Цикл начинается со взаимодействия молекулы ацетил-СоА с щавелевоуксусной кислотой (оксалоацетатом), в результате которого образуется шестиуглеродная трикарбоновая кислота, называемая лимонной. Далее следует серия реакций, в ходе которых происходит высвобождение двух молекул С02 и регенерация оксалоацетата. Поскольку количество оксалоацетата, необходимое для превращения большого числа ацетильных единиц в С0₂, весьма невелико, можно считать, что оксалоацетат выполняет каталитическую роль.

Цикл лимонной кислоты является механизмом, обеспечивающим улавливание большей части свободной энергии, освобождаемой в процессе окисления углеводов, липидов и белков. В процессе окисления ацетил-СоА благодаря активности ряда специфических дегидрогеназ происходит образование восстановительных эквивалентов в форме водорода или электронов. Последние поступают в дыхательную цепь; при функционировании этой цепи происходит окислительное фосфорилирование, то есть синтезируется АТФ.

Ферменты цикла лимонной кислоты локализованы в митохондриальном матриксе, где они находятся либо в свободном состоянии, либо на внутренней поверхности внутренней митохондриальной мембраны; в последнем случае облегчается перенос восстановительных эквивалентов на ферменты дыхательной цепи, локализованные во внутренней митохондриальной мембране.[11, 1989]

Реакции ЦТК.

Начальная реакция - конденсация ацетил-СоА и оксалоацетата, катализируется конденсирующим ферментом, цитратсинтетазой, при этом происходит образование связи углерод-углерод между метальным углеродом ацетил-СоА и карбонильным углеродом оксалоацетата. За реакцией конденсации, приводящей к образованию цитрил-СоА, следует гидролиз тиоэфирной связи, сопровождающийся потерей большого количества свободной энергии в форме теплоты; это определяет протекание реакции слева на право до ее завершения:

Ацетил-СоА + Оксалоацетат + Н₂О → Цитрат + CoA-SH

Превращение цитрата в изоцитрат катализируется аконитазой, содержащей железо в двухвалентном состоянии. Эта реакция осуществляется в две стадии: сначала происходит дегидратация с образованием цис-аконитата (часть его остается в комплексе с ферментом), а затем - гидратация и образование изоцитрата:

Цитрат ↔ цис -Аконитат ↔ Изоцитрат – Н₂О

Реакция ингибируется фторацетатом, который сначала превращается во фторацетил-СоА; последний конденсируется с оксалоацетатом, образуя фторцитрат. Непосредственным ингибитором аконитазы является фторцитрат, при ингибировании накапливается цитрат.

Эксперименты с использованием промежуточных соединений показывают, что аконитаза взаимодействует с цитратом ассиметрично: она всегда действует на ту часть молекулы цитрата, которая образовалась из оксалоацетата. Возможно, что цис-аконитат не является обязательным интермедиатом между цитратом и изоцитратом и образуется на боковой ветви основного пути.

Далее изоцитратдегидрогеназа катализирует дегидрогенирование с образованием оксалосукцината. Описаны три различных формы изоцитратдегидрогеназы. Одна из них, НАД-зависимая, найдена только в митохондриях. Две другие формы являются НАДФ-зависимыми, причем одна из них также находится в митохондриях, а другая в цитозоле. Окисление изоцитрата, связанное с работой дыхательной цепи, осуществляется почти исключительно НАД-зависимым ферментом:

Изоцитрат + НАД⁺ ↔ Оксалосукцинат (в комплексе с ферментом) ↔ альфакетоглутарат + СО₂+ НАДН₂

Рисунок 5. Реакции цикла Кребса.[10,1993]

Далее следует декарбоксилирование с образованием альфакетоглутарата,   которое   также   катализируется изоцитратдегидрогеназой. Важным компонентом реакции декарбоксилирования являются ионы Mg²⁺ (или Мn²⁺). Судя по имеющимся данным, оксалосукцинат, образующийся на промежуточной стадии реакции, остается в комплексе с ферментом.

Альфакетоглутарат, в свою очередь, подвергается окислительному декарбоксилированию, сходному с окислительным декарбоксилированием пирувата: в обоих случаях субстратом является альфакетокислота. Реакция катализируется альфакетоглутаратдегидрогеназным комплексом и требует участия того же набора кофакторов - тиаминдифосфата, липоата, НАД⁺, ФАД и СоА; в результате образуется сукцинил-СоА - тиоэфир, содержащий высокоэнергетическую связь.

