Материалом для прижизненной диагностики служат кровь и моча, для посмертной – трупы мелких животных. От трупов крупных животных берут сердце, кусочки паренхиматозных органов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, спинномозговую жидкость. Абортированный плод доставляют в лабораторию целиком или берут желудок с содержимым и паренхиматозные органы плода.

Мочу собирают при естественном мочеиспускании в чистые пробирки, закреплённые на проволоке или в банки, чашки Петри, кружки и т.д. Легче всего брать пробы после утреннего подъема животных. А у свиней в любое время дня после 1–2-часового лежания. У коров и свиноматок мочу можно брать катетером.

Кровь в количестве 3–5 мл берут для бактериологического исследования в период лихорадки на 1–7-й день болезни. Для серологического исследования кровь берут в количестве 5–10 мл и не ранее чем через 5–7 дней после проявления клинических признаков болезни или через 60 дней после введения вакцины.

Почку извлекают в невскрытой капсуле. Сердце, мочевой пузырь и желудок плода берут с содержимым, для чего накладывают лигатуры на соответствующие сосуды и сфинктеры. Каждый орган или кусочек органа завертывают отдельно в пергамент.

Воду из водоисточника для обнаружения лептоспир берут в объёме 1,5–2 л в стерильные колбы с ватно-марлевыми пробками.

Патологический материал должен быть взят и исследован в течение 6

часов в летнее время и 10–12 часов при условии хранения его в охлаждённом

состоянии. Микроскопия мочи должна быть закончена при температуре 30–40°С в течение 3 часов, 25–30 ^оС – 4 –5 часов, 20–25 ^оС – 6–8 часов, 16–20 °С – до 10–12 часов с момента взятия.

Рис. 1 Желтушность слизистой оболочки ротовой полости

Рис. 2 Желтушность кожи и слизистой оболочки

Рис. 3 Желтушность склеры глаза

Рис. 4 Схема диагностики лептоспироза

Микроскопический метод

Исследуют живые микроорганизмы в препаратах «раздавленная капля» и «висячая капля» с помощью темнопольного микроскопа с использованием сухого объектива (х 40).

Венозную кровь в объеме 2 мл смешивают с 2-мя мл 2% раствора цитрата натрия. Полученную плазму центрифугируют 30 мин при 3000 об / мин.

Мочу микроскопируют в нативном виде или после центрифугирования.

Прозрачную мочу, не содержащую кристаллов солей, хлопьев, спермиев и других посторонних частиц, центрифугируют при 10–15 тыс. об./мин. в течение 30 минут. Сливают надосадочную жидкость, осадок ресуспензируют в оставшейся капле мочи и микроскопируют. Мочу, содержащую значительное количество посторонних частиц, очищают, центрифугированием при 3 тыс. об./мин. в течение 10 минут, затем сливают надосадочную жидкость и центрифугируют её для осаждения лептоспир при 10–15 тыс.об./мин в течение 30 минут.

Лептоспиры при рассмотрении в темном поле микроскопа представляют собой спиралеподобные тонкие серебристые нити, концы которых, обо или один, загнуты и булавовидно утолщены. Встречаются и бескрючковые формы лептоспир. Лептоспиры подвижны. В жидких средах обычными формами движения являются: вращательное, прямолинейное, поступательное с одновременным вращением вокруг собственной оси и круговые. Одна и та же особь может совершать и вращательные, и поступательные. Лептоспиры при микроскопии в отличие от других микроорганизмов никогда не бывают блестящими.

Рис. 5 Препарат «раздавленная капля», культура лептоспир

(тёмнопольная микроскопия)

Рис. 6 Культура лептоспир. Реакция иммунофлюоресценции

Рис. 7 Лептоспиры. Импрегнация серебром

Выявить возбудителей лептоспироза с помощью микроскопии можно только в свежем исследуемом материале. Диагностическая ценность этого метода недостаточна для обнаружения возбудителей на ранних стадиях болезни. Надежные результаты дает метод иммунофлюоресценции с использованием специфических люминесцентных сывороток. Если невозможно применить метод прямой микроскопии нативных материалов, можно прибегнуть к окраске фиксированных мазков по Романовскому-Гимзе или негативного контрастирования конто красным. Однако после такой обработки морфология лептоспир меняется, что может привести к ошибочным оценкам.

При бессимптомном течение лептоспироза суспензию готовят из кусочков коркового слоя почки, а при остром течении – из почки и печени. У абортированного плода микроскопируют суспензию из всех органов.

При микроскопической диагностике лептоспиры необходимо дифференцировать от нитей фибрина, обломков хвостовых частей спермиев, разрушенных эритроцитов, спирилло- и вибрионоподобных микроорганизмов, интерспир у хряков и других микроорганизмов.

Бактериологический метод

Классический метод выделения чистых культур лептоспир требует сложных питательных сред и много времени – до 1–2-х месяцев. Используют жидкие среды Фервольта-Вольфа, Уленгута, Терских, основным компонентом которых является инактивированная кроличья сыворотка. Кровь, мочу сеют по 1–3 капли в 3–5 пробирок со средой. Посевы инкубируют при температуре 28–30 °С в течение 3 мес. Лептоспиры размножаются очень медленно и вызывают помутнение среды. Поэтому для выявления их роста через 7–10 дней инкубации из каждой пробирки производят препарат «раздавленная капля» и микроскопируют в темном поле. Если рост лептоспиры не проявляют, посевы продолжают выращивать в термостате и микроскопируют через каждые 7–10 дней. При отсутствии роста в течение 3-х месяцев выдают отрицательный результат. При обнаружении лептоспир в любой пробирке, необходимо сделать пересев на свежий среду для сохранения культуры с целью его идентификации.