Ход работы. В пять пробирок наливают по 0,5 мл 1%-го раствора яичного белка.
Содержимое первой пробирки нагревают до появления опалесценции (помутнения раствора).
К раствору белка во второй пробирке осторожно добавляют 1 каплю 1%-го раствора уксусной кислоты, нагревают и наблюдают вначале появление опалесценции, а затем выпадение белого хлопье-видного осадка белка. Это объясняется тем, что белок теряет заряд и находится в изоэлектрическом состоянии.
К раствору белка в третьей пробирке добавляют 1-2 капли 10%-го раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок не образуется, так как в кислой среде частицы белка перезаряжаются и приобретают положительный заряд.
К раствору белка в четвертой пробирке добавляют 1-2 капли 10%-го раствора уксусной кислоты, 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Выпадает осадок вследствие адсорбции ионов электролита (образование двойного электрического слоя) и нейтрализации заряда на частицах белка.
К раствору белка в пятой пробирке добавляют 1 каплю 10%-го раствора гидроксида натрия и нагревают. Осадок не образуется, так как в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка усиливается.
Обратимое осаждение белков (высаливание)
При добавлении к водным растворам белков сульфатов или хлоридов щелочных и щелочно-земельных металлов (Na2SO4, NaCl, MgSO4 и др.) происходит дегидратация и нейтрализация белковых частиц, при этом белки выпадают в осадок без изменения нативной структуры. Такой тип осаждения белков называется высаливанием. Высаливание – обратимый процесс, и после удаления соли (разбавлением водой, диализом) белок вновь приобретает природные свойства. Поскольку разные белки высаливаются при различных концентрациях солей, этот метод используется для фракционирования белков. Для разделения белков методом высаливания широко применяется сульфат аммония.
Фракционное осаждение белков плазмы крови
сульфатом аммония
Принцип метода. Фибриноген выпадает в осадок при 33%-м насыщении плазмы сернокислым аммонием, глобулины – при полунасыщении, а альбумины – при полном насыщении.
Ход работы
К 2 мл плазмы крови (для измерения объемов жидкостей в данном опыте используют мерные пробирки) добавляют 5 мл дистиллированной воды, 3,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. В осадок выпадает фибриноген (можно наблюдать лишь незначительное помутнение), который отделяют фильтрованием. Наличие белка на фильтре проверяют биуретовой реакцией: для этого воронку с фильтром переносят в чистую пробирку и на фильтр наливают 1 мл 10%-го раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1%-го раствора сульфата меди. Фильтрат (№ 1) используют для дальнейшей работы.
К 4 мл фильтрата № 1 добавляют 4 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. В осадок выпадают глобулины, которые отделяют фильтрованием. Получают осадок, с которым проделывают биуретовую реакцию, и фильтрат № 2.
К фильтрату № 2 добавляют при постоянном перемешивании стеклянной палочкой кристаллический сульфат аммония до насыщения (пока соль не перестанет растворяться). Выпадают в осадок альбумины, наличие которых проверяют биуретовой реакцией: 1 мл смеси переносят в чистую пробирку, добавляют 1 мл 10%-го раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1%-го раствора сульфата меди.
Оставшийся фильтрат № 2 используют для доказательства обратимости процессов высаливания. Для этого в насыщенный раствор фильтрата № 2 добавляют дистиллированную воду до полного растворения осадка. Для сравнения такой же опыт проделывают с пробиркой, в которой белок был осажден трихлоруксусной кислотой (см. выше). Сравнивают результаты и делают выводы.
Общие выводы по работе:
Вопросы для тестового контроля
1. Что такое a-аминокислота? Приведите примеры.
2. Назовите серосодержащие аминокислоты. Напишите их формулы.
3. Какая аминокислота оптически неактивна? Напишите ее формулу.
4. Какие аминокислоты содержат ароматические кольца? Напишите их формулы.
5. Какие аминокислоты заряжаются отрицательно при рН=7? Напишите их формулы.
6. Какие аминокислоты заряжаются положительно при рН=7? Напишите их формулы.
7. Назовите гидроксилсодержащие аминокислоты. Напишите их формулы.
8. Назовите неполярные аминокислоты. Напишите их формулы.
9. Перечислите реакции, с помощью которых можно обнаружить аминокислоты. Укажите, на какие функциональные группы эти реакции?
10. Какова роль аминокислот?
11. Что такое белки?
12. Назовите универсальные реакции на белки.
13. Что открывает биуретовая реакция?
14. Что такое полноценные белки?
15. Какие аминокислоты называют незаменимыми? Назовите их.
16. Какие аминокислоты относят к условно незаменимым? Назовите их.
17. Каково содержание азота в белках?
18. Какое число используется для перевода азота в белок?
19. Какие существуют уровни белковой структуры?
20. Что такое первичная структура?
21. Что такое вторичная структура? Назовите типы вторичной структуры.
22. Укажите основные характеристики a-спирали.
23. Назовите формы b-структуры. Укажите основные ее характеристики.
24. Что такое простые белки?
25. Что такое сложные белки?
26. Что такое фибриллярные белки? Приведите примеры фибриллярных белков.
27. Какие белки называются глобулярными?
28. Какова особенность структуры коллагена и чем она обусловлена?
29. Какова особенность кератиновых белков и чем она обусловлена?
РАЗДЕЛ 3. ФЕРМЕНТЫ
РАБОТА 5. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ДЕЙСТВИЕМ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ
Цель работы: ознакомиться с каталитическим действием некоторых ферментов пищеварительного тракта (амилазы слюны, пепсина и липазы) и каталазы крови.
Задание:
· проделать предложенные реакции;
· написать уравнения реакций, катализируемых исследуемыми ферментами;
· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.
1. Амилаза слюны
Амилаза слюны осуществляет гидролиз крахмала или гликогена.
Ход работы. В две пробирки вносят по 5 мл 0,2 %-го раствора крахмала, в одну из них добавляют 0,5 мл слюны. Содержимое перемешивают и пробы помещают в водяную баню (37 оС) на 15 минут.
