Обобщенная технологическая схема процесса микробного синтеза

Технологические процессы, базирующиеся на микробном синтезе, можно представить в виде определенной последовательности стадий, причем большинство из них общие для любого микробиологического производства (рис. 4.4): приготовление посевного материала; приготовление и стерилизация питательных сред; ферментация; выделение целевого продукта и получение его препаративной формы. Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций: стерилизацию оборудования и коммуникаций, приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др.

Рис. 4.4. Схема типового микробиологического производства

В промышленных условиях питательные среды обычно готовят в отдельном цехе, обеспечивающем потребности всех основных цехов завода. Среды готовят в емкостях, снабженных механическими мешалками, добавляя в определенной последовательности растворимые (сахара, минеральные соли, кукурузный экстракт) и нерастворимые (соевая мука, кукурузная мука, мел) компоненты. При необходимости отдельные компоненты подвергают дополнительной обработке: измельчению, просеиванию, отвариванию, экстрагированию и т.д.; крахмалсодержащее сырье клейстеризуют. Для лучшего растворения компонентов среду нагревают до 70—80 °С острым паром.

При приготовлении питательных сред для глубинного культивирования особое внимание уделяют их тщательной гомогенизации. Твердые частицы нерастворимых компонентов должны быть достаточно мелкими, это облегчает их потребление микроорганизмами и обеспечивает надежность стерилизации, так как крупные частицы медленнее прогреваются, резко повышается вероятность сохранения в них посторонней микрофлоры, особенно при непрерывной стерилизации.

Приготовленную питательную среду передают в цех ферментации, стерилизуют в установках непрерывной стерилизации (УНС) и заполняют ею предварительно простерилизованные ферментёры. В некоторых случаях среду стерилизуют непосредственно в ферментёре (обычно при небольших объемах среды).

Для засева промышленного ферментёра необходимо достаточно большое количество посевного материала (обычно 5—10% объема ферментационной среды). Его выращивают в несколько стадий. Исходную музейную культуру продуцента, поступающую с посевной станции, выращивают в пробирках на скошенных агаризованных питательных средах. Полученную культуру смывают с поверхности твердой среды стерильной водой и переносят в колбы Эрленмейера («маточные» колбы), заполненные 50—100 мл жидкой питательной среды. Засеянные колбы устанавливают на качалку и выращивают в течение 18—48 ч при поддержании температуры, оптимальной для данного продуцента. Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования. Как правило, наиболее пригодна для дальнейшего использования посевная культура, развитие которой находится в конце логарифмической фазы роста. При необходимости получения относительно больших количеств посевного материала его выращивают в 2—3 стадии.

Выращенным материалом засевают посевной аппарат (иноку-лятор), загруженный предварительно простерилизованной питательной средой, где процесс роста культуры продолжается. В ходе культивирования осуществляют аэрацию и перемешивание среды, регулирование температуры, pH, пеногашение. Количество стадий выращивания посевного материала в аппаратах может быть различным и зависеть от объема основных ферментеров и расхода посевного материала. Как правило, используют инокуляторы объемами 0,10; 0,63; 2,00; 5,00 и 10,00 м³. На всех этапах выращивания контролируют качество посевного материала (в основном по морфологическим признакам) и отсутствие в нем посторонней микрофлоры. Полученный на последней стадии вегетативный посевной материал передается в ферментёр. Описанные выше подготовительные стадии микробиологического процесса рассмотрены для культур, выращиваемых в глубинных условиях. При поверхностном культивировании подготовительные операции в принципе те же, но режимы и оборудование для их проведения совершенно другие.

Продукты микробного синтеза

Антибиотики -- один из первых продуктов микробиологического синтеза, которые широко производят для медицины и сельского хозяйства. Большинство антибиотиков накапливается вне клеток микроорганизма-продуцента, которыми в основном являются Актиномицеты, некоторые грибы и бактерии, главным образом их мутантные формы. Антибиотические препараты, употребляемые преимущественно в медицине, отличаются высокой степенью чистоты. На корм животным чаще идёт концентрат среды после выращивания в ней продуцента, иногда вместе с биомассой, содержащий значительное количество др. продуктов обмена веществ продуцента, в том числе витамины, аминокислоты, нуклеотиды и т.п. Некоторые антибиотики (фитобактериомицин, трихотецин, полимиксин) используются как средства защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.

