Описание: культуру выращивали на среде, содержащей ЭДТА и глюкозу (вариант 4 – контроль), а после исчерпания глюкозы на девятые сутки роста добавляли ЭДТА (вариант 5). ЭДТА очень быстро потребился и уже на 11 сутки роста культуры ЭДТА в среде не был обнаружен (рис. 3.2.3.1, приложение 11). Биомасса значительно увеличилась и прирост ее на этот период составил 0,325 г/л, после чего наступила стационарная фаза.
Выход клеток по массе и по энергии из ЭДТА в контроле составили 22,8% и 32,6% соответственно, а в опыте 16,9% и 24,1% соответственно (табл. 3.2.3.1).
На 13 сутки к культуре, выращенной на глюкозе, добавили ЭДТА (вариант 7). Потребление ЭДТА происходило быстро и закончилось на 15 сутки роста (рис. 3.2.3.2, приложение 12). Прирост биомассы был небольшим, и составил за этот период 0.146 г/л.
Выход клеток по массе из ЭДТА в варианте 7 составил 9,2%, а по энергии 13,1% (табл.3.2.3.2).
При добавлении ЭДТА к 13-суточной культуре, выращенной в присутствии глюкозы (вариант 9), потребление ЭДТА произошло быстро и закончилось на следующие сутки (рис. 3.2.3.3 и приложение 13), однако прирост биомассы был незначителен. Выход клеток по массе из ЭДТА составил 6,6%, а выход клеток по энергии – 9,4% (табл. 3.2.3.3).
В итоге можно сделать следующее заключение. Во-первых, культура сохраняет способность к ассимиляции ЭДТА, добавленного на разные сутки роста штамма LPM-4 в присутствии глюкозы. Следовательно, клетки сохраняют способность к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА даже после длительного потребления глюкозы.
Во-вторых, значения выхода клеток по массе и по энергии из ЭДТА с увеличением времени роста культуры уменьшаются, что, по-видимому, связано с истощением питательных компонентов среды. В-третьих, выход клеток по массе и энергии из ЭДТА и выход клеток по массе и энергии из глюкозы мало отличаются друг от друга.
Таблица 3.2.3.1.
Показатели роста штамма LPM-4 при добавлении ЭДТА или глюкозы к 9 суточной культуре, выращенной в присутствии глюкозы
Показатели
Добавки
Таблица 3.2.3.2.
Показатели роста штамма LPM-4 при добавлении ЭДТА или глюкозы к 13-суточной культуре, выращенной в присутствии глюкозы
Показатели | Добавки | ||
Контроль (вариант 6) | ЭДТА (вариант 7) | Глюкоза (варианты 8) | |
ЭДТА потребленный, г/л | - | 1,58 | - |
Глюкоза потребленная, г/л | 1,69 | - | 1,64 |
Биомасса максимальная, г/л | 0,721 | 0,845 | 0,839 |
Биомасса в день добавки, г/л | 0,426 | 0,699 | 0,682 |
Биомасса, образованная из внесенного субстрата, г/л | 0,295 | 0,146 | 0,157 |
Выход клеток по массе из ЭДТА,UЭДТА% | - | 9,2 | - |
Выход клеток по массе из глюкозы, UГлюкоза% | 17,5 | - | 9,6 |
Выход клеток по энергии из ЭДТА, hЭДТА% | - | 13,1 | - |
Выход клеток по энергии из глюкозы, hГлюкоза% | 21,9 | - | 12.0 |
Таблица 3.2.3.3.
Показатели роста штамма LPM-4 при добавлении ЭДТА или глюкозы к 21-суточной культуре, выращенной в присутствии глюкозы
Показатели | Добавки | ||
Контроль (вариант 8) | ЭДТА (вариант 9) | Глюкоза (вариант 10) | |
ЭДТА потребленный, г/л | - | 1,57 | - |
Глюкоза потребленный, г/л | 1,64 | - | 0,87 |
Биомасса максимальная, г/л | 0,839 | 0,880 | 0,851 |
Биомасса в день добавки, г/л | 0,682 | 0,777 | 0,818 |
Биомасса, образованная из внесенного субстрата, г/л | 0,157 | 0,103 | 0,033 |
Выход клеток по массе из ЭДТА,UЭДТА% | - | 6,6 | - |
Выход клеток по массе из глюкозы, UГлюкоза% | 9,6 | - | 3,8 |
Выход клеток по энергии из ЭДТА, hЭДТА% | - | 9,4 | - |
Выход клеток по энергии из глюкозы, hГлюкоза% | 12.0 | - | 4,8 |
Таким образом, полученные результаты показывают, что штамм LPM-4 сохраняет способность к деградации ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду, что приводит к увеличению биомассы. Также доказано, что ЭДТА-индуцированная способность штамма LPM-4 к ассимиляции неростового субстрата глюкозы является стабильной и сохраняется в течение длительного культивирования с подпиткой глюкозой. Снижение прироста биомассы с увеличением времени культивирования объясняется, по-видимому, истощением питательной среды. Показано, что неростовой субстрат, то есть глюкоза, в процессе длительного культивирования становится ростовым субстратом. Установлена способность бактерий к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования.