В обе пробирки добавляют по 5 капель раствора Люголя (йода). В пробирке со слюной (амилазой) раствор не дает реакции на полисахарид, а в пробирке без слюны образуется сине-фиолетовое окрашивание.
2. Липаза поджелудочной железы
Липаза гидролизует жиры на глицерин и жирные кислоты, количество которых можно определить титрованием щелочью.
Ход работы. В две пробирки вносят по 1 мл растительного масла, 4 мл дистиллированной Н2О, 5 мл 1%-го раствора NaHCO3. Содержимое энергично встряхивают до образования эмульсии. Затем в обе пробирки добавляют по 5 капель спиртового раствора фенолфталеина, в одну из пробирок (опыт) – 1 мл липазы, а в другую (контроль) – 1 мл Н2О. Содержимое тщательно перемешивают и ставят в термостат (37 оС) на 15-20 минут. Вследствие образования жирных кислот в ходе реакции и нейтрализации ими щелочной среды раствор в пробе с липазой становится менее окрашенным или обесцвечивается, а в пробе без липазы не изменяется.
3. Пепсин
Пепсин, фермент желудочного сока, гидролизует белки до пептидов и аминокислот.
Ход работы. В две пробирки вносят несколько миллилитров раствора белка (альбумина) и легким подогревом на спиртовке или электроплитке денатурируют его. Пробы охлаждают до комнатной температуры и в одну из них добавляют раствор пепсина, а в другую – 1 мл Н2О. Обе пробы помещают в термостат (37 оС) на 20 минут, после чего сравнивают результаты.
4. Каталаза
Каталаза инактивирует перекись водорода, разлагая ее на воду и молекулярный кислород:
2Н2О2 ® 2Н2О + О2
Этот фермент содержится в эритроцитах, в клетках печени и других тканей.
Ход работы. В две пробирки вносят по 2 мл свежеприготовленного 5%-го раствора перекиси водорода, в одну из проб добавляют 1 каплю крови и перемешивают. В пробе с кровью (каталазой) вследствие выделения кислорода наблюдается интенсивное образование пузырьков.
Общие выводы по работе:
РАБОТА 6. ЗАВИСИМОСТЬ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ И рН СРЕДЫ
Цель работы: на примере амилазы слюны ознакомиться
с некоторыми специфическими свойствами ферментов.
Задание:
· проделать необходимые реакции;
· проанализировать полученные результаты и сформулировать выводы;
· написать уравнения реакций каталитического расщепления крахмала амилазой слюны.
Каждый фермент имеет свой оптимум рН, температуры и наибольшее сродство к какому-то субстрату. В этих условиях активность фермента максимальна.
1. Влияние температуры на активность амилазы
Ход работы. В три пробирки вносят по 1 мл слюны, одну из них помещают в лед, другую – в термостат с температурой 37 оС, содержимое третьей кипятят 5 минут, охлаждают струей воды и тоже помещают в термостат. Через 5 минут после этого во все пробы добавляют 5 мл 0,2%-го раствора крахмала, перемешивают и помещают в прежние условия. Через 20 минут во все пробы добавляют по 5 капель раствора Люголя.
Сравните окраску раствора всех проб и объясните различия.
2. Специфичность действия амилазы
Ход работы. В две пробирки вносят по 1 мл слюны. В одну из них добавляют 5 мл 0,2%-го раствора крахмала, в другую – 5 мл 0,5%-го раствора сахарозы. Пробы помещают на 20 минут в термостат (37 оС), после чего добавляют в них по 1 мл 10%-го раствора NaOH и по 0,5 мл 5%-го раствора сернокислой меди и содержимое доводят до кипения. В пробирке с крахмалом под влиянием амилазы образуется мальтоза, способная восстановить окись меди до закиси (красного цвета), – положительная проба Троммера. На сахарозу амилаза не действует, и в этой пробе окись меди не восстанавливается.
3. Определение оптимума рН активности амилазы
Ход работы. Перед началом работы готовят раствор амилазы. Для этого смешивают 1 мл 1%-го раствора крахмала и 0,5 мл слюны, разбавленной в 10 раз. Через каждые 2 минуты отбирают на предметное стекло по 1 капле этой смеси и добавляют к ней 1 каплю раствора Люголя. Крахмал должен полностью расщепиться за 10 минут (желтая окраска пробы с йодом). Если расщепление крахмала происходит быстрее, слюну надо развести еще в 2-4 раза; если медленнее – уменьшить начальное разведение.
В восемь пронумерованных пробирок наливают по 2 мл фосфатного буфера соответственно с рН: 5,4; 5,8; 6,2; 6,6; 6,8; 7,0; 7,4; 8,0. Во все пробирки добавляют по 5 мл 0,2%-го раствора крахмала (приготовленного на 0,1%-м растворе NаС1) и по 1 мл разбавленной слюны. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают стеклянной палочкой, после чего пробирки помещают в термостат при 37 оС. Через каждые 3 минуты 1 каплю жидкости, взятой из пятой пробирки, смешивают на предметном стекле с 1 каплей раствора Люголя. Вначале при смешивании образуется синее окрашивание, затем фиолетовое, фиолетово-красное. Как только проба из пятой пробирки даст с йодом на предметном стекле красно-бурое окрашивание, все пробирки извлекают из термостата, охлаждают под струей холодной воды и добавляют по 2 капли раствора Люголя. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и сравнивают окрашивание.
Общие выводы по работе:
РАБОТА 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИНОТРАНСФЕРАЗ
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПО МЕТОДУ КИНГА
Цель работы: ознакомиться с одним из методов определения активности аминотрансфераз, широко используемых в медицинской и сельскохозяйственной практике для выявления заболеваний и прогнозирования хозяйственно полезных признаков у животных.
