ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЛЕПТОСПИРОЗА
Лептоспироз (водная лихорадка) – острая зоонозная естественно-очаговая инфекционная болезнь, вызываемая лептоспирами и сопровождается лихорадкой, поражением почек, печени, сердечно-сосудистой и нервной систем, гемоглобинурией, некрозом слизистых оболочек и кожи, абортами, в тяжелых случаях желтухой и геморрагиями.
Все патогенные лептоспиры объединены в один вид Leptospira interrogans, а сапрофитные – в L. biflexa. Теперь известно более 200 сероваров лептоспир, которые составляют 18 серогрупп. Заболевание чаще вызывают Leptospira incterohaemorrhagiae, L. grippotyphosa, L. hebdomadis, L. canicova, L. Pomona, L. tarasovi.
Резервуаром и источником возбудителя в природе являются дикие грызуны (мыши, полевки, ондатры) и домашние животные (свиньи, коровы, козы, лошади, собаки). Для лабораторной диагностики лептоспироза используют микроскопический, бактериологический, биологический и серологический методы исследования.
Микроскопический метод
Исследуют живые микроорганизмы в препаратах «раздавленная капля» и «висячая капля» с помощью темнопольного микроскопа с использованием сухого объектива (х 40).
Венозную кровь в объеме 2 мл смешивают с 2-мя мл 2% раствора цитрата натрия. Полученную плазму центрифугируют 30 мин при 3000 об / мин.
Мочу микроскопируют в нативном виде или после центрифугирования.
Прозрачную мочу, не содержащую кристаллов солей, хлопьев, спермиев и других посторонних частиц, центрифугируют при 10–15 тыс. об./мин. в течение 30 минут. Сливают надосадочную жидкость, осадок ресуспензируют в оставшейся капле мочи и микроскопируют. Мочу, содержащую значительное количество посторонних частиц, очищают, центрифугированием при 3 тыс. об./мин. в течение 10 минут, затем сливают надосадочную жидкость и центрифугируют её для осаждения лептоспир при 10–15 тыс.об./мин в течение 30 минут.
Лептоспиры при рассмотрении в темном поле микроскопа представляют собой спиралеподобные тонкие серебристые нити, концы которых, обо или один, загнуты и булавовидно утолщены. Встречаются и бескрючковые формы лептоспир. Лептоспиры подвижны. В жидких средах обычными формами движения являются: вращательное, прямолинейное, поступательное с одновременным вращением вокруг собственной оси и круговые. Одна и та же особь может совершать и вращательные, и поступательные. Лептоспиры при микроскопии в отличие от других микроорганизмов никогда не бывают блестящими.
Рис. 5 Препарат «раздавленная капля», культура лептоспир
(тёмнопольная микроскопия)
Рис. 6 Культура лептоспир. Реакция иммунофлюоресценции
Рис. 7 Лептоспиры. Импрегнация серебром
Выявить возбудителей лептоспироза с помощью микроскопии можно только в свежем исследуемом материале. Диагностическая ценность этого метода недостаточна для обнаружения возбудителей на ранних стадиях болезни. Надежные результаты дает метод иммунофлюоресценции с использованием специфических люминесцентных сывороток. Если невозможно применить метод прямой микроскопии нативных материалов, можно прибегнуть к окраске фиксированных мазков по Романовскому-Гимзе или негативного контрастирования конто красным. Однако после такой обработки морфология лептоспир меняется, что может привести к ошибочным оценкам.
При бессимптомном течение лептоспироза суспензию готовят из кусочков коркового слоя почки, а при остром течении – из почки и печени. У абортированного плода микроскопируют суспензию из всех органов.
При микроскопической диагностике лептоспиры необходимо дифференцировать от нитей фибрина, обломков хвостовых частей спермиев, разрушенных эритроцитов, спирилло- и вибрионоподобных микроорганизмов, интерспир у хряков и других микроорганизмов.
Бактериологический метод
Классический метод выделения чистых культур лептоспир требует сложных питательных сред и много времени – до 1–2-х месяцев. Используют жидкие среды Фервольта-Вольфа, Уленгута, Терских, основным компонентом которых является инактивированная кроличья сыворотка. Кровь, мочу сеют по 1–3 капли в 3–5 пробирок со средой. Посевы инкубируют при температуре 28–30 °С в течение 3 мес. Лептоспиры размножаются очень медленно и вызывают помутнение среды. Поэтому для выявления их роста через 7–10 дней инкубации из каждой пробирки производят препарат «раздавленная капля» и микроскопируют в темном поле. Если рост лептоспиры не проявляют, посевы продолжают выращивать в термостате и микроскопируют через каждые 7–10 дней. При отсутствии роста в течение 3-х месяцев выдают отрицательный результат. При обнаружении лептоспир в любой пробирке, необходимо сделать пересев на свежий среду для сохранения культуры с целью его идентификации.