Заключение
В результате проведенных исследований установлено, что присутствие косубстрата (глюкозы) не оказывает влияния на деградацию ростового субстрата (ЭДТА) штаммом LPM-4.
При внесении глюкозы в среду до посева ее потребление началось после завершения деградации ЭДТА и сопровождалось увеличением плотности биомассы в два раза по сравнению с контролем. При внесении косубстрата в момент исчерпания ростового субстрата, индукция ассимиляции косубстрата требует длительной лаг фазы, вероятно, из-за недостатка энергии. Не обнаружено ассимиляции глюкозы при ее внесении в среду через 1-3 суток после потребления ЭДТА.
Величины выхода клеток по массе из ЭДТА и глюкозы (при внесении глюкозы до посева или на 1-3 сутки) мало различались и составили 22,4% и 19,9-21,4% соответственно. Однако, поскольку ЭДТА и глюкоза характеризуются различным энергосодержанием, более правильно сравнивать энергетический выход клеток из этих субстратов. Энергетический выход характеризует долю энергии субстрата, перешедшую в биомассу. Поскольку энергосодержание глюкозы выше, чем ЭДТА (значения gs составляют 1,6 и 1,4 соответственно), выход биомассы по энергии из ЭДТА был выше, чем из глюкозы и составлял 32%, тогда как выход клеток по энергии из глюкозы изменялся в пределах от 24,9 до 26,8 %.
Анализируя результаты второго этапа опытов, мы убедились, что культура сохраняет способность ассимилировать ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду. Повторное добавление ЭДТА в среду приводит к увеличению биомассы, то есть запаса питательных компонентов среды достаточно для поддержания роста клеток.
Показано, что штамм LPM-4 сохраняет ЭДТА-индуцированную способность ассимилировать глюкозу при многократном ее введении. Несколько сниженная ассимиляция глюкозы по сравнению с контролем и незначительный прирост биомассы при длительном культивировании бактерий (в течение 13-21 суток) объясняется тем, что в среде уже отсутствуют компоненты питательной среды, необходимые для роста культуры. Низкие показатели выхода клеток по массе и энергии при длительном культивировании говорят о том, что хоть глюкоза и потребляется, но синтеза биомассы не происходит.
Показано, что клетки штамма LPM-4 сохраняют способность к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования.
Результаты данного исследования важны для дальнейшей разработки нового биопрепарата по очистке сточных вод, который будет включать ЭДТА-разрушающий штамм LPM-4. Полученные данные помогут в выборе условий, оптимальных для деятельности штамма. Но нужно провести еще много работы, чтобы получить этот биопрепарат.
Выводы
1. Установлено, что кометаболизм ЭДТА и глюкозы у штамма LPM-4 не оказывает влияния на деградацию ЭДТА.
2. Показано, что ассимиляция глюкозы бактериальным штаммом
3. LPM-4 индуцируется только в процессе интенсивной деградации ЭДТА.
4. Обнаружено, что штамм LPM-4 сохраняет способность к деградации ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду.
5. Доказано, что бактерии сохраняют способность к ЭДТА-индуцированной ассимиляции глюкозы в процессе длительного культивирования с многократным добавлением глюкозы.
6. Установлено, что штамм LPM-4 способен к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования в присутствии глюкозы.
Литература
1. Биологическая очистка сточных вод. http://www.rfbr.ru
2. Босоло Ф. Химия координационных соединений.- М.: Мир, 1966.-145с.
3. Kari F.G. Modeling the photochemical degradation of ethylenediaminetetraacetate in the river Glatt/ F.G. Kari, W. Giger// Environ.Ski Technol.- 1995.-V.29.-P.2814-2827.
