биохимических и морфологических свойств (разло-жение индола, подвижность);
4д - определение чувствительности к поливалентным видоспецифическим бактриофагам;
4е - определение чувствительности к антибиотикам.
Ход исследования
I этап - материал засевают петлей или тампоном на одну из плотных элективных сред (Эндо, Плоскирева, висмутсульфитагар). Посевы инкубируют в течение 24 часов при 37 5о 0С, а затем дополнительно 24 часа при 20-22 5о 0С.
Одновременно испражнения засевают в одну из сред накопления (МПБ или пептонную воду). Кровь засевают в соотношении 1:10 только в среды накопления. Посевы помещают при 4-5 5о 0С и выдерживают до 30 суток, периодически высевая через каждые 3-5 дней на плотные элективные среды. Y. enterocolitica при низкой температуре размножаются в этих средах, в то время как сальмонеллы, шигеллы, кишечная палочка, протей не размножаются.
II этап - Просматривают посевы на плотных средах и отбирают подозрительные колонии (округлые, величиной от 0,5 до 2 мм в диаметре, сероватого цвета на Эндо и Плоскирева и коричневого на висмутсульфитагаре). Из колоний делают мазки по Граму и при наличии грам- палочек отсевают на среду Ресселя.
III этап - при изменении цвета столбика на среде Ресселя из роста на ней делают мазок по Граму на чистоту и изучают следующие тесты:
| ВИД | Лак- | Глю- | Подвижность | Саха- | Ман- | Сор- | Уре- | Рам- | Араби- | |
| МИКРОБА | тоза | коза | 220С | 370С | роза | нит | бит | аза | ноза | ноза |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| S.enterocolitia | - | + | + | - | + | + | + | + | - | + |
| Salmonella | - | + | + | + | - | + | + | - | + | + |
| Shigella | - | + | - | - | - | + | - | - | + | + |
IV этап - Учет результатов и выдача окончательного ответа.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
Пищевые отравления - острые системные заболевания, возникающие в результате приема в пищу продуктов, массивно обсемененных микроорганизмами или содержащих микробные экзотоксины. Пищевые отравления бактериальной природы подразделяются на пищевые токсикоинфекции и пищевые токсикозы (интоксикации), а также отравления смешанной этиологии.
1. Пищевые токсикоинфекции (ПТИ) - острые кишечные заболевания с инфекционным воспалением кишечника, возникающие в результате употребления в пищу массивно обсемененных некоторыми бактериями продуктов. Возбудителями могут быть условно-патогенные представители семейства Enterobacteriaceae - E.сoli, Рroteus (P. vulgaris, mirabilis, Morganella morganii), Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella pneumoniae; семейства Vibrionaceae - V. parahaemoliticus; семейства Bacillaceae - B. cereus, C. perfringens серотипа А; семейства Streptococcaceae - S. faecalis; семейства Pseudomonadaceae - P. aeruginosa и др.
После приема пищи возбудитель бурно размножается в тонком кишечнике, проникает в лимфоидный аппарат, где происходит его массовая гибель с выделением эндотоксина. Эндотоксин вызывает поражение интрамурального нервного аппарата кишечника и клеток ЦНС, сосудов, а бактерии вызывают воспалительный процесс в кишечной стенке. Заболевание начинается внезапно с тошноты, рвоты, поноса, болей в животе и общих симптомов: головная боль, падение сердечной деятельности, вплоть до коллапса.
По типу ПТИ могут протекать заболевания, вызываемые энтеропатогенными эшерихиями, сальмонеллами, шигеллами (S. sonnei) и иерсиниями (Y. enterocolitica). При этих инфекциях клинический диагноз ставится соответственно их нозологической форме: колиэнтерит, сальмонеллез, дизентерия, иерсиниоз. Этот диагноз устанавливается после выделения из исследуемого материала (испражнения, моча, рвотные массы, остатки пищи) соответствующего возбудителя.
2. Пищевые микробные токсикозы (интоксикации) - острые заболевания, возникающие при употреблении в пищу продуктов, в которых в результате массивного размножения микробов содержится большое количество экзотоксина. К ним относят ботулизм, токсикозы, вызванные стафилококковым энтеротоксином и токсинами микроскопических грибов. При этих формах пищевого отравления патогенез заболевания и его клинические проявления обусловлены действием микробного экзотоксина. Микробные экзотоксины не разрушаются при кипячении, устойчивы к пищеварительным ферментам и кислому содержимому желудка.
Пищевые отравления часто носят групповой характер. Каждый случай пищевого отравления подлежит обязательному санитарно-эпидемиологическому расследованию с целью установления причин заболевания и разработки мер ликвидации вспышки и профилактики. Расследование пищевых отравлений производится немедленно с участием санитарного врача по гигиене питания или главврача СЭС и врача-бактериолога.
Для исследования от больных забирают рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, мочу, кровь, а также секционный материал (в случае летального исхода). Одновременно производят отбор остатков подозреваемой пищи (употребленной заболевшим), исходных продуктов и полуфабрикатов, которые использовались при её приготовлении, суточных проб пищи, а также смывов и соскобов с кухонного инвентаря.