Задание:
· ознакомиться с предложенным методом определения активности аминотрансфераз в сыворотке крови;
· провести анализ и сделать выводы.
Определение активности аминотрансфераз (трансаминаз) крови имеет большое диагностическое значение. Например, при инфаркте миокарда в крови увеличена активность аспартатаминотрансферазы, при инфекционном гепатите возрастает активность аланинамино-трансферазы.
Принцип метода. Метод Кинга основан на способности аланин- и аспартаттрансаминаз конденсировать 2,4-динитрофенилгидразин и продукты дезаминирования аминокислот – пировиноградную и щавелевоуксусную кислоты:
Ход работы. В одну пробирку вносят 0,2 мл сыворотки крови (опытная проба), в другую – 0,2 мл дистиллированной воды (контрольная проба); в обе пробирки добавляют по 0,5 мл 2%-го раствора аспарагиновой кислоты и по 0,5 мл 0,6%-го раствора a-кетоглутаровой кислоты. Пробы перемешивают и помещают на 60 минут в термостат (37 оС), после чего каталитическое действие фермента останавливают добавлением в обе пробы по 1 мл 0,1%-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина и вновь помещают в термостат на 15 минут. Затем добавляют по 10 мл 0,4 н раствора NaOH и оставляют на 1-2 минуты до появления окраски. Пробы колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кюветах с толщиной слоя 10 мм.
Активность аминотрансфераз выражают в условных единицах, умножая оптическую плотность на 100.
У здоровых людей активность аминотрансфераз в сыворотке крови составляет 10-35 единиц.
Результаты:
Общие выводы по работе:
Вопросы для тестового контроля
1. Что такое ферменты?
2. Какова природа ферментов?
3. Что такое константа Михаэлиса (КМ)? В каких единицах она определяется?
4. Какие факторы влияют на ферментативную активность?
5. Что такое специфичность фермента? Назовите виды специфичности.
6. Что такое активный центр фермента?
7. Какую модель взаимодействия фермента и субстрата предложил Фишер?
8. Что такое модель индуцированного соответствия?
9. В чем различие между простетической группой и коферментом?
10. Что понимают под активностью фермента?
11. Что такое ингибиторы?
12. Назовите типы ингибирования.
13. Каков механизм специфического необратимого ингибирования? Приведите примеры.
14. Каков механизм неспецифического необратимого ингибирования? Приведите примеры.
15. Что такое конкурентное ингибирование? Приведите примеры.
16. Каков механизм аллостерического ингибирования? Какова его роль? Приведите примеры.
17. Что такое активаторы? Как ионы металлов активируют фермент?
18. Какова роль ионов металлов в катализе?
19. Какими способами регулируется активность ферментов?
20. Что такое конститутивные и индуцируемые ферменты?
21. Что такое компартментализация ферментов?
22. Что такое изоферменты? Приведите примеры.
23. На чем основана классификация ферментов?
24. Как используются ферменты в медицине, сельском хозяйстве и научных исследованиях? Приведите примеры.
РАЗДЕЛ 4. ВИТАМИНЫ
РАБОТА 8. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА НЕКОТОРЫЕ ВИТАМИНЫ
Цель работы: ознакомиться со свойствами и особенностями структуры некоторых витаминов.
Задачи:
· проделать предложенные химические реакции;
· проанализировать полученные результаты и сделать вывод.
1. Диазореакция на тиамин (В1)
Принцип метода. Раствор тиамина при добавлении к нему диазобензолсульфокислоты и щелочи окрашивается в оранжевый или красный цвет, вследствие образования соединения тиамина с диазобензолсульфокислотой.
Ход работы. К 5 каплям 1%-го раствора сульфаниловой кислоты прибавляют 5 капель 5%-го раствора азотистокислого натрия, образуется диазобензолсульфокислота. К диазобензолсульфокислоте прибавляют немного порошка тиамина (или раствора), 5-7 капель 10%-го раствора карбоната натрия (соды). Жидкость окрашивается в оранжевый или красный цвет. Если раствор соды осторожно приливать по стенке наклоненной пробирки, то на границе двух жидкостей образуется красное кольцо.
2. Реакция окисления тиамина в тиохром
Принцип метода. При действии железосинеродистого калия тиамин окисляется с образованием желтого пигмента тиохрома.
Ход работы. К 1 капле раствора тиамина прибавляют 5-10 капель 10%-го раствора едкого натра и 1-2 капли 5%-го раствора железосинеродистого калия и перемешивают. При нагревании жидкость окрашивается в желтый цвет в результате превращения тиамина в тиохром.
3. Реакция восстановления рибофлавина (В2)
Ход работы. В пробирку наливают 10 капель взвеси рибофлавина в воде, добавляют 5 капель концентрированной соляной кислоты и опускают кусочек металлического цинка. Начинается бурное выделение пузырьков водорода и жидкость постепенно окрашивается в розовый или красный цвет, затем окраска жидкости начинает бледнеть и обесцвечиваться.
4. Проба на никотиновую кислоту (РР или В5)
Принцип метода. При нагревании никотиновой кислоты с уксуснокислой медью образуется осадок медной соли никотиновой кислоты.
Ход работы. 5-10 мг никотиновой кислоты растворяют при нагревании в 10-20 каплях 10%-го раствора уксусной кислоты. К нагретому до кипения раствору добавляют равный объем 5%-го раствора уксуснокислой меди. Жидкость становится мутной, окрашивается в голубой цвет, а при стоянии выпадает осадок синего цвета.
5. Реакция на аскорбиновую кислоту
а) Восстановление феррицианида калия витамином С
Ход работы. В двух пробирках смешивают 1 каплю 5%-го раствора К3Fe(CN)6 c 1 каплей 1%-го раствора FeCl3. В одну из пробирок к зеленовато-бурой жидкости прибавляют 5-10 капель 1%-го раствора аскорбиновой кислоты, а в другую – столько же дистиллированной воды. Жидкость в первой пробирке приобретает зеленовато-синюю окраску, выпадает синий осадок берлинской лазури; во второй пробирке (контроль) зеленовато-бурая окраска жидкости остается без изменения.