4. Bucheli-Witschel M., T. Egli Environmental fate and microbial degradation of aminopolycarboxylic acids // FEMS Microbiol. Rev. - 2001. - V.25. - P.69 – 106
5. Gschwind N. Biologischer Abbau von EDTA in einem Modelwasser // Wasser Abwasser. – 1992. – V.133. – P.546 – 549.
6. Chistyakova T.I., Dedyukhina E.G., Satroutdinov A.D., Kaparullina E.N.,
Gavrish E.Yu., Eroshin V.K. EDTA- dependent bacterial strain.//Process Biochem. 2005. V. 40. N 2. P. 601-605.
7. Бек М. Химия равновесий реакций комплексообразования. - М.: Мир, 1973. 145с.
8. Арчаков А.И. Оксигеназы биологических мембран. - М.: Наука, 1983. – 120 с.
9. Ляхович В.В. Структурные аспекты биохимии монооксигеназ. – Новосибирск.: Наука, 1978. – 47 с.
10. Witschel M., Nagel S., Egli T. Identification and characterization of the two-enzyme system catalyzing the oxidation of EDTA in the EDTA-degrading bacterial strain DSM-9103 // J.Bacteriol. – 1997. – V.179. – P.6937 – 6943.
11. Lauff J.J., Steele D.B., Coogan L.A., Breitfeller J.M. Degradation of the ferric chelate of EDTA by a pure culture of an Agrobacterium sp. // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V.56. P. 3346-3353.
12. Nötermann B. Total degradation of EDTA by mixed cultures and a bacterial isolate // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58. P. 671-676.
13. Chistyakova T.I., E.N. Kaparullina, E.Yu. Garvish, V.K. Eroshin. A novel-EDTA-degrading Pseudomonas sp. // World Journal of Microbiology and Biotechnology 2003 P.977-980
14. Foster J.W. Hidrocarbons as substrates for microorganisms.// Antonie van Leeuwenhock J. Microbiol. And Serol. 1962
15. Higgins I.J., Best D.J., Hammond R.C. New findings in methane-utilizing bacteria highlight their importance in the biosphere and their commercial potential// Nature (London). – 1980. - 286
16. Malashenco Yu.R. Syntabolism, the transformation of non-growth substrates up to biomass by obligate methane-oxidizing bacteria // 4th Int. symp. Microbial growth on C1- compounds (Minneapolis, Sept., 1983): Abstrs. – Minneapolis,1983. – Thes. 2-10
17. Малашенко Ю.Р., Соколов И.Г., Романовская В.А. Микробный метаболизм неростовых субстратов.- Киев. Изд-во “ Наукова думка” 1987
18. Современная микробиология. Прокариоты. Под редакцией Ленгелера Й., Древса Г.- М.: Мир 2005.
19. Ваккеров-Коузова Н.Д. Характеристика почвенных бактерий, трансформирующих азобензол.// Прикладная биохимия и микробиология. 2005, №2. М.: Наука.
20. Бабошин М. А. Кометаболизм флуорена культурами Rhodococcus rhodochrous и Pseudomonas fluorescens / Бабошин М. А., Финкельштейн З. И., Головлева Л. А. // Микробиология. - 2003. - Т. 72, N 2. - С. 194-198
21. Дзюбан А. Н., Косолапов Д. Б., Кузнецов И. А. Влияние промышленно-коммунальных стоков г. Череповца на функционирование бактериальных сообществ илов Рыбинского водохранилища // 11 Международный симпозиум по биоиндикаторам "Современные проблемы биоиндикации и биомониторинга" Сыктывкар , 17-21 сент.,2001 - С. 51-52 . Рус.; рез. англ.
22. Matthew F. Verce, Ricky L. Ulrich and David L. Freedman. Transition from Cometabolic to Growth-Linked Biodegradation of Vinil Chloride by a Pseudomonas sp. Isolated on Ethene.// Environ. Sci. Technol. 2001. V.35. P. 4242-4251.
23. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функционирования клетки. – М: Мир. 1974 –957с.
24.Шлегель Г. Общая микробиология. М: Мир 1987. c. 194-197
25. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. – М: Мир. 1978. 331с.