Для постановки этиологического диагноза бактериологическое исследование одновременно ведут в нескольких направлениях: на облигатно-патогенные и условно-патогенные энтеробактерии и вибрионы, стафилококки, стрептококки, бациллы, а также (по показаниям) - на обнаружение возбудителей и токсинов ботулизма. Стерильно взятый жидкий материал после отстаивания засевают без обработки. Плотный материал гомогенизируют в 0,1% пептонной воде в соотношении 1:2, 1:5 и засевают надосадок.
При бактериологической диагностике ПТИ, вызванной условно-патогенными микробами, применяют количественный метод. Готовят разведения материала (10 , 10 , 10 ) и засевают по 0,1 мл на чашки с дифференциально-диагностическими средами: Плоскирева, Эндо (Левина) - на энтеробактерии; ЖСА с полимиксином и 2,3,5-триметилтетразолий хлоридом - на B. cereus; МПА с фурагином - на псевдомонады; щелочной агар - на вибрионы. При стафилококковом токсикозе производят посев на ЖСА.
При наличии роста колоний, подозрительных на патогенные энтеробактерии, дальнейшие исследования ведут по их выделению и идентификации. При отсутствии роста облигатно-патогенных микробов изучают характер колоний УПМ на указанных средах. Определяют количество бактерий в 1 г материала. Выделяют чистые культуры и подвергают их идентификации и внутривидовому типированию.
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Выделение из материалов сальмонелл, шигелл, энтеропатогенных кишечных палочек, иерсиний или других облигатно-патогенных микробов, независимо от количества, подтверждают соответствующее заболевание или носительство.
Для оценки этиологической роли УПМ главным критерием является количественный. Этиологически значимым является присутствие в материалах от больных и пищевых продуктах микробов в большом количестве (10 -10 и более КОЕ в 1 г). При пищевых отравлениях диагноз становится более достоверным при одновременном обнаружении тех же микробов в больших количествах в пищевых продуктах, явившихся причиной заболевания. Этиологическую роль микроба подтверждает его повторное выделение из материала больного, идентичность штаммов возбудителя (по фаго- и сероварам) у большого числа больных при групповом пищевом отравлении, а также нарастание титра антител в динамике болезни.
Для диагностики пищевых токсикозов используют методы обнаружения в материалах от больных (рвотных массах, промывных водах), в пищевых продуктах экзотоксинов микробов. При ботулизме с этой целью применяют биологическую пробу нейтрализации на белых мышах с антисыворотками к ботулотоксинам различных типов (А,В,Е), чаще встречающихся в умеренных широтах. При стафилококковом токсикозе используют РПГА с эритроцитами, обработанными содержащими экзотоксин материалами и типовыми стафилококковыми антисыворотками. Применяется также реакция иммунопреципитации экстрагированного из материала токсина (солевой экстракт, очищенный и концентрированный диализом) со стандартными типовыми антисыворотками.
К Л Е Б С И Е Л Л Ы.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СКЛЕРОМЫ И ОЗЕНЫ.
Бактерии рода Klebsiella (капсульные бактерии) включают в семейство Enterobacteriaceae. K. scleromatis является возбудителем склеромы, K. ozaenae - возбудитель озены, K. pneumoniae способен при определенных условиях вызывать у человека сепсис, воспаление легких, острые кишечные заболевания, пиелонефрит, цистит, перитонит, менингит и др.
Клебсиеллы - это палочки длиной 1-5 мкм, эллипсоидные, неподвижные, без спор, капсула является у них постоянной структурой. Они растут на плотных средах в виде блестящих, влажных, серовато-белых колоний с перламутровым оттенком, слизистой консистенции. В бульоне - диффузное помутнение, иногда слизистое кольцо на поверхности. У клебсиелл слабо выражены протеолитические свойства и относительно хорошо гликолитические.
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КЛЕБСИЕЛЛ.
| КЛЕБСИЕЛЛА | |||||
| К.СКЛЕРОМЫ | К. ОЗЕНЫ | К.ПНЕВМОНИИ | |||
| ПРИЗНАКИ | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | ||
| ГЛЮКОЗА С ГАЗОМ | - | +/- | + | ||
| ЛАКТОЗА | - | +/- | + | ||
| САХАРОЗА (4 СУТОК) | + | +/- | + | ||
| ЦИТРАТ АММОНИЯ | - | +/- | + | ||
| (СРЕДА СИММОНСА) | |||||
| МОЧЕВИНА | - | -/+ | + | ||
| МАЛОНАТ НАТРИЯ | + | - | + | ||
Клебсиеллы содержат К - капсульный, О - соматический, СА - общий для энтеробактерий антиген. Род разделяется на 80 серологических вариантов. У клебсиелл склеромы обнаружен только один К3-антиген, идентичный с К-антигеном клебсиеллы пневмонии 3-го типа. У К.озены - К4, К5, либо К6-антигены. Клебсиеллы пневмонии - К-антигены 1-3 и 7-80. Известно 5 О-антигенов. К. склеромы имеют антиген О2А, К. озены - О2В, К. пневмонии -
О-антигены 1, 3, 4, 5.
Питательные среды:
1) Дифференциально-диагностическая среда - ЛБТА (лактозо-бромтимоловый агар). Содержит МПА+лактоза+бромтимоловый синий. К. склеромы, не разлагающая лактозу, дает колонии цвета среды, К. пневмонии - желтые, К. озены - либо желтые, либо цвета среды.