α-кетоглуторат + НАД⁺ + CoA-SH → Сукцинил-СоА + СО₂ + НАДН+Н⁺

Равновесие реакции настолько сильно сдвинуто в сторону образования сукцинил-СоА, что ее можно считать физиологически однонаправленной. Как и при окислении пирувата, реакция ингибируется арсенатом, что приводит к накоплению субстрата (альфакетоглутарат).

Продолжением цикла является превращение сукцинил-СоА в сукцинат, катализируемое сукцинаттиокиназой (сукцинил-СоА-синтетазой):

Сукцинил-СоА + Ф_Н + ГДФ↔ Сукцинат + ГТФ + CoA-SH

Одним из субстратов реакций является ГДФ (или ИДФ), из которого в присутствии неорганического фосфата образуется ГТФ (ИТФ). Это - единственная стадия цикла лимонной кислоты, в ходе которой генерируется высокоэнергетическая фосфатная связь на субстратном уровне; при окислительном декарбоксилировании α-кетоглутарата потенциальное количество свободной энергии достаточно для образования НАДН и высокоэнергетической фосфатной связи. В реакции, катализируемой фосфокиназой, АТФ может образовываться как из ГТФ, так и из ИТФ. Например:

ГТФ+АДФ «ГДФ+АТФ.

В альтернативной реакции, протекающей во внепеченочных тканях и катализируемой сукцинил-СоА-ацетоацетат-СоА-трансферазой, сукцинил-СоА превращается в сукцинат сопряженно с превращением ацетоацетата в ацетоацетил-СоА. Впечени имеется диацилазная активность, обеспечивающая гидролиз части сукцинил-СоА с образованием сукцината и СоА.

Далее сукцинат дегидрогенируется, затем присоединяется молекула воды, и следует еще одна стадия дегидрогенирования, приводящая к регенерации оксалоацетата:

Сукцинат + ФАД « Фумарат + ФАДН₂

Первое дегидрогенирование катализируется сукцинатдегидрогеназой, связанной с внутренней поверхностью внутренней митохондриальной мембраны. Это единственная дегидрогеназная реакция ЦТК, в ходе которой осуществляется прямой перенос с субстрата на флавопротеин без участия НАД⁺. Фермент содержит ФАД и железо-серный белок. В результате дегидрогенирования образуется фумарат. Как показали эксперименты с использованием изотопов, фермент стереоспецифичен к транс-атомам водорода метиленовых групп сукцината. Добавление малоната или оксалоацетата ингибирует сукцинатдегидрогеназу, что приводит к накоплению сукцината.

Фумараза (фумаратгидротаза) катализирует присоединение воды к фумарату с образованием малата:

Фумарат +Н₂О « L-малат

Фумараза специфична к L-изомеру малата, она катализирует присоединение компонентов молекулы воды по двойной связи фумарата в транс-конфигурации. Малатдегидрогеназа катализирует превращение малата в оксалоацетат, реакция идет с участием НАД⁺:

L-малат + НАД⁺ « 0ксалоацетат + НАДН₂

Хотя равновесие этой реакции сильно сдвинуто в направлении малата, реально она протекает в направлении оксалоацетата, поскольку он вместе с НАДН постоянно потребляется в других реакциях.

Ферменты цикла лимонной кислоты, за исключением альфакетоглутарат- и сукцинатдегидрогеназы, обнаруживаются и вне митохондрий. Однако некоторые из этих ферментов (например, малатдегидрогеназа) отличаются от соответствующих митохондриальных ферментов.

Энергетика цикла лимонной кислоты.

 В результате окисления, катализируемого дегидрогеназами ЦТК, на каждую катаболизируемую за период одного цикла молекулу ацетил-СоА образуются три молекулы НАДН и одна молекула ФАДН₂. Эти восстановительные эквиваленты передаются в дыхательную цепь, локализованную в митохондриальной мембране. При прохождении по цепи восстановительные эквиваленты НАДН генерируют три высокоэнергетические фосфатные связи посредством образования АТФ из АДФ в процессе окислительного фосфорилирования. За счет ФАДН₂ генерируется только две высокоэнергетические фосфатные связи, поскольку ФАДН₂ переносит восстановительные эквиваленты на кофермент Q и, следовательно, в обход первого участка цепи окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи. Еще один высокоэнергетический фосфат генерируется на одном из участков цикла лимонной кислоты, то есть на субстратном уровне, при превращении сукцинил-СоА в сукцинат. Таким образом, за период каждого цикла образуется 12 новых высокоэнергетических фосфатных связей.