1. аскорбиновая + 2К3Fе(СN)6 + 2КОН ® дегидро- + 2К4Fе(СN)6 + 2Н2О кислота феррицианид аскорбиновая ферроцианид
калия кислота калия
2. 3К4Fе(СN)6 + 4FеС13 ® Fе4[Fе(СN)6]3 + 12КСl
ферроцианид берлинская
калия лазурь
б) Реакция с 2,6-дихлорфенолиндофенолом (краской Тильманса)
Ход работы. В пробирку с 2,6-дихлорфенолиндофенолом вносят 0,5 мл 0,1%-го раствора HСl и по каплям 0,1%-го раствора аскорбиновой кислоты. Наблюдается обесцвечивание 2,6-дихлорфенолиндофенола.
6. Реакция на витамин А с концентрированной
серной кислотой
Принцип метода. При добавлении концентрированной серной кислоты к хлороформенной эмульсии рыбьего жира образуется красное окрашивание, переходящее в красно-бурое.
Ход определения. В сухую пробирку вносят 1 каплю рыбьего жира и 5 капель хлороформа, перемешивают и добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты.
7. Реакция на витамин D (анилиновая проба)
Принцип метода. При нагревании рыбьего жира, содержащего витамин D со смесью анилина и концентрированной HCl, раствор приобретает красную окраску.
Ход работы. В сухую пробирку вносят 1 каплю рыбьего жира, 5 капель хлороформа, встряхивают и добавляют 1 каплю анилинового реактива, при нагревании желтая эмульсия принимает красную окраску.
Общие выводы по работе:
РАБОТА 9. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И МОЧЕ
Цель работы: ознакомиться с одним из методов количественного определения витамина в пищевых продуктах и биологических жидкостях.
Задачи:
· определить содержание витамина С в пищевых продуктах и моче;
· сравнить полученные результаты и сделать выводы.
Принцип метода. Метод основан на способности витамина С восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол:
2,6-дихлорфенолиндофенол в щелочной среде имеет синюю окраску, в кислой среде – красную, в восстановленном состоянии – бесцветную:
1. Определение содержания витамина C
в плодах шиповника
Ход работы
а) Гомогенизация биоматериала и экстракция витамина С
1 г сухих плодов измельчают в фарфоровой ступке с 2 мл дистиллированной воды, смесь количественно переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят объем водой до метки. Через 10 минут смесь фильтруют через бумажный фильтр в мерную пробирку.
б) Количественное определение витамина C в экстракте
К 2 мл полученного фильтрата добавляют 2-3 капли 10%-го раствора соляной кислоты и 2 мл дистиллированной воды. Содержимое переливают
в колбочку на 50 мл и титруют 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенол-
индофенола до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.
Расчет. Содержание витамина C рассчитывают по формуле:
Х = (0,088. А. 25 . 100) / Б. В = (мг%),
где Х – содержание аскорбиновой кислоты в мг%;
А – количество раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола (в мл), пошедшее на титрование;
В – количество сухого вещества в г, взятое для анализа;
Б – количество вытяжки в мл, взятое для титрования;
25 – общее количество вытяжки в мл;
0,088 – количество аскорбиновой кислоты в мг, эквивалентное
1 мл 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола.
2. Определение содержания витамина С в хвое, картофеле
и других пищевых продуктах
а) Гомогенизация биоматериала и экстракция витамина С
Этот этап работы выполняют так же, как в предыдущем случае (при определении содержания аскорбиновой кислоты в шиповнике).
б) Количественное определение витамина C в экстракте
10 мл фильтрата* приливают в колбочку на 50 мл, подкисляют 2-3 каплями 10%-го раствора соляной кислоты и титруют так же, как в предыдущем случае.
*Примечание: если исходный цвет фильтрата сильно окрашен (например, у моркови или петрушки), берут 2 мл фильтрата и 8 мл дистиллированной воды, но это учитывают при расчетах.
Расчет делают по той же формуле, что и при определении витамина C в шиповнике, только количество вытяжки (Б), взятое для титрования, будет равно 10 мл.
3. Определение содержания витамина С в моче
Ход работы. В коническую колбу вносят 10 мл мочи и 10 мл дистиллированной воды. Добавляют 1 мл концентрированной уксусной кислоты и титруют 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндо-фенола до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.
Расчет:
Х = (0,088 . А . 100) / 10 = (мг%),
где А – количество 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола в мл, пошедшее на титрование;
10 – количество мочи в мл, взятое на титрование;
100 – коэффициент для выражения результата в мг%;
0,088 – эквивалент аскорбиновой кислоты.
Общие выводы по работе:
Вопросы для тестового контроля
1. Что такое витамины?
2. На чем основана классификация витаминов? Приведите примеры.
3. Какие витамины относятся к жирорастворимым?
4. Какие Вы знаете водорастворимые витамины?
5. Что такое провитамины, антивитамины?
6. Что такое гипо-, гипер- и авитаминоз?
7. Избыток каких витаминов может вызвать гипервитаминоз? Почему?
8. Перечислите основные различия в метаболизме водо- и жирорастворимых витаминов.
9. Какие соединения относят к витамину A? Какова его биологическая роль? Назовите основные симптомы гиповитаминоза A, источники поступления этого витамина в организм.
10. Назовите основных представителей витаминов группы D. Какие соединения являются активной формой витамина D? Какие органы принимают участие в образовании активной формы витамина D?
11. Какова биологическая роль витамина D?
12. Какие изменения появляются при гипо- и гипервитаминозе D?
13. Какие соединения относятся к витаминам группы K?
14. В каких биологических реакциях участвует витамин K? Какие симптомы характерны для гипо- и гипервитаминоза К?
15. Какие соединения относят к витамину Е?