2) Модифицированная среда Ресселя кроме глюкозы (в столбике) и лактозы (в скосе) содержит индикатор бромтимоловый синий, Соль Мора и гипосульфит (на H 42 0S). К. склеромы дают пожелтение только столбика, К. пневмонии - пожелтение и разрыв всей среды, К. озены - различные варианты.
3) Среда Симмонса для утилизации цитрата натрия (индикатор бромтимоловый синий). В положительных случаях появляется рост и среда синеет, в отрицательных случаях роста нет и среда не изменяется.
4) Среда с малонатом натрия (индикатор бромтимоловый синий). При утилизации малоната - среда интенсивно синего цвета, отрицательная реакция - среда желтая.
Лабораторная диагностика проводится 2 методами: бактериологический и серологический.
Бактериологическая диагностика: материалом для исследования служит содержимое носа, глотки, носоглотки.
I этап. Посев материала петлей или тампоном на ЛБТА либо на пенициллиновый агар.
II этап. а) Учет роста колонии клебсиелл - крупные, выпуклые, влажные, блестящие. На ЛБТА цвет колоний зависит от вида клебсиелл.
б) Посев колоний на модифицированную среду Ресселя или косой агар.
III этап. Идентификация выделенной культуры. а) мазок по Граму; б) препарат по Гинса-Бурри; в) определение биохимических свойств (см. таблицу); г) определение антигенной формулы с помощью клебсиеллезных сывороток О и К (р. агглютинации на стекле, р. агглютинации в пробирках, РИФ)
Серологическая диагностика. Используют РСК и РПГА со склеромным и озенозным диагностикумами.
ДИАГНОСТИКА СТОЛБНЯКА
Возбудитель столбняка - Cl. tetani - крупная тонкая палочка с круглой спорой на конце (барабанная палочка), грам+, подвижная, без капсулы. Обладает слабыми протеолитическими свойствами.
Диагностика проводится по той же схеме, что и газовая гангрена. Наибольшее значение имеет биопроба на мышах и опыт нейтрализации. Картина экспериментального столбняка: хвост мыши становится ригидным, задняя конечность вытягивается, туловище искривляется (восходящий столбняк), животное погибает.
Для ускоренного выделения палочек столбняка используют засев материала (или смешанной культуры со среды Китта-Тароцци) конденсационную воду скошенной свернутой сыворотки(метод Филдса). Благодаря активной подвижности клостридий столбняка за 24 часа вырастают на верхней части косяка. Культура исследуется микроскопически и ею заражают белых мышей.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ.
Кампилобактерии - род Campylobacter семейства Spirillaceae - это тонкие изогнутые грам- палочки, образующие один или несколько завитков, могут быть S-образными или похожими на «крылья чайки». Толщина клеток - 0,2-0,5 мкм, длина - 0,5-8 мкм. Спор и капсул не образуют, подвижны, имеют полярно расположенный жгутик на одном конце или по жгутику на обоих концах клетки. Для них характерны быстрые винтообразные движения. Хемоорганотрофы, микроаэрофилы (растут при пониженном парциальном давлении кислорода).
Род включает более 10 видов. Некоторые виды патогенны для человека, вызывают кишечный кампилобактериоз. Патогенные виды отличаются от непатогенных продукцией каталазы. Каталаза-отрицательные кампилобактерии входят в состав нормальной микрофлоры полости рта и кишечника человека и различных животных.
Наибольшее значение в развитии заболеваний у людей имеет C. jejuni (95%), реже - C. coli, еще реже - C. fetus и C. laridis. Заболеваемость кампилобактериозом носит спорадический характер, возникает при употреблении в пищу инфицированного мяса птицы, телят, свиней, могут быть вспышки молочного или водного характера. Болеют дети и взрослые, в наибольшей степени заболеванию подвержены дети в возрасте до 4 лет ( в 90% случаев).
Кампилобактерии поражают тонкий кишечник. Они прикрепляются к поверхности энтероцитов, оказывают цитотоксическое действие (выделяют энтеротоксин); обладают высокой инвазивностью, что приводит к бактериемии (у ослабленных лиц может быть сепсис). Клинически заболевание проявляется острым гастроэнтеритом, который по тяжести варьирует от кратковременной диареи до тяжелого кровавого поноса с высокой температурой и явлениями интоксикации. Летальность невелика. Иммунитет изучен плохо.
Диагностика кампилобактериоза может проводиться по короткой или полной схеме. Материал - испражнения, рвотные массы, ПВЖ (промывные воды желудка).
Короткая схема включает широкое бактериоскопическое исследование :
* фазовоконтрастную микроскопию для выявления подвижности (клетка сжимается в кольцо и разжимается как пружина),
* простую окраску препаратов (окрашиваются анилиновыми красителями за 20 секунд, энтеробактерии - за 2-3 минуты),
* окраску по Граму (выявление характерной морфологии).
На практике при наличии характерной клиники (диареи) достаточно короткой схемы исследования.
Полная схема (бактериологический метод) проводится только с материалами, в которых при микроскопии обнаружены кампилобактерии. При этом, во многих случаях достаточно идентификации до группы C. Jejuni - coli. При проведении исследования необходимы условия:
1. Наличие высококачественных питательных сред, содержащих редуцирующие вещества (активированный уголь), витамины, 5% лизированной крови (источник гемина), 5% свежей крови (эритроциты - дополнительный сорбент метаболитов), антибиотики (амфоте-рицин и др.) для подавления сопутствующей микрофлоры.