26. bioengineering@yandex.ru, copyright 2003
27. Характеристики культур с подпиткой рекомбинантной Escherichia coli, содержащих аналог человеческого коллагена кДНК при различных удельных скоростях роста. http://www.biogene.ru/articles2.html
28. Гибридные системы биодеструкции с использованием биологически агрессивного химического реагента / Кузнецов А. Е., Сафронов В. В. // Сб. науч. тр. - Рос. хим.-технол. ун-т. , 2001 . № 179 .- С. 227-241.].
29. Минкевич И.Г. Материально-энергетический баланс и кинетика роста микроорганизмов.- Москва-Ижевск: НИЦ “Регулярная и хаотическая динамика”; Институт компьютерных исследований, 2005.-352с.
30. Satroutdinov A., Dedyukhina E., Chistyakova T., Witschel M., Minkevich I., Eroshin V., Egli T. Degradation of Metal-EDTA Complexes by Resting Cells of the Bacterial Strain DSM 9103. Environ. Sci. Technol. 2000, 34, 1715-1720
Приложение 1.
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА (вариант 1)
Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | ЭДТА, г/л | Аммоний, г/л |
0 | 7,35 | 0,025 | 0,873 | 0 |
1 | 8,13 | 0,026 | 0,734 | 7,0 |
2 | 8,52 | 0,072 | 0,526 | 8,0 |
3 | 9,21 | 0,183 | 0 | 9,9 |
4 | 9,64 | 0,179 | 0 | 13,6 |
5 | 9,77 | 0,196 | 0 | 30,0 |
6 | 9,64 | 0,182 | 0 | 33,8 |
7 | 9,59 | 0,160 | 0 | 36,2 |
8 | 9,76 | 0,157 | 0 | 36,6 |
9 | 9,55 | 0,149 | 0 | 27,0 |
10 | 9,53 | 0,128 | 0 | 30,5 |
Приложение 2
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы до посева бактерий (вариант 2)
Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | ЭДТА, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, мг/л |
0 | 7,50 | 0,019 | 0,873 | 0,91 | 0 |
1 | 8,18 | 0,031 | 0,735 | 0,86 | 7,7 |
2 | 8,33 | 0,121 | 0,440 | 0,88 | 8,2 |
3 | 9,18 | 0,257 | 0 | 0,72 | 9,7 |
4 | 9,39 | 0,297 | 0 | 0,61 | 14,3 |
5 | 9,40 | 0,293 | 0 | 0,46 | 28,6 |
6 | 9,27 | 0,311 | 0 | 0,39 | 32,3 |
7 | 8,95 | 0,348 | 0 | 0,09 | 31,4 |
8 | 9,61 | 0,378 | 0 | 0 | 28,2 |
9 | 8,72 | 0,442 | 0 | 0 | 14,8 |
10 | 8,82 | 0,528 | 0 | 0 | 13,9 |
11 | 8,85 | 0,599 | 0 | 0 | 9,0 |
12 | 8,87 | 0,657 | 0 | 0 | 8,0 |
14 | 8,62 | 0,594 | 0 | 0 | 6,9 |
Приложение 3.
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы на первые сутки роста (вариант 3)
Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | ЭДТА, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, мг/л |
1 | 8,20 | 0,022 | 0,743 | 0,98 | 7,8 |
2 | 8,33 | 0,082 | 0,452 | 0,98 | 8,7 |
3 | 9,16 | 0,232 | 0 | 0,80 | 10,4 |
4 | 9,36 | 0,268 | 0 | 0,71 | 19,2 |
5 | 9,23 | 0,274 | 0 | 0,60 | 27,2 |
6 | 9,25 | 0,306 | 0 | 0,50 | 34,3 |
7 | 8,90 | 0,360 | 0 | 0,22 | 31,0 |
8 | 9,52 | 0,391 | 0 | 0 | 26,4 |
9 | 9,49 | 0,371 | 0 | 0 | 14,6 |
10 | 9,55 | 0,361 | 0 | 0 | 14,9 |
Приложение 4
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы на 2 сутки роста (вариант 4)
Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | ЭДТА, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, мг/л |
2 | 8,43 | 0,069 | 0,477 | 1,02 | 9,2 |
3 | 9,19 | 0,223 | 0 | 0,98 | 11,4 |