16. Какие симптомы характерны для гипо- и гипервитаминоза Е? Какова биологическая роль этого витамина?
17. Какие соединения относятся к витамину F? Каковы его биологическая роль и клинические признаки гиповитаминоза F?
18. Структура и биологическая роль витамина В1, клиническое проявление гиповитаминоза B1.
19. Структура и биологическая роль витамина В2, клиническое проявление гиповитаминоза B2.
20. Структура и биологическая роль витамина В3, клиническое проявление гиповитаминоза B3.
21. Структура и биологическая роль витамина В5, клиническое проявление гиповитаминоза B5.
22. Структура и биологическая роль витамина В6, клиническое проявление гиповитаминоза B6.
23. Структура и биологическая роль фолиевой кислоты
(витамина Вс), клиническое проявление гиповитаминоза этого витамина.
24. Структура и биологическая роль витамина В12, клиническое проявление гиповитаминоза B12.
25. Структура и биологическая роль витамина C, клиническое проявление гиповитаминоза C.
26. Структура и биологическая роль витамина H, клиническое проявление гиповитаминоза H.
27. Структура и биологическая роль витамина P, клиническое проявление гиповитаминоза P.
РАЗДЕЛ 5. ОБМЕН ВЕЩЕСТВ
ХИМИЯ И ОБМЕН УГЛЕВОДОВ
РАБОТА 10. ОРТОТОЛУИДИНОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ
Цель работы: ознакомиться с одним из распространенных методов количественного определения в крови основного показателя углеводного обмена - глюкозы.
Задачи:
· определить содержание глюкозы в крови;
· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.
Принцип метода. Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты дает сине-зеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на фотоэлектроколориметре:
С ортотолуидиновым реактивом реагируют все альдогексозы, но их содержание в крови невелико, поэтому метод позволяет определить практически одну глюкозу.
Ход работы
а) Осаждение белков крови. В две центрифужные пробирки наливают по 0,9 мл 3%-го раствора трихлоруксусной кислоты, затем в одну из них вносят 0,1 мл крови (или сыворотки крови), а в другую – 0,1 мл стандартного раствора глюкозы (концентрация глюкозы в стандартном растворе составляет 100 мг%). Содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.
б) Цветная реакция с ортотолуидиновым реактивом. В обычные сухие пробирки вносят по 0,5 мл надосадочной жидкости из каждой центрифужной пробирки, добавляют по 4,5 мл ортотолуидинового реактива и помещают в кипящую водяную баню (100 оС) на 8 минут. (Время инкубации проб и температурный режим необходимо соблюдать точно, кроме того, обязательным условием для нормального протекания данной реакции является непрерывное кипение воды в бане!). По истечении времени пробирки вынимают и охлаждают в водопроводной воде до комнатной температуры.
в) Измерение оптической плотности растворов. Оптическую плотность проб измеряют на фотоэлектроколориметре в кюветах на 10 мм против воды с красным светофильтром (620 нм)
Расчет. Содержание глюкозы в опытной пробе рассчитывают по стандартному раствору глюкозы по формуле:
С оп = (С ст. р-ра глюкозы ´ Е оп) / Е ст. р-ра глюкозы ,
где Cоп – концентрация глюкозы в крови в пробе, ммоль/л,
C ст. р-ра глюкозы. – концентрация глюкозы в стандартной пробе, 100 мг%,
Е оп. – оптическая плотность исследуемой пробы,
Е ст. р-ра глюкозы – оптическая плотность стандартного раствора глюкозы.
Примечание. Для перевода показателя в единицы СИ (ммоль/л) полученный результат при расчете необходимо умножить на 0,0555.
Нормальное содержание глюкозы в сыворотке крови человека, определенное этим методом, колеблется в пределах 3,33-5,55 ммоль/л (или 60-90 мг%).
Общие выводы по работе:
Работа 11. Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в биологических жидкостях
Цель работы: ознакомиться с современным энзиматическим методом количественного определения глюкозы в биологических жидкостях, который широко применяется в клинической практике
Задачи:
· определить содержание глюкозы в предлагаемых образцах;
· проанализировать полученные результаты и сделать вывод.
Принцип метода. Глюкозооксидаза катализирует окисление глюкозы кислородом воздуха с образованием эквимолярного количества пероксида водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет фенол, который превращается в бензохинон, окрашенный в розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в пробе.
Из набора реагентов OLVEX DIAGNOSTICUM готовят перед анализом:
Состав набора
1. Стандартный раствор глюкозы – 10 ммоль/л
2. Рабочий реагент содержащий:
а) фосфат-фенольный буфер (рН 7,5),
б) глюкозооксидазу (25 000 U/л),
в) пероксидазу (1500 U/л).
Ход работы
В три обычные химические пробирки наливают:
1) в опытную – 0,01 мл сыворотки крови или свежей мочи,
2) в стандартную – 0,01 мл стандартного раствора глюкозы,
3) в контрольную – 0,01 мл дист. Н2О.
Затем во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 10 минут при 37 оС. После окончания инкубации измеряют оптическую плотность опытной и стандартной пробы против контроля в кюветах на 5 мм (или 3 мм) при длине волны 490-510 нм.
Окраска стабильна в течение часа после окончания инкубации при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей.
Примечание
Количество глюкозы в моче определяют только при положительной качественной реакции на глюкозу. Реакция считается положительной, если смесь из 0,01 мл исследуемой мочи и 0,5 мл рабочего реагента через 15 минут приобретает розовую окраску.
Расчет
Расчет концентрации глюкозы проводят по формуле:
С = Е0/ Ест. ´10,
где Е0 – оптическая плотность опыта,
Ест. – оптическая плотностьстандарта,
10 – концентрация стандартного раствора глюкозы в моль/л.
Нормальное содержание глюкозы, определенное этим методом
в сыворотке или плазме крови здорового человека составляет 4,2-6,1 ммоль/л, в моче – < 0,8 ммоль/л.