2. Культивирование в присутствии СО 42 0 или специальных газовых смесей (5% кислорода, 10% СО 42 0, любой инертный газ). Можно использовать эксикаторы со свечей или надувать двойные полиэтиленовые пакеты выдыхаемым воздухом.
3. Культивирование при различных температурах (25 5o 0, 30 5o 0, 37 5o 0, 42 5o 0 С) и дифференциация по чувствительности к налидиксовой кислоте и цефалотину. При наличии роста нежных полупрозрачных колоний грам- подвижных палочек при 420С, чувствительных к налидиксовой кислоте и устойчивых к цефалотину, выдается ответ: C.jejuni-coli.
В начале 80-х годов были выделены так называемые «желудочные» кампилобактерии, обозначенные как C. pyloridis. В дальнейшем они были исключены из рода Campylo-bacter и получили название Helicobacter pylori. Отличаются от кампилобактерий внутриклеточным паразитизмом и продукцией уреазы (кампилобактерии уреазу не продуцируют). Обладают цитотропизмом к клеткам эпителия желудка и кишечника, являются возбудителями язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки. По современным представлениям, язвенная болезнь в 99% случаев - это хеликобактериоз.
Лабораторная диагностика хеликобактериоза несколько отличается от кампилобактериоза :
1. Материал для исследования - биоптаты.
2. Гомогенизация материала.
3. Почти не применяется бактериологический метод.
Для диагностики используется комплексная микроскопия и определение уреазы в исследуемом материале. Хеликобактеры плохо красятся по Граму и не красятся простыми методам, поэтому используют специальные методы окраски, а также проводят исследования в фазово-контрастном и люминесцентном микроскопе.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
1. Бактериоскопический метод - выявление хламидий, их морфологических структур и антигенов в пораженных клетках (клиническом материале).
Материал - соскобные препараты с доступных исследованию слизистых оболочек мочеполового тракта ( уретра, шейка матки и т.п.) и других органов (конъюнктива, прямая кишка и пр.) при экстрагенитальных формах. Из материала готовят мазки, которые окрашивают по Романовскому-Гимзе. Цитоплазматические включения хламидий (тельца Гальберштедтера-Провачека) содержат или крупные ретикулярные тельца или мелкие элементарные тельца. По цвету и внутренней структуре отличаются от ядра клетки и цитоплазмы. Метод характеризуется сравнительно низкой чувствительностью, позволяет диагностировать 10-20% случаев урогенитальной инфекции; при хламидийной патологии глаз чувствительность 90-100%.
Применение люминисцирующих поликлональных и моноклональных антител для выявления антигенов хламидий в цитоплазматических включениях в соскобных препаратах урогенитального тракта значительно увеличивает чувствительность и специфичность метода. Используется как прямой, так и непрямой иммунофлуоресцентный метод. При люминесцентной микроскопии антигены хламидий выявляют на красном или оранжевом фоне (при контрастировании синькой Эванса или родамином) цитоплазмы эпителиальных клеток в виде внутриклеточных включений ярко-зеленого цвета. По информативности и чувствительности уступает только бактериологическому методу.
При диагностике орнитоза и других зоонозных хламидиозов бактериоскопический метод не применяется.
2. Бактериологический метод. Выделение хламидий из инфекционного материала проводится заражением куриных эмбрионов, лабораторных животных или клеточных культур с последующей индикацией возбудителя. Материал тот же, что и при бактериоскопии. При орнитозе - кровь или мокрота. Кровь из вены (не менее 5 мл) исследуют в первые 7-10 дней заболевания, мокроту - до 14 дня заболевания. Для удаления сопутствующей микрофлоры добавляют антибиотики, не действующие на хламидии. (стрептомицин, нистатин, гентамицин). При заражении куриного эмбриона исследуемый материал вводят в желточный мешок 6-7 суточного развивающегося эмбриона. Обычно заражают 8-10 эмбрионов на 1 исследуемую пробу. При отсутствии специфической гибели эмбрионов спустя 4-10 суток после заражения под контролем бактериоскопии делают до 3 слепых пассажей.
Идентификация. Первичную идентификацию хламидий проводят на основании обнаружения типичных цитоплазматических включений, содержащих элементарные, ретикулярные тельца, и выявлении в их составе родоспецифического антигена (мазки-отпечатки из желточных мешков куриных эмбрионов - окраска по Маккиавелло, прямая и непрямая РИФ). При выделении хламидий в культурах клеток (HeLa), идентификация основана на выявлении в зараженных клетках типичных цитоплазматических включений (микроскопия с окраской по Гимзе), и родоспецифического антигена (РИФ). Оценку заражения клеток проводят через 48 - 72 часа.
При диагностике орнитоза кроме культур клеток можно заражать лабораторных животных в мозг или внутрибрюшинно.
3. Серологический метод. Антитела выявляют в сыворотке крови (исследуют 2-3 раза с интервалом 10-14 дней) и секретах половых органов. Используют для диагностики РСК, РПГА, РИФ, ИФА. Диагностически значимыми являются титры 1:32-1:64 при урогенитальных хламидиозах, 1:160 - при генерализованных инфекциях. Наиболее достоверным является нарастание титра антител в 4 и более раза. Специфические Ig M и Ig A обнаруживаются в секретах половых желез в титрах >1:8, Ig G - >1:256.