4 | 9,47 | 0,205 | 0 | 0,78 | 15,1 |
5 | 9,45 | 0,235 | 0 | 0,79 | 29,4 |
6 | 9,53 | 0,244 | 0 | 0,76 | 34,7 |
7 | 9,40 | 0,208 | 0 | 0,64 | 33,8 |
8 | 9,05 | 0,304 | 0 | 0,34 | 32,8 |
9 | 9,42 | 0,392 | 0 | 0,06 | 22,0 |
10 | 9,56 | 0,399 | 0 | 0 | 14,1 |
Приложение 5
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы на 3 сутки роста (вариант 5)
Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, мг/л |
3 | 9,64 | 0,183 | 1,06 | 13,2 |
4 | 9,62 | 0,201 | 0,95 | 15,9 |
5 | 9,65 | 0,199 | 0,95 | 34,8 |
6 | 9,77 | 0,196 | 0,93 | 34,4 |
7 | 9,75 | 0,165 | 0,89 | 32,3 |
8 | 9,64 | 0,188 | 0,86 | 31,0 |
9 | 9,37 | 0,211 | 0,83 | 21,3 |
10 | 8,57 | 0,362 | 0,34 | 12,5 |
11 | 9,09 | 0,413 | 0 | 10,7 |
12 | 9,.48 | 0,423 | 0 | 9,5 |
14 | - | 0,389 | 0 | 6,4 |
Приложение 6
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы на 4 сутки роста (вариант 6)
Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, мг/л |
4 | 9,60 | 0,179 | 0,98 | 18,1 |
5 | 9,67 | 0,197 | 0,98 | 30,9 |
6 | 9,81 | 0,199 | 0,96 | 37,5 |
7 | 9,75 | 0,142 | 0,99 | 34,2 |
8 | 9,75 | 0,168 | 0,98 | 36,2 |
9 | 9,65 | 0,146 | 0,94 | 27,9 |
10 | 9,62 | 0,145 | 0,92 | 26,9 |
Приложение 7
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы на 5 сутки роста (вариант 7)
Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, г/л |
5 | 9,73 | 0,223 | 1,09 | 39,9 |
6 | 9,77 | 0,221 | 1,10 | 38,9 |
7 | 9,75 | 0,162 | 1,08 | 42,5 |
8 | 9,72 | 0,181 | 1,02 | 38,2 |
9 | 9,66 | 0,164 | 1,02 | 33,0 |
10 | 9,63 | 0,171 | 0,98 | 31,5 |
Приложение 8
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы на 6 сутки посева (вариант 8)
Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, мг/л |
6 | 9,64 | 0,227 | 0,78 | 47,1 |
7 | 9,75 | 0,179 | 0,77 | 44,2 |
8 | 9,72 | 0,193 | 0,72 | 41,6 |
9 | 9,67 | 0,166 | 0,75 | 36,8 |
10 | 9,73 | 0,149 | 0,71 | 35,6 |
Приложение 9
Таблица. Влияние добавок ЭДТА в среду на рост штамма LPM-4
Время
культиви-
рования,
сутки
Время внесения добавок ЭДТА
Контроль (до посева) (вариант 1)
4сутки
(вариант 2)
4, 6 сутки
(вариант 3)
Приложение 10.
Таблица
ЭДТА-индуцированная ассимиляция глюкозы у штамма LPM-4 при многократном добавлении глюкозы в среду.
Время
Культиви-
рования,
сутки
Время внесения добавок глюкозы
Контроль (до посева) (вариант 4)
9сутки
(вариант 6)
13 сутки
(вариант 8)
21 сутки
(вариант10)
Время
Культиви-
рования,
сутки
Время внесения добавок глюкозы
Контроль (до посева) (вариант 4)
9сутки
(вариант 6)
13 сутки
(вариант 8)
21 сутки
(вариант10)
Приложение 11
Таблица. Ассимиляция ЭДТА 9-суточной культуры штамма LPM-4, выращенной в присутствии глюкозы
Время
Культивирования,
сутки
Время внесения ЭДТА
Контроль (до посева) (вариант 4)
9 сутки (вариант 5)
ЭДТА, г/л
Глюкоза, г/л
Биомасса. г/л
ЭДТА, г/л
1,23
1,35
0,011
1,23
н/о
1,39
0,014
н/о
1,06
1,38
0,019
1,06
0,91
1,38
0,075
0,91
0
1,04
0,280
0
-
1,0
0,262
-
-
0,91
0,287
-
-
0,62
0,293
-
-
0,22
0,383
-
-
0
0,422
1,92
-
-
0,423
0,01
-
-
0,446
0
-
-
0,477
-
Время
культивирования,