Результаты:
Общие выводы по работе:
Вопросы для тестового контроля
1. Что такое углеводы?
2. Что такое моносахариды? Приведите примеры.
3. Что такое дисахариды? Приведите примеры.
4. Что такое полисахариды? Приведите примеры.
5. Назовите компоненты мальтозы. Напишите структурную формулу мальтозы. В чем ее отличие от изомальтозы?
6. Назовите компоненты лактозы. Напишите ее структурную формулу.
7. Структура и биологическая роль крахмала.
8. В чем различие между крахмалом и целлюлозой?
9. Какова суточная потребность в углеводах у человека?
10. Как происходит переваривание крахмала в организмах человека и моногастричных животных?
11. Какова роль балластных веществ? Происходит ли гидролиз целлюлозы в желудочно-кишечном тракте моногастричных животных?
12. В чем отличие переваривания углеводов у жвачных животных?
13. Какие существуют пути утилизации глюкозы в клетке?
14. Что такое гликолиз?
15. Какие ферменты в гликолизе являются ключевыми?
16. Какое значение имеет гликолиз?
17. В чем сходство и различие между гликолизом, гликогенолизом, спиртовым брожением и молочно-кислым брожением?
18. В чем различие между аэробным и анаэробным распадом глюкозы в клетке?
19. Что такое окислительное декарбоксилирование ПВК? Назовите основные компоненты мультиэнзимного комплекса, катализирующего этот процесс, и напишите общее уравнение этих реакций.
20. Какова роль ЦТК?
21. Назовите два основных пути синтеза глюкозы в организме.
22. Каково биологическое значение пентозофосфатного пути?
23. Какие 2 фазы выделяют в пентозофосфатном пути?
24. В чем сходство и различие между гликолизом и глюконеогенезом?
25. Почему глюконеогенез особенно важен для животных с четырехкамерным желудком?
26. Какие факторы способствуют усилению и ослаблению глюконеогенеза?
27. Какие ферменты участвуют в синтезе гликогена?
28. Какие ферменты участвуют в распаде гликогена в клетке?
29. Какой гликоген является источником глюкозы в крови?
30. Что такое цикл Кори? Каково его значение?
31. Какова концентрация глюкозы в крови человека? Причины гипо- и гипергликемии?
32. Почему не эффективен прием инсулина через рот?
33. Что такое почечная гликозурия? Когда она возникает?
34. Какая существует разница состава мочи у голодающих и
больных сахарным диабетом?
Задачи
1. Какой общий метаболит образуется из аминокислот, глюкозы и жирных кислот?
2. Какой из перечисленных ферментов катализирует реакцию биосинтеза гликогена:
а) a-1,6-глюкозидаза, б) гликогенфосфорилаза,
в) гликоген-синтетаза, г) фосфоглюкомутаза?
3. Сколько молекул восстановительных эквивалентов образуется в ЦТК?
Какие превращения в ЦТК связаны с гидратацией субстрата:
а) цитрата в цис-аконитат; б) сукцинил-КоА в сукцинат; в) фумарата в малат; г) оксалоацетата в сукцинат; д) цис-аконитата в изоцитрат?
5. На каких этапах превращения цикла Кребса происходят реакции дегидрирования:
а) цитрата в цис-аконитат; б) цитрата в изоцитрат; в) окислительное декарбоксилирование a-кетоглутарата; г) малата в оксалоацетат; д) сукцината в фумарат; е) фумарата в малат; ж) изоцитрата в a-кетоглутарат?
6. Напишите уравнения реакций пентозофосфатного цикла, связанные с образованием НАДФН+Н+. Какие ферменты катализируют эти реакции?
7. Почему гиповитаминоз В1 приводит к накоплению концентрации пирувата в крови и органах?
8. Какие изменения в обмене углеводов возникают в результате полного голодания: а) в течение 1-2 суток; б) при более длительном периоде (до 7 суток).
9. Почему при анемии организм хуже переносит физические нагрузки?
10. Почему при гипоксии повышено содержание пирувата в крови?
11. Почему при недостаточной обеспеченности организма витаминами В1, В2 и В5 повышено содержание лактата и пирувата в крови и органах?
12. Почему для повышения качества мяса перед транспортировкой животных к месту забоя рекомендуют применять транквилизаторы (мебикар и др.)?
13. Укажите, какие изменения в метаболизме углеводов возникают при приеме алкоголя натощак:
а) уменьшается отношение НАД+/НАДH+Н+?
б) увеличивается концентрация лактата и уменьшается
концентрация пирувата в печени и крови?
в) уменьшается скорость глюконеогенеза в печени?
г) ускоряется синтез гликогена в печени?
14. Почему во время обильной лактации у коров часто выявляют гипогликемию?
15. Почему при некоторых онкологических заболеваниях в крови повышено содержание лактата?
16. Почему при одновременном употреблении легко усваиваемых углеводов организм человека испытывает чувство голода?
17. Почему при недостаточном поступлении в организм тиамина (витамин В1) снижается эффективность кормового рациона и повышаются затраты кормов на единицу прироста?
18. Почему во время лактации потребности коров в углеводах возрастают?
19. Около 80% всей глюкозы, синтезируемой в организме овцы, используется в вымени. Расходуется глюкоза для образования молока, главным образом на синтез лактозы, триглицеридов молока. Зимой при низком качестве корма развивается кетоз. Обычно в таких случаях дают большие дозы пропионата. Почему?
20. Метаболизм этанола, поступающего в организм человека, происходит в печени. В результате двух реакций дегидрирования из 1 молекулы этанола образуются уксусная кислота и 2 молекулы НАДН+Н+. Уксусная кислота превращается в ацетил-КоА и включается в цикл Кребса. Накопление НАД-восстановленного в печеночных клетках приводит к изменению реакций, зависимых от этих эквивалентов. Особенно это выражено у хронических алкого-ликов, при приеме алкоголя натощак или при значительной физической нагрузке. Какие изменения углеводного обмена происходят при этом? Как это отражается на биохимических показателях крови?