4. Кожно-аллергическая проба. Используется при диагностике орнитоза с орнитозным аллергеном. Внутрикожная проба становится положительной с первых дней заболевания у 87-95% больных, сохраняясь до года и более.
МИКОПЛАЗМЫ. МИКОПЛАЗМОЗЫ
Микоплазмы - мельчайшие среди живущих прокариотических микроорганизмов, способные к самостоятельному метаболизму и репродукции. Относятся к отдельному классу Mollicutes («мягкокожие»)
В настоящее время описано свыше 100 видов М., отнесенных к трем порядкам. Наибольшее значение в патологии человека имеют М. семейства Micoplasmataceae. В состав этого семейства входят 2 рода:
1. Mycoplasma (более 70 видов);
2. Ureoplasma (2 вида).
Среди микоплазм имеются как свободноживущие (сапрофиты), так и поражающие млекопитающих, птиц, насекомых, а также растения. Размер М. 0,15 - 0,3 мкм. Они полностью лишены клеточной стенки и ее дериватов. Однако они способны размножаться на бесклеточных питательных средах, где образуют характерные колонии.
Клетки М. полиморфные - шарообразные, мелко зернистые, звездчатые, нитевидные. Размножение - бинарное деление, возможна фрагментация нитей, почкование. Имеются микоплазмы, обладающие скользящей подвижностью (подобно амебе), некоторые обладают жгутиками.
М. окружена 3-хслойной липопротеиновой мембраной, которая состоит из стериновых липидов, что отличает их от других прокариотов и сближает с эукариотами. Отсюда потребность микоплазм в стироле для роста и синтеза мембран. ЦПМ выполняет одновременно функции клеточной стенки и собственно мембраны и несет ряд важнейших физиологических функций: регулирует процессы метаболизма, энергетический обмен, рецепцию токсинов, обеспечивает адсорбцию эритроцитов, сперматозоидов, эпителиальных и др. клеток.
Отсутствие клеточной стенки определяет отличительные свойства микоплазм: чрезвычайную пластичность, полиморфизм, чувствительность к лизису под влиянием осмотического шока, алкоголя, детергентов, фильтруемость через мембранные фильтры, устойчивость к антибактериальным препаратам, действующим на клеточную стенку.
На агаризованных питательных средах М. образуют небольшие колонии похожие на яичницу-глазунью (10-200 мкм) в зависимости от вида.
Недостаток белков - ферментов ограничивает число метаболических путей, поэтому микоплазмы крайне чувствительны к питательным средам, в состав которых обязательно должны входить: пуриновые и пиримидиновые основания, аминокислоты, витамины, липиды, в том числе стероиды.
Паразитируя в организме хозяина, они потребляют эти вещества непосредственно из тканей организма-хозяина.
Заболевания, вызываемые микоплазмами - микоплазмозы относятся к одним из наиболее часто встречающихся заболеваний. Это ОРЗ до 10% всех случаев (основные возбудители M. pneumoniae и M. hominis); пневмонии - около 20% всех пневмоний (M. pneumoniae, hoominis); внереспираторные проявления респираторного микоплазмоза: миокардиты, перикардиты, неврологические проявления (неврит, менингоэнцефалит и др.), нефрит, отит, синусит.
Урогенитальные микоплазмозы занимают значительное место среди болезней, передающихся половым путем. Основные возбудители: М. hominis, M. genitalium, M. fermentans. Микоплазменная инфекция у мужчин может быть причиной уретритов, простатитов, у женщин - вагинитов, цевицитов, осложнений беременности (самопроизвольные выкидыши, преждевременные роды, послеродовой сепсис). С микоплазменной инфекцией многие связывают нарушение репродуктивной функции мужчин и женщин.
ОБЩАЯ И ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ МИКОЗОВ.
КЛАССИФИКАЦИЯ ГРИБОВ
1. Ботаническая - за основу берется строение органов полового воспроизводства и внешний вид гриба.
Номенклатура бинарная. По ботанической классификации - 6 классов:
1. Оомицеты - непатогенные, низшие грибы.
2. Хитридиомицеты - непатогенные, с несептированным мицелием.
3. Зигомицеты - несептированные грибы, которые способны вызывать заболевания человека и животных.
4. Аскомицеты (аско - сумка) - септированные грибы, патогенные для человека и животных.
5. Базидомицеты - шляпочные грибы. Могут быть причиной пищевых отравлений. Патогенный для человека род - Criptococcus.
6. Дейтеромицеты - несовершенные грибы, у которых не выявлен половой путь размножения. Их примерно 30% всех грибов.
2. Клиническая классификация (возбудители 2 0родов)
1. Кератомикозы (Trichophyton, Trichosporon).
2. Дерматомикозы (Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton).
3. Кандидозы (Candida).
4. Глубокие микозы (Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces, Criptococcus, Sporot-richum, Mucor, Penicillium, Aspergillus).
5. Псевдомикозы (это бактерии, но клинические проявления заболеваний, как при микозах).
Методы диагностики микозов
Забор материала со свежих развившихся поражений, где больше элементов гриба. Пораженные волосы берутся эпиляционным пинцетом. Элементы гладкой кожи, чешуйки - скальпелем. При поражении ногтей - соскоб скальпелем или отрезается кусочек маникюрными ножницами. Соскобы со слизистой оболочки берутся шпателем. Все остальные материалы - как обычно (при бактериологическом исследовании).
