Сохранение активности штамма

Индуцированные путем генетических манипуляций свойства, как правило, являются нестабильными, и новый штамм подвергается реверсии, т.е. обратному мутированию. Ревертанты бывают более жизнеспособными и вытесняют из популяции высокопродуктивные клетки мутанта. Работа селекционера не заканчиваете получением нового, высокопродуктивного штамма; новые свойства необходимо закрепить. Необходимо накопить гены-модификаторы, которые постепенно «приспосабливают» новые свойства мутанта к общему метаболизму клетки. Для сохранения свойств также отбираются двойные мутанты, что уменьшает вероятное возникновения ревер-тантных форм продуцента.

Индуцированные свойства легче сохранить у мутантов, которые при культивировании имеют селективные преимущества, например требующие особых условий для выделения продуцента. Иногда уже при селекции штамма удается индуцировать свойства, автоматически обеспечивающие преимущество перед ревертантами.

В большинстве случаев в промышленных условиях не удается обеспечить селективные преимущества мутантам, их приходится регулярно клонировать и отбирать из популяции клеток активные клоны.

Консервация продуцентов

Кроме сохранения активности в промышленных и лабораторных условиях важно обеспечить жизнеспособность штамма при более или менее длительном его хранении. Наиболее распространенный способ поддержания жизнедеятельности культур — периодические пересевы продуцента на свежие питательные среды. Однако при многократных пересевах увеличивается возможность реверсии и потери активности продуцента, поэтому любой продуцент-мутант лучше хранить в консервированном виде. При этом микроорганизмы сохраняют жизнеспособность в течение 10—30 лет и дольше. С точки зрения количественного сохранения не имеет значения, сколько сохранилось клеток — 100% или 0,0001% — из совокупности, включающей, скажем, 109 клеток.

Понижение температуры до 0—4 °С не препятствует делению клеток. Его можно остановить только путем замораживания или обезвоживания клеток. Большинство промышленных микроорганизмов можно сохранить в активной форме в холодильнике при 4—6 °С в течение 1—2 мес. При температуре ниже О °С жизнедеятельность клеток замедляется, поэтому микроорганизмы нередко хранят в замороженном состоянии. Выживаемость в этом случае зависит от скорости замораживания и последующего оттаивания, от состава суспензионной среды и температуры хранения. Массовая гибель микроорганизмов при замораживании наблюдается в диапазоне температур от — 15 до —35 °С. Выживаемость микроорганизмов максимальна, если их хранить при температуре ниже —130 °С (в качестве хладагента обычно используют жидкий азот температурой —196 °С). Обычно после 3—5-летнего хранения на холоде выживаемость микроорганизмов 40—70%, после 10—20-летнего хранения — 10—20%.

Другим широко применяемым способом консервации является хранение культур под слоем минерального масла. Метод чрезвычайно прост: масло предохраняет субстрат от высыхания и ограничивает доступ атмосферного кислорода. Микроорганизмы, образующие споры, обладают большей устойчивостью при хранении под маслом, поэтому данный метод часто используют для консервации микромицетов. Обычно применяют вазелиновое масло высокой вязкости (плотность 0,8—0,9). Масло предварительно стерилизуют в автоклаве при 1,0—1,5 кгс/см2 или в электрическом сушильном шкафу при 150—170 °С в течение 1,5 ч. P?nicillium chrysogenum — продуцент пенициллина — сохраняет активность и жизнеспособность после 3—5-летнего хранения под маслом.

Все применяемые способы искусственной консервации микроорганизмов являются попыткой в той или иной форме смоделировать самосохранение микроорганизмов в экстремальных условиях. Интерес микробиологов давно привлекают почва, а также торф, песок и другие природные субстраты, в которых в состоянии анабиоза микроорганизмы могут сохранять жизнеспособность сотни лет. К сожалению, почву чрезвычайно трудно простерилизовать, поэтому нередко применяют промытый и простерилизованный кварцевый песок. Высушенные микромицеты рода Fusarium в песке сохраняют жизнеспособность даже после 10—15-летнего хранения.

Для сохранения спор микромицетов (например, Aspergillus niger — продуцента лимонной кислоты) используют активный уголь, смешивая его со спорами продуцента в соотношении (2—5) : 1 и подсушивая смесь до влажности 20—25%. При комнатной температуре споры могут храниться более 10 лет, их выживаемость 20-25%.

Культуры грибов удобно хранить на естественно или принудительно высушенных питательных субстратах. Выращенные на карто-фельно-декстриновом агаре и высушенные при комнатной температуре представители родов P?nicillium, Mucor, Aspergillus, Fusarium и др. в холодильнике при температуре 6—7 °С сохраняют жизнеспособность 3 года и дольше. Широко применяют выращивание и хранение продуцентов пенициллина на пшене. После спорообразования выращенные на пшене микромицеты высушивают в вакууме и сохраняют при температуре 4—6 °С в течение 4—5 лет.

Для консервации применяют также высушивание спор в вакууме или высушивание живых клеток (дрожжей) в конвективной сушилке. Выживаемость высушенных клеток зависит от скорости и режимов высушивания и от скорости регидратации клеток. Применяют также особые защитные вещества, например глутаминовую кислоту.