Биологический метод
Метод более чувствительный, чем культуральный; проводят с целью выделения и очистки культур, определения вирулентности и дифференциальной диагностики от сапрофитов. Проводят заражение золотистых хомячков 20–30-дневного возраста или крольчат-сосунов 10–20 дней. Материал вводят внутрибрюшинно, внутривенно или в скарифицированную кожу подушечек задних лапок. Через 5–7 дней после заражения у них возникает лихорадка, желтушное окрашивание склер и слизистых оболочек, кровоизлияния в органы и ткани. Лептоспиры обнаруживают в почках, печени, легких методом темнопольной микроскопии. Животных убивают на 4–5 и 14–16 дни, если они не погибли. После гибели животных от них выделяют чистую культуру и идентифицируют его с помощью реакции агглютинации и лизиса.
Вода является основным фактором в передаче возбудителя лептоспироза. Лептоспир обнаруживают в воде биологической пробой на крольчатах, свинках, хомяках, крапчатых сусликах, взрослых кроликах. Животных заражают в скарифицированную кожу или внутрибрюшинно. Начиная с четвёртого дня у крупных зверьков (крольчата, морские свинки) берут кровь из сердца с целью выделения гемокультур, исследуют микроскопически брюшной экссудат. Одного из мелких зверьков убивают. На 14–20-й день всех выживших животных так же убивают. Патологический материал исследуют на наличие лептоспир. Кровь исследуют в РМА.
Серологические исследования
В практических лабораториях чаще применяют реакцию микроагглютинации и лизиса лептоспир (РМАЛ) и реакцию агглютинации.
Лизис происходит в первых пробирках с меньшими разведенными сыворотки. Феномен агглютинации выглядит в поле зрения как образование клубков («паучков»), т.е. склеивания лептоспир между собой. Он наблюдается в следующих пробирках с большими разведенными сыворотки. Реакцию необходимо ставить повторно методом парных сывороток для определения нарастания титра антител.
Отбор и пересылка проб
Для бактериологического исследования на кампилобактериоз в ветеринарную диагностическую лабораторию от коров, нетелей и овцематок направляют – абортированный плод целиком с плодными оболочками (от крупных плодов – голову, желудок, печень, легкие), плаценту или часть ее. В
случае непригодности плода, плодовых оболочек и плаценты для исследований в лабораторию направляют слизь из шейки матки, стерильно взятую в первые 3–4 дня после аборта (при отсутствии гнойных выделений из матки) или в период охоты. Слизь берут также от животных, у которых наблюдается
расстройство полового цикла (в период охоты).
От быков-производителей станций (пунктов) по искусственному осеменению животных направляют препуциальную слизь и сперму, а от быков, используемых для естественного спаривания – препуциальную слизь и секрет придаточных половых желез,
Для бактериологического исследования на кампилобактериоз в ветеринарную диагностическую лабораторию от животных, убитых с диагностической целью направляют влагалище, матку, лимфоузлы тазовой полости.
| Аборт плод, плацента, слизь из шейки матки | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Микроскопия. Окраска фуксином Циля. На подвижность. РИФ ПЦР |
| Посев на среды: ПЖА, СЖН, МППА, агар Мартена. Культивируют при 37°С в течение 6–10 дней | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
Микроскопия Возбудитель кампилобактериоза подвижен, по Граму не красится, хорошо окрашивается всеми анилиновыми красками и весьма четко фуксином Циля. В окрашенных мазках из патологического материала вибрионы имеют вид запятой, летящей чайки, С и S-образной формы. При исследовании материала, полученного от давно инфицированных животных или после их лечения, могут быть обнаружены диссоциированные формы вибрионов в виде длинных спирилл, малоизвитых нитей и кокковидных форм, в 2–4 раза мельче обычных кокков.