ВОЗБУДИТЕЛИ МАДУРОМИКОЗА
Мадуромикоз (мадурская стопа) - хроническое гранулематозное заболевание, вызываемое актиномицетами (Actinomyces, Nocardia) или грибами (Aspergillus, Madurella). Встречается преимущественно в тропических и субтропических странах. Возбудители проникают в организм из почвы через микротравмы кожи. Процесс локализуется в стопе, реже - в кисти. Болезнь начинается с появления мелких плотных узелков (гранулем), которые в последующем сливаются в один очаг с вовлечением в воспаление кожи, подкожной клетчатки, сухожилий, костей. Гранулематозный очаг распадается с образованием гноя, который через многочисленные свищи вытекает наружу. Наряду с распадом ткани происходит разрастание фиброзной ткани. Пораженная стопа увеличивается в размерах, деформируются, приобретая вид «медвежьей лапы». Болезнь нередко осложняется присоединением гноеродной инфекции. Самостоятельное выздоровление наблюдается редко. Материалом для микробиологического исследования является гной, кусочки биопсированной ткани. В материале отыскивают друзы - бесцветные или пигментированные зерна, из них готовят мазки, как при актиномикозе. Мицелий грибов по сравнению с мицелием актиномицетов толстый (2-5 мкм), ветвистый, септированный, содержит много хламидоспор, друзы пигментированы. Мицелий актиномицетов тонкий (0,5-2,0 мкм), несептированный, ветвящийся. Центр друзы состоит из поли- и мононуклеарных клеток и войлокообразного скопления мицелия, от которого на периферию отходят гифы с реактивно-утолщенными концами («дубинки»). Выделение и идентификация возбудителя проводится, как при актиномикозах и грибковых поражениях кожи. Чистые культуры грибов выделяют на среде Сабуро, пивном сусло-агаре. Выращивание проводят в аэробных и анаэробных условиях, при температурах 20 - 250 С и 370 С. Одновременно материал исследуют на гноеродные бактерии.
ВОЗБУДИТЕЛЬ ПНЕВМОЦИСТОЗА
Пневмоцистоз - заболевание, вызываемое пневмоцистами (Pneumocystis carinii). Одноядерные трофозоиты имеют форму неправильной дольки и варьируют в размерах от 1 до 5 мкм; содержат митохондрии, эндоплазматический ретикулум, различные гранулы и вакуоли. Они размножаются бинарным делением. Более крупные трофозоиты окружаются толстой стенкой, в результате чего формируется циста. В ней происходит деление ядра и цитоплазмы трофозоита с образованием от 2 до 8 клеток (спорозоитов). Диаметр цисты около 10 мкм; когда ее стенка разрывается, спорозоиты выходят и начинается новый цикл размножения трофозоитов.
Пневмоцисты обитают в альвеолах легких здоровых людей (1-10%), прикрепляясь к альвеолярному эпителию. При пневмоцистозе поражаются межальвеолярные перегородки с развитием хронической интерстициальной пневмонии. Альвеолы и бронхиолы, заполняются пенистой массой, в результате чего нарушается газообмен и наступает кислородная недостаточность. Развивается картина хронической пневмонии. Развитие заболевания связано с недостаточностью иммунной системы, что объясняет наиболее частое поражение грудных, особенно недоношенных и ослабленных детей (чаще в закрытых детских коллективах). Возможно длительное носительство. Пневмоцистоз у взрослых осложняет иммунодефицитные состояния (туберкулез, опухоли, СПИД).
Пневмоцистоз - инфекция дыхательных путей с воздушно-капельным механизмом передачи.
Материалом для диагностики служит слизь, полученная методом ларингоскопии, либо катетером, либо при глубоком откашливании (после предварительной ингаляции водяного пара). Материал берут не ранее 2-ой недели болезни. При летальном исходе изучают гистологические среды и мазки-отпечатки легких. Основной метод диагностики - микроскопический. Препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе. Наиболее типично обнаружение восьмиядерных цист паразита. Пневмоцисты приобретают фиолетовый цвет, ядра - темно-синий. Препараты можно обрабатывать также люминесцентной сывороткой.
ВОЗБУДИТЕЛЬ ДОНОВАНОЗА
Это - хроническое инфекционное заболевание, характеризующееся гранулематозными изъязвлениями кожи и подкожной клетчатки в области половых органов и промежности.
Возбудитель открыт Донованом в 1905 г. и назван Calymmatobacterium granulomatosis. Он имеет палочковидную форму с закругленными концами, полиморфен, неподвижен, длина - 1-2 мкм. Типичным для возбудителя является наличие капсулы и расположение внутри фагоцитов. В связи с одиночным, либо биполярным скоплением хроматина палочка приобретает вид «английской булавки».
Для культивирования микроба используют яичные среды, асцит-агар, среду Сабуро, на которых вырастают влажные, прозрачные, блестящие колонии. Можно для выращивания использовать куриные эмбрионы.
Клинические формы. Чаще всего встречается так называемая язвенная форма. Заболевание начинается исподволь и незаметно. Длительность инкубационного времени не определена, чаще - от нескольких дней до нескольких месяцев. На месте входных работ (в области половых органов) появляется папула с диаметром в 5 - 7 см. Папула превращается в язву с мягкими неровными краями. Язвы безболезненны, ярко-розового цвета. Дно язвы имеет зернистую поверхность, иногда видна пленка. Отделяемый экссудат имеет зловонный запах. В результате возможной аутоинфекции могут возникнуть вторичные язвы (на руках, лице). Появляются признаки интоксикации. Возможно метастазирование в печень, селезенку, кости.