Продуценты, способные образовывать споры, длительное время можно сохранять в виде спор, ибо спора — естественный анабионт, приспособленный для продолжительного пассивного существования. Так, для сохранения винных дрожжей их выращивают на агаре с дефицитом питательных веществ. В таких неблагоприятных для существования условиях большинство дрожжевые клеток (60—80%) формируют эндоспоры, которые в высушенном виде сохраняют жизнеспособность и специфические свойства в течение 2—4 лет.

В настоящее время самый распространенный способ сохранения микробных культур — лиофилизация. Она заключается в том, что вода при пониженном атмосферном давлении испаряется из замороженного материала, превращаясь в пар, минуя жидкое состояние. Обычно микробные культуры лиофилизуют при температуре от —45 до —60 °С в течение 1—2 ч при остаточном атмосферном давлении 200—500 мм рт. столба. Большинство спор грибов и вегетативные клетки бактерий, высушенные при лиофильной сушке, сохраняют жизнеспособность в течение 15—50 лет.

В целях увеличения выживаемости вегетативных клеток микробов перед лиофилизацией их, как правило, помещают в защитные среды (стерильную бычью сыворотку, лошадиную сыворотку, смесь 10%-ного раствора сахарозы и 1%-ного раствора желатина и др.). Защитные среды, очевидно, регулируют осмотическое давление клетки при высушивании.

Для успешной лиофилизации необходимо учитывать следующие факторы:

• лиофилизируемые культуры следует выращивать в оптимальных условиях;

• культуру для лиофилизации берут в конце экспоненциальной фазы роста;

• лучшим субстратом для приготовления суспензии клеток или спор перед лиофилизацией считаются сахарозо-желатиновая среда или обезжиренное молоко;

• концентрацию суспензии для лиофилизации следует устанавливать индивидуально для каждой лиофилизируемой культуры;

• остаточная влажность лиофилизата должна быть в пределах 2%. Такие культуры в лиофилизированном состоянии можно хранить при комнатной температуре. Если остаточная влажность лиофилизата превышает 2%, его следует хранить при температуре 2-4 °С.

Методика реактивации (вывод из состояния анабиоза) существенно отражается на выживаемости клеток и должна быть разработана для каждой культуры отдельно.

Часто при переходе от лабораторных условий к культивированию в промышленных масштабах происходит утрата свойств продуцентов. Для уменьшения этих потерь необходимо в биореакторе создать условия, максимально приближенные к условиям лаборатории. Применение антимутагенов (веществ, снижающих частоту спонтанных мутаций) препятствует накоплению ревертантов. При масштабировании сохранению свойств, полученных селекционером, способствуют использование двойных мутантов и создание условий, в которых продуцент получает преимущества.

Методы генной инженерии позволяют вводить в клетки гены, определяющие антагонизм к клеткам, не содержащим эти гены. Так, можно использовать киллерные свойства дрожжей или колицино-генные свойства кишечной палочки. Включая эти гены в клетки продуцентов, можно уменьшить опасность роста в биореакторах посторонней микрофлоры.

Важно так проводить селекцию продуцентов, чтобы они смогли размножаться при высоких концентрациях субстрата, при которых не способны расти ревертанты. Например, метанолутилизирующие бактерии, полученные путем плазмидного переноса генов, способны расти при концентрациях метанола, при которых подавляется развитие утративших плазмиду бактерий того же вида.

Основные задачи хранения культур - Поддержание их жизнеспособности, сохранение стабильности таксономически важных признаков, а также любых других определенных свойств, представляющих интерес для науки и практики.

В коллекциях жизнеспособность микроорганизмов поддерживается преимущественно следующими методами

1) периодическими пересевами (субкультивирование);

2) под минеральным маслом;

3) высушиванием;

4) лиофилизацией;

5) в условиях низких и ультранизких температур.

Субкультивирование- традиционный метод хранения культур (чаще всего аспорогенных) и заключается он в пересевах культур на свежие питательные среды один-два раза в месяц. Между пересевами микроорганизмы хранят в темноте при температурах 5 - 20°С. При использовании этого метода хранения культур должны быть соблюдены три условия

1) подходящая поддерживающая среда; 2) идеальная температура хранения; 3) необходимая частота пересевов.

Преимуществом метода является простота и удобный визуальный контроль за чистотой культуры или ее морфологической изменчивостью, а к недостаткам следует отнести возможность заражения, краткосрочность хранения, трудоемкость работы и большой расход реактивов.

Хранение под минеральным маслом заключается в следующем: культуру микроорганизмов выращивают на благоприятной агаризованной питательной среде и заливают стерильным вазелиновым маслом. Слой масла (0,5 - 1,0 см) замедляет скорость обменных процессов микроорганизмов и предохраняет поверхность среды от высыхания. Покрытые маслом культуры хранят в холодильнике. Большинство сапрофитных бактерий сохраняют жизнеспособность в течение 8 - 14 лет, дрожжи и мицелиальные грибы пересевают через 2 - 3 года.