Витамины, провитамины, коферменты. Методом микробиологического синтеза производят в основном витамин B12, а частично и витамин B2 и его коферментную форму -- флавинадениндинуклеотид (ФАД), каротиноиды, эргостерин. Кроме того, развивается производство разных др. соединений этого типа (никотинамидные коферменты и др.). Витамин B12 получают практически только путём микробиологического синтеза. Основными продуцентами при этом служат пропионовокислые бактерии, актиномицеты, а также комплекс метанобразующих бактерий, использующих отходы бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) и применяемых в основном для получения кормового концентрата (высушенная среда с биомассой продуцента). Многие микроорганизмы способны к сверхсинтезу витамина B2 с активным выделением его в среду, но в качестве промышленных продуцентов употребляют наиболее активные культуры, главным образом грибы Eremothecium ashbyii и Ashbya gossipii. Помимо свободного витамина, при помощи Е. ashbyii получают также ФАД. в-каротин -- провитамин витамина А, получаемый также другими способами (извлечение из моркови и др. объектов, химический синтез), образуется наряду с другими каротиноидами многими микроорганизмами и содержится в клетках, придавая биомассе характерную окраску от жёлтой до красных тонов; однако наибольший практический интерес представляет культура Blakeslea trispora -- самый активный синтетик, которым и пользуются в основном в качестве продуцента при промышленном биосинтезе. Эргостерин -- провитамин витамина D2 -- содержится в клетках многих дрожжей; основным источником его промышленного получения служат пекарские дрожжи. Однако уже имеются дрожжевые культуры со значительно более высоким уровнем накопления эргостерина. Комплекс витаминов и коферментов синтезируется, кроме того, в процессе развития дрожжей и накапливается в дрожжевой биомассе, которая привлекает всё более пристальное внимание как источник этих соединений.

Ферменты, синтезируемые микроорганизмами, и создаваемые на их основе ферментные препараты приобрели большое значение в народном хозяйстве, особенно в пищевой промышленности. Продуцентами ферментов -- протеаз, амилаз, фосфатаз, целлюлаз, пектиназ, глюкозооксидазы, липаз, каталазы -- служат многие мицелиальные грибы, некоторые актиномицеты и бактерии. В зависимости от локализации фермента подвергают обработке микробную массу или фильтрат, свободный от микробных клеток. Получение чистых ферментных препаратов связано со значительными технологическими трудностями. Такие препараты обычно очень дороги; поэтому в промышленности используют комплексные препараты, содержащие, например, протеазы и липазы, протеазы и амилазы.

Аминокислоты. Наблюдаемый во многих странах недостаток ряда аминокислот в рационах человека и кормах животных вызвал промышленное их получение, в том числе и методом микробиологического синтеза. Существенное преимущество микробиологического синтеза аминокислот перед химическим методом заключается в получении их непосредственно в виде природных изомеров (L-формы). Из аминокислот наиболее важны Лизин и Глутаминовая кислота. Продуцентами аминокислот обычно служат культуры бактерий, относящихся к родам Brevibacterium и Micrococcus; для производства используются преимущественно мутанты-ауксотрофы, осуществляющие сверхсинтез соответствующей аминокислоты с выделением её в среду.

Нуклеотиды. Широкое развитие микробиологического синтеза нуклеотидов, в частности инозиновой, гуаниловой и др. кислот, получил в Японии, где они используются главным образом как добавки к специфическим продуктам восточной кухни. В будущем нуклеотиды приобретут, вероятно, более важное значение в качестве регуляторов многих энзиматических и гормональных процессов в животном организме. Накопление нуклеотидов происходит преимущественно в культуральной жидкости, т. е. вне клеток продуцентов. Для нуклеотидов, как и аминокислот, используются биохимические мутанты с выраженным сверхсинтезом нужного соединения.

Белок и белково-витаминные препараты. Особое значение как источник белка имеет микробная биомасса. Производство такой биомассы на дешёвом сырье рассматривают как одно из средств устранения растущего белкового дефицита в питании человека и животных. Наиболее интенсивное развитие получили промышленные методы синтеза так называемых кормовых дрожжей, применяемых в виде сухой биомассы как источник белка и витаминов в животноводстве. Кормовые дрожжи содержат значительном количество белка (до 50--55%), в состав которого входят незаменимые аминокислоты, например лизин, Триптофан, Метионин; они богаты витаминами, многими микроэлементами. Для выращивания кормовых дрожжей использовали преимущественно дешёвое углеводное сырьё -- гидролизаты отходов деревообрабатывающей промышленности, непищевых растительных материалов (подсолнечная лузга, стержни кукурузных початков и т.п.), сульфитные щелока, различные виды барды и т.д. Ныне в крупных промышленных масштабах организуется производство дрожжей на углеводородах (налканах, газойле, различных фракциях нефти). Большие запасы этого сырья позволяют планировать крупнотоннажное производство микробной биомассы. Для получения белково-витаминной биомассы изучается также возможность применения бактерий. Многие бактерии хорошо растут на углеводородах, в частности газообразных (например, на метане), а также на др. источниках углерода (например, на метаноле и уксусной кислоте). Углеводороды и их производные привлекают внимание и как сырьё для микробиологического синтеза отдельных физиологически активных соединений (аминокислот, витаминов, нуклеотидов и т.д.).

К числу продуктов микробного синтеза следует отнести и некоторые средства защиты растений: бактериальные энтомопатогенные препараты (например, энтобактерин, инсектин, дендробациллин), вызывающие гибель вредных насекомых и предотвращающие их массовое размножение. Указанное действие вызывают своеобразные «белковые кристаллы» -- носители токсичности, расположенные в микробных клетках.