Кроме описанной могут быть и другие формы. В частности, при некротической, самой тяжелой форме, наблюдается некроз и гнойный распад тканей с возможным разрушением половых органов.
Эпидемиология. Донованозом болеет только человек, чаще женщины. Заболевание встречается в местах с тропическим климатом, повсеместно, передается половым путем и лишь изредка - бытовым.
Лабораторная диагностика проводится в основном бактериоскопическим методом. Из отделяемого язв готовят мазки, окрашивают по методу Романовского-Гимзе и микроскопируют.
ВОЗБУДИТЕЛЬ ЯЗВЫ БУРУЛИ
Это хронические кожные язвы, наблюдаемые в странах с тропическим и субтропическим климатом. Заболевание впервые описано в Африке, встречается также в странах Азии, Юго-Восточной Азии, США, относительно высокие показатели заболеваемости в Нигерии и Новой Гвинее. Название болезни связано с округом Бурули (Уганда, Африка), где в 1960 году зарегестрированы случаи указанного поражения.
Возбудителем болезни является микроб рода Mycobacterium - Mycobacterium ulcerans. Это - палочки до 2-3 мкм в длину, грамположительные, неподвижные, без спор и капсул. Важным свойством является кислотоустойчивость микроба и расположение его в препарате группами, иногда до 100 особей в группе. Возбудитель растет на средах, используемых для культивирования микобактерий туберкулеза (чаще яичные среды). Для роста необходима температура 330 С, длительность роста - 7 суток. Рост в виде мелких, влажных, бледно-розового цвета колоний.
Заболевание начинается с появления уплотнений чаще на разгибательной поверхности предплечья и голени. В результате распада уплотнений в центре образуются язвы. Язвы чаще одиночные. Края язвы уплотнены и имеют неправильные очертания, глубина язв до 10-15 см. Выделяется сероватый экссудат. Патологоанатомически - некроз колладермы и подкожной клетчатки, обнаруживаются гигантские многоядерные клетки. Исход болезни не однозначный: самопроизвольное излечение, присоединение вторичной инфекции, развитие деформаций и контрактур, требующих хирургического лечения. Основной метод лечения - антибиотикотерапия.
Лабораторная диагностика проводится с использованием бактериоскопического и бактериологического метода. Материал для исследования забирают кюреткой, иногда требуется глубокая биопсия. Из полученного материала готовят препараты с окраской по Циль-Нильсену. Тот же материал засевают на специальные вышеуказанные питательные среды, выделяют чистую культуру с последующей идентификацией.
ВОЗБУДИТЕЛЬ МЕЛИОИДОЗА
Мелиоидоз - эпидемическое особо опасное инфекционное заболевание животных и человека, которое протекает в форме острой или хронической септицемии и сопровождается образованием абсцессов в различных органах и тканях.
Возбудитель - Pseudomonas pseudomallei, грамотрицательная палочка, окрашивается биполярно, размеры 0,5-1x2-6 мкм, подвижны. В материале от больных иногда видно слизистое образование вокруг микробов (ложная капсула). Хемоорганотроф, факультативный анаэроб, нетребователен к питательным средам. Хорошо растет в МПБ и на МПА с добавлением 5% глицерина, при температуре 370 С, рН - 6,8. На агаре может формировать колонии 3-х типов - S, R и М (слизистые), в последующем появляется коричневый пигмент. На МПБ - вначале равномерная муть, потом тонкая пленка, в последующем - толстая, морщинистая пленка. Культуры издают запах плесени, эвкалипта, трюфелей. Сбраживает углеводы до кислоты без газа, выражены протеолитические свойства (разжижает желатин и свернутую сыворотку). Индол и сероводород не образует, обладает выраженными гемолитическими свойствами.
Содержит жгутиковый (Н), соматический (О), оболочечный (К) и слизистый (М) антигены. Содержит эндотоксин (дает эритему в месте введения), 2 термолабильных экзотоксина (летальный фактор и геморрагически-некротический.
Возбудитель проникает в организм через поврежденную кожу и слизистые желудочно-кишечного тракта и верхний дыхательных путей, затем проникает в лимфатические узлы, оттуда в кровь и внутренние органы, в которых образуются гранулемы, в центре гранулемы - некроз.
Лабораторная диагностика
Материал: кровь, моча, мокрота, отделяемое язв и абсцессов, отделяемое глаз, носа, рвотные массы, испражнения, вода и др. Способы забора, упаковки, доставки в лабораторию исследуемого материала такие же как и с другими особо опасными микробами 1-й группы.
Бактериоскопический метод. Готовят мазки из материала и окрашивают по Граму. Подозрительными являются грамотрицательные биполярно окрашенные палочки. Специфичен иммунофлуоресцентный метод обработки и микроскопии препарата.
Бактериологический метод (основной). Посев крови производят в 5% глицериновый бульон с последующим выделением чистой культуры.
Остальной материал обрабатывают пенициллином и засевают на 5% глицериновый МПА с кристаллвиолетом. Выросшие через 1-2 суток колонии пересевают для накопления чистой культуры на скошенный агар и изучают характер роста, подвижность, наличие пигмента, биохимические свойства и антигенную структуру (характеристика дана выше).