Рис. 10 Возбудитель кампилобактериоза
Серологическая диагностика Проводят в благополучных по кампилобактериозу хозяйствах и в период профилактического карантинирования. Антитела определяют в РА с диагностическим титром 1:40 и выше, РСК – 1:20, РНГА – 1:4, в РИФ и ИФА. Результаты серологии имеют самостоятельное значение (т.е. на основании их можно поставить диагноз) в титрах в 3–5 раз превышающих диагностические. Отбор и пересылка проб Материалом для прижизненной диагностики служат фекалии, для посмертной – слизистая оболочка большой ободочной кишки павших или убитых с диагностической целью свиней. Фекалии от больных свиней берут ватным тампоном из прямой кишки. Для этого стерильный ватный тампон вводят в прямую кишку на глубину 7–8 см и делают вращательные движения, прижимая тампон к стенке кишки, затем его извлекают и помещают в пробирку с 8–10 мл физиологического раствора. У животных, убитых с диагностической целью, вырезают участок большой ободочной кишки, освобождают ее от содержимого, промывают водопроводной водой, затем соскабливают скальпелем около 1 г слизистой оболочки, переносят в пробирку с 8–10 мл физиологического раствора и суспендируют. Допускается отбор материала и от трупов не позднее 2 ч после гибели. Приготовленную суспензию исследуют непосредственно в хозяйстве или отправляют в ветеринарную лабораторию. При пересылке материала в лабораторию пробирки закрывают резиновыми пробками и помещают в термос со льдом. Материал должен быть исследован в течении 6–8 ч.
Рис. 12 Диарея
Рис. 13 Схема лабораторной диагностики дизентерии свиней Микроскопия Материал исследуют микроскопически, методом фазового контраста, путем просмотра в темном поле или в проходящем свете методом «раздавленная капля», подкрашенных и окрашенных препаратов – по Грамму (Гр-отрицательные), Романовскому-Гимзе или фуксином Пфейффера. В нативных препаратах трепонемы имеют вид подвижных извитых нитей с острыми концами, перемещающихся поступательно, змеевидно. Различают 3 вида трепонем свиней: крупные – длиной до 20 мкм, шириной 0,2 мкм, с 8–12 завитками; средние – длиной 8–12 мкм, с 6–8 завитками и малые – длиной до 8 мкм, шириной 0,1 мкм, с 3–4 завитками. Завитки расположены равномерно. По размерам вибрионы в сравнении с трепонемами в 2-4 раза толще, с тупыми концами. Могут приобретать вид спирали с тремя и более изгибами, но меньшей амплитудой их расположения, чем у трепонем. Движение вибрионов – вращательное вокруг длинной оси.
Рис. 14 Возбудитель дизентерии свиней. МФА
Культивирование Возбудитель дизентерии является анаэробом. Культивируется на специальных средах: трипсин-агар с 5% цитратной кровью, соевый агар с 5% крови крупного рогатого скота и др. среды инкубируют в анаэробных условиях в течение 4–8 сут. В чашке с трипсин-агаром вырастают мелкие прозрачные колонии или нежная пленка со следами эрозии, вокруг которых образуется зона гемолиза шириной 3–4 мм.
Рис. 15 Рост на трипсин-агаре. Зоны гемолиза Биопроба Возбудитель накапливается в организме кролика в тестикулах при внутрибрюшинном заражении. Через7–10 сут. Берут пунктат и микроскопируют. При обнаружении трепонем, кроликов убивают и выделяют культуру. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЛЕПТОСПИРОЗА Лептоспироз (водная лихорадка) – острая зоонозная естественно-очаговая инфекционная болезнь, вызываемая лептоспирами и сопровождается лихорадкой, поражением почек, печени, сердечно-сосудистой и нервной систем, гемоглобинурией, некрозом слизистых оболочек и кожи, абортами, в тяжелых случаях желтухой и геморрагиями. Все патогенные лептоспиры объединены в один вид Leptospira interrogans, а сапрофитные – в L. biflexa. Теперь известно более 200 сероваров лептоспир, которые составляют 18 серогрупп. Заболевание чаще вызывают Leptospira incterohaemorrhagiae, L. grippotyphosa, L. hebdomadis, L. canicova, L. Pomona, L. tarasovi. Резервуаром и источником возбудителя в природе являются дикие грызуны (мыши, полевки, ондатры) и домашние животные (свиньи, коровы, козы, лошади, собаки). Для лабораторной диагностики лептоспироза используют микроскопический, бактериологический, биологический и серологический методы исследования. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Дата: 2018-12-21, просмотров: 226.