21. Сладкий вкус зерен кукурузы в свежесобранных початках обусловлен высоким содержанием в них сахара. Через несколько дней (без специальной обработки) сахаристость кукурузы снижается, так как 50% свободного сахара в зернах превращается в крахмал в течение одного дня хранения. Чтобы сохранить сладкий вкус свежесобранной кукурузы, очищенные початки помещают на несколько минут в кипящую воду, затем охлаждают и замораживают. В чем биологическая основа этой обработки?
ХИМИЯ И ОБМЕН ЛИПИДОВ
РАБОТА 12. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МЕТОДОМ ИЛЬКА
Цель работы: ознакомиться с одним из распространенных методов количественного определения холестерина в сыворотке крови.
Задачи:
· построить калибровочную кривую по стандартным растворам холестерина;
· определить уровень холестерина в сыворотке крови;
· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.
В норме количество холестерина в сыворотке крови составляет в среднем 165 мг%.
Обмен холестерина нарушается при ряде заболеваний, особенно при атеросклерозе. Содержание его в крови увеличивается при гипертонии, сахарном диабете, заболевании почек (липоидном нефрите).
Принцип метода. Метод основан на реакции Либермана - Бурхада. При действии концентрированной серной кислоты происходит дегидратация холестерина, конденсация образовавшихся продуктов в виде непредельных углеводородов, соединяющихся с серной кислотой с образованием окрашенных продуктов.
Ход работы
1. Построение калибровочной кривой
В 5 пробирок вносят реактивы в количестве, указанном в таблице:
| № п / п | Количество стандартного раствора холестерина, мл | Количество реактива Илька, мл | Количество холестерина, мг% | Е |
| 1 | 0,05 | 2,05 | 50 | |
| 2 | 0,10 | 2,00 | 100 | |
| 3 | 0,15 | 1,95 | 150 | |
| 4 | 0,20 | 1,90 | 200 | |
| 5 | 0,25 | 1,85 | 250 |
Содержимое пробирок осторожно перемешивают, закрывают пробками и оставляют в темноте на 20 минут. Затем растворы колориметрируют на ФЭКе против реактива Илька в кюветах на 5 мм с красным светофильтром. Полученные значения экстинкции (Е) используют для построения калибровочной кривой, откладывая по оси абсцисс количество холестерина в мг%, по оси ординат – оптическую плотность раствора.
Внимание! При выполнении методики необходимо быть особенно внимательными и осторожными, так как стандартный раствор холестерина приготовлен на концентрированной уксусной кислоте, а в состав реактива Илька входят концентрированная уксусная, концентрированная серная кислоты и уксусный ангидрид (в соотношении 1:1:5). Реактивы набирать только пипеткой с резиновой трубкой и стеклянным наконечником или автоматической пипеткой, не разливать, избегать попадания их на кожу, слизистые и одежду. Во время выполнения анализа пробирки обязательно закрывать пробками, а кюветы – крышками.
Калибровочная кривая
2. Определение содержания холестерина в сыворотке крови
В пробирку вносят 2 мл реактива Илька и 0,1 мл сыворотки крови. Содержимое перемешивают, закрывают пробкой и ставят в темное место на 20 минут, после чего колориметрируют, как при построении калибровочной кривой. Определяют концентрацию холестерина в сыворотке крови по полученной калибровочной кривой.
Результаты:
Общие выводы по работе:
работа 13. определение концентрации общего холестерина в сыворотке и плазме крови энзиматическим методом
Цель работы: ознакомиться с одним из самых распространенных в клинической биохимии методов определения холестерина.
Задачи:
· определить содержание общего (свободного и этерифицированного) холестерина в предложенной сыворотке крови;
· проанализировать полученные результаты и сделать вывод.
Принцип метода. При гидролизе эфиров холестеридов холестерин-эстеразой образуется холестерин. Общий холестерин (свободный и этерифицированный) окисляется кислородом воздуха под действием холестериноксидазы с образованием эквимолярного количества пероксида водорода:
В присутствии пероксидазы перекись водорода окисляет фенол, который превращается в бензохинон, имеющий розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина.
Реактивы
Из набора реагентов серии Olvex Diagnosticum готовят перед анализом:
1. Стандартный раствор холестерина – 5,17 ммоль/л (200 мг/дл),
2. Рабочий реагент, содержащий:
а) фосфатный буфер (100 ммоль/л),
б) фенол (20 ммоль/л),
в) холестеринэстеразу (400 U/л),
г) холестериноксидазу (250 U/л),
д) пероксидазу (500 U/л)
Ход работы
В три обычные химические пробирки наливают:
1) в опытную – 0,02 мл сыворотки (или плазмы) крови,
2) в стандартную – 0,02 мл стандартного раствора холестерина,
Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, реакционную смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37 оС. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной проб против контроля в кюветах с рабочей длиной 5 мм (или 3 мм) при длине волны 490-500 нм.
Окраска проб стабильна в течение 2 часов при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей.
Расчет
Расчет количества общего холестерина проводят по формуле:
С = Ео/Ест. ´ 5,17 [ммоль/л] или С = Ео/Ест. ´ 200 [мг/100мл],
где Ео – экстинция опытной пробы,
Ест – экстинция стандарта.
Содержание холестерина в сыворотке крови здоровых людей разного возраста колеблется в пределах:
20-29 лет – 3,72- 7,11 ммоль/л (144-175 мг/дл),
30-39 лет – 4,27-7,63 ммоль/л (165-295 мг/дл),
40-49 лет – 4,40- 8,15 ммоль/л (170-315 мг/дл),
старше 50 лет – 4,58-8,79 ммоль/л (177-340 мг/дл).
Результаты:
Общие выводы по работе:
РАБОТА 14. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ КЕТОНОВЫХ ТЕЛ В КРОВИ, МОЧЕ И МОЛОКЕ
Цель работы: ознакомиться с некоторыми реакциями выявления кетоновых тел в биологических жидкостях.