Биологический метод. Используют одновременно с бактериологическим. Чувствительные животные - морские свинки и золотистые хомячки. Методы заражения разные - внутрибрюшинно, накожно (через скарифицированную кожу), подкожно, в нос, на конъюнктиву глаза. Наблюдают гибель животных, обязательное поражение лимфатических узлов и внутренних органов (очага некроза). Готовят и микроскопируют мазки-отпечатки.
Серологический метод. Имеет вспомогательное значение. С сывороткой крови больного ставят РА (диагностический титр 1:640), РСК (диагностический титр 1:20), РПГА, которые недостаточно специфичны. Более надежно определить динамику нарастания титра антител.
О Г Л А В Л Е Н И Е
В В Е Д Е Н И Е
ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
1. Микроскопический (бактериоскопический) метод исследования.
2. Противомикробные мероприятия (стерилизация, дезинфекция, антисептика, асептика).
3. Классификация питательных сред.
4. Культуральный метод исследования.
5. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.
6. Схема выделения чистой культуры клостридиальных анаэробов.
7. Схема выделения чистой культуры неклостридиальных анаэробов.
8. Схема идентификации микроорганизмов.
9. Определение биохимических свойств микробов.
10. Биологический метод исследования.
11. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.
12. Методы изучения генетики микробов.
13. Методы изучения нормальной микрофлоры.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
1. Микробиологическая диагностика пневмококковых инфекций.
2.Общие принципы диагностики острых кишечных инфекций, вызванных микробами
семейства энтеробактерий
3. Лабораторная диагностика кишечного иерсиниоза.
4. Клебсиеллы. Лабораторная диагностика склеромы и озены.
5. Лабораторная диагностика холеры.
6. Кампилобактерии. Кампилобактериозы. Методы диагностики.
7. Пищевые отравления бактериальной природы. Методы диагностики.
8. Лабораторная диагностика газовой гангрены, столбняка и ботулизма.
9. Серологическая диагностика сифилиса.
10. Лабораторная диагностика хламидиозов.
11. Микоплазмы и микоплазмозы.
ОБЩАЯ И ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ
1. Методы культивирования вирусов.
2. Принципы диагностики вирусных инфекций.
3. Лабораторная диагностика гепатитов.
4. Лабораторная диагностика СПИДа.
ДРУГИЕ ИНФЕКЦИИ
1. Классификация грибов. Микозы. Методы диагностики.
2. Возбудители мадуромикоза.
3. Возбудитель пневмоцистоза.
4. Возбудитель донованоза.
5. Возбудитель язвы Бурули.
6. Возбудитель мелиоидоза.
В В Е Д Е Н И Е
Медицинская микробиология является одной из наиболее важных областей знаний широко используемых во врачебной практике. Студенты медики нуждаются в изучении микробиологии для успешной диагностики и лечения заболеваний. Инфекционная заболеваемость в мире до сих пор остается очень распространенной, в ее структуре постоянно происходят существенные изменения, появляются новые возбудители, изменяется характер течения хорошо известных заболеваний. В последние десятилетия в фундаментальной и прикладной микробиологии накоплены новые научные факты, разработаны новые методы исследований. В связи с этим весьма важно, чтобы в обучении студентов медицинской микробиологии дать достаточно полные знания как о биологии микроорганизмов, так и о методах их выделения из разнообразных материалов, идентификации, методах диагностики инфекционных заболеваний, а также интерпретации полученных данных.
В представленном пособии к практическим занятиям для студентов Минского медицинского института по микробиологии представлены материалы по общей микробиологии (методы микроскопии, противомикробных мероприятий, выделения чистых культур и их идентификации, изучения нормальной микрофлоры) и частной микробиологии (методы диагностики пневмококковых инфекций и клебсиеллезов, острых кишечных инфекций и пищевых отравлений кампилобактериоза, анаэробной инфекции, сифилиса, хламидиозов и микоплазмозов). Кроме того, рассматриваются методы культивирования и лабораторной диагностики ряда распространенных вирусов и грибов.
В подготовке данного пособия принимали участие большинство сотрудников кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии Минского медицинского института.
ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ (БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИЙ)
МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроскопический (бактериоскопический) метод исследования - совокупность способов обнаружения и изучения морфологических и тинкториальных (способность окрашиваться) свойств микробов в исследуемом материале (лабораторная культура, патологический материал, пробы из внешней среды) с помощью микроскопии. Основная цель - установление этиологии болезни, а также определение чистоты выделенной чистой культуры. В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических микропрепаратов: а) бактериологический мазок; б) висячая капля; в) придавленная капля; г) тонкий мазок крови, мокроты и др.; д) толстая капля; ж) препарат-отпечаток.
Этапы метода
1. Забор материала (гной, мокрота, кровь, моча, испражнения, промывные воды бронхов и желудка, ликвор, содержимое полостей носа, вагины, трупный материал).
2. Транспортировка материала.
3. Приготовление микропрепаратов (фиксация и окраска при необходимости).
4. Микроскопия с оценкой формы, размеров, взаимного расположения микробов и т.д.
5. Заключение.
Оценка метода
Метод прост, широко доступен, быстр, экономичен, но мало чувствителен (около 10 54 0-10 55 0 бактерий в мл) и специфичен (из-за схожести морфологии микроорганизмов разных видов).
Дата: 2019-02-19, просмотров: 266.