РАБОТА 15. КОЛИЧЕСТВЕНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Цель работы: ознакомиться с одним из распространенных методов количественного определения белка в сыворотке крови.

Задачи:

· построить калибровочную кривую по стандартным растворам белка;

· определить содержание белка в предложенной сыворотке крови;

· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.

Принцип метода. Белки в щелочной среде реагируют с сульфатом меди с образованием комплексных соединений, окрашенных в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию белка в растворе.

Ход работы

1. Построение калибровочной кривой

Готовят семь рабочих стандартных растворов белка разведением основного стандартного раствора (содержит 4 мг белка в 1 мл) дистиллированной водой, как указано в таблице.

Для приготовления контрольной пробы в пробирку наливают 2 мл дистиллированной воды.

Таблица 

Во все рабочие стандартные растворы и контроль добавляют по 2,5 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут для развития окраски. Окрашенные стандартные растворы колориметрируют на ФЭКе против контроля в кюветах на 5 мм с зеленым светофильтром (длина волны 540 нм). Полученные значения оптической плотности используют для построения калибровочной кривой.

2. Количественное определение белка в сыворотке крови

Исследуемую сыворотку крови разбавляют дистиллированной водой в 40 раз (1 мл цельной сыворотки смешивают с 39 мл Н₂О).

К 2 мл разбавленной сыворотки добавляют 2,5 мл биуретового реак-тива и после перемешивания оставляют при комнатной температуре на 30 минут, а затем колориметрируют. Измерение оптической плотности производят так же, как при построении калибровочной кривой (используют тот же контроль, что и для построения калибровочной кривой). Содержание белка в пробе определяют по калибровочной кривой.

Результаты:

 1. Калибровочная кривая

2. Расчет по формуле: Х = (А / 2 ^.  40 ^. 100) /1000 = А ^. 2 (г/л),

где А – количество белка в пробе, определенное по калибровочной кривой,

А/2 – количество белка (мг) в 1 мл разбавленной в 40 раз сыворотки крови,

100 – для пересчета на 100 мл сыворотки (для выражения показателя в мг%),

1000 – для перевода единиц в г%.

В сыворотке крови здорового человека содержится 6,5-8 г% белка.

Общие выводы по работе:

Вопросы для тестового контроля

1. Какова суточная потребность в пищевом белке у человека?

2. Что такое азотистый баланс?

3. Какие существуют виды азотистого баланса?

4. Что такое белковый минимум?

5. В каких единицах он выражается?

6. От чего зависит величина белкового минимума?

7. Что такое протеолиз?

8. Назовите эндо- и экзопептидазы желудочно-кишечного тракта.

9. Каковы причины гниения белков в кишечнике?

10. Что такое трупные яды?

11. Образуются ли трупные яды в организме человека в норме?

12. Где обезвреживаются образующиеся в кишечнике продукты гниения белков?

13. В чем особенность переваривания белков у животных с четырехкамерным желудком?

14. Назовите источники аминокислот в организме.

15. Какова биологическая роль аминокислот?

16. Назовите основные пути деградации аминокислот в клетке.

17. Назовите виды прямого дезаминирования.

18. Какие аминокислоты подвергаются прямому дезаминированию?

19. Что такое непрямое дезаминирование?

20. Какой кофермент необходим для реакций трансаминирования?

21. Назовите наиболее активные трансаминазы.

22. В чем заключается биологическая значимость трансаминирования?

23. Какие соединения образуются в результате декарбоксилирования аминокислот?

24. Как обезвреживаются биогенные амины?

25. Как проявляется биологическое действие гистамина?

26. Как проявляется биологическое действие серотонина?

27. Каков биологический эффект g-аминомасляной кислоты?

28. Назовите источники NH₃ в тканях.

29. Назовите пути обезвреживания аммиака в организме.

30. Назовите источники NH₂-групп в мочевине.

31. В каком органе происходит синтез мочевины?

32. Как происходит обезвреживание аммиака в ЦНС?

33. Какова судьба безазотистых остатков аминокислот?