Задачи:
· определить количество кетоновых тел в сыворотке крови, молоке и моче;
· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.
Принцип метода. Ацетон и ацетоуксусная кислота образуют с нитропруссидом натрия в щелочной среде комплексное соединение розово-фиолетовой окраски. Интенсивность окраски зависит от количества кетоновых тел в реакции.
1. Качественная реакция выявления кетоновых тел
Ход работы. На кафель или стекло наносят 0,1-0,2 г порошка нитропруссида натрия, прибавляют 2-3 капли сыворотки крови и выдерживают 5 минут. Появление розово-фиолетовой окраски указывает на положительный результат. Минимальный уровень кетоновых тел в крови, дающий положительную реакцию, равен 10 мг/100 мл (10 мг%). Скорость развития окраски и ее интенсивность пропорциональны концентрации кетоновых тел в исследуемой пробе: если фиолетовое окрашивание возникает немедленно – содержание 50-80 мг% и более; если оно появляется через 1 минуту – в пробе содержится 30-50 мг%; развитие слабой окраски через 3 минуты свидетельствует о присутствии 10-30 мг% кетоновых тел.
2. Полуколичественный метод определения кетоновых тел
в сыворотке крови
Ход работы. После качественной реакции сыворотку крови разводят дистиллированной Н2О: при содержании 30-50 мг% делают разведения 1:3, 1:4, 1:5 и 1:6. Для этого берут 4 пробирки, в которые приливают по 0,1 мл сыворотки крови, в первую пробирку прибавляют 0,3, во вторую – 0,4, в третью – 0,5 и четвертую – 0,6 мл дистиллированной Н2О. Затем проводят качественную реакцию выявления кетоновых тел с нитропруссидом натрия на кафеле или предметном стекле так же, как в пункте 1, только прибавляют не цельную, а разведенную сыворотку крови. В пробе с наибольшим разведением, дающим положительную реакцию, содержится 10 мг% кетоновых тел. Умножая результат на степень разведения, получают содержание кетоновых тел в неразведенной пробе.
Кетоновые тела в свежеполученном молоке и моче определяют так же, как и в сыворотке крови (пункт 1). Следует помнить, что тест более чем в 3 раза чувствительнее при определении ацетоуксусной кислоты, чем ацетона. Из всех кетоновых тел в сыворотке крови человека ацетоуксусная кислота является преобладающей, однако в крови здоровых коров 70-90% кетоновых тел составляет b-оксимасляная кислота, в молоке на ее долю приходится 87-92%.
Результаты:
Общие выводы по работе:
Вопросы для тестового контроля
1. Что такое липиды?
2. Приведите классификацию липидов.
3. В чем заключается роль липидов?
4. Какова суточная потребность в липидах у человека?
5. Как построены триацилглицерины (ТАГ)?
6. Что такое эссенциальные жирные кислоты? Приведите примеры.
7. Из чего состоит фосфатидилхолин? Какова его роль? Приведите другие примеры глицерофосфолипидов.
8. Назовите основные компоненты в сфингомиелине.
9. Какие составные компоненты определяются в цереброзидах?
10. В чем сходство и различие между цереброзидами, ганглиозидами и сульфатидами?
11. Что такое стероиды?
12. Изобразите структуру холестерина.
13. Какими реакциями определяется холестерин?
14. Назовите ферменты, участвующие в гидролизе липидов в кишечнике.
15. Назовите желчные кислоты. Из какого вещества они образуются?
16. Что такое парные желчные кислоты? Напишите структурную формулу наиболее распространенных из них.
17. Какое соединение является предшественником для желчных кислот? Из чего они синтезируются?
18. Какова роль желчных кислот?
19. Назовите основные особенности переваривания липидов у жвачных животных.
20. Какие транспортные частицы липидов присутствуют в крови? Какие из них образуются в слизистой кишечника?
21. Какие липопротеины плазмы крови содержат наибольшее количество эндогенных ТАГ?
22. Какие липопротеины плазмы крови содержат наибольшее количество холестерина?
23. Какие ферменты участвуют во внутриклеточном липолизе?
24. Какая внутриклеточная липаза является гормон-зависимой?
25. Что такое b-окисление жирных кислот? Где оно протекает?
26. Как происходит активация жирных кислот? Какое соединение участвует в переносе жирной кислоты из цитоплазмы в матрикс митохондрий?
27. Какой метаболит образуется при b-окислении жирных кислот?
28. Какие существуют пути утилизации активной уксусной кислоты (ацетил-КоА)?
29. Какой метаболит еще, кроме ацетил-КоА, образуется при окислении жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов?
30. Какова особенность b-окисления ненасыщенных жирных кислот?
31. Какая жирная кислота преимущественно синтезируется в организме человека?
32. Какие вещества необходимы для синтеза пальмитиновой кислоты?
33. В чем заключается ключевая роль ацилпереносящего белка (АПБ-SH)?
34. Назовите источники НАДФН+Н+, необходимые для синтеза жирных кислот.
35. Из какого метаболита синтезируется холестерин?
36. Назовите функции холестерина.
37. Патогенез каких заболеваний связан с гиперхолестеринемией?
38. Как рассчитывается холестериновый индекс атерогенности?
39. Какие метаболиты относятся к кетоновым телам?
40. Из чего они образуются?
41. Где синтезируются кетоновые тела?
42. Какова роль кетоновых тел?
43. В каких тканях утилизируются кетоновые тела?
44. Что такое кетоз?
45. При каких состояниях развивается кетоз?
46. Каковы основные причины возникновения кетозов у крупного рогатого скота?
47. Классификация кетозов.
48. Что такое жировая инфильтрация печени?
49. Назовите липотропные факторы.
50. Какие гормоны усиливают липолиз (мобилизацию жира из жировых депо)?
51. Какие гормоны усиливают липогенез?
Дата: 2019-12-10, просмотров: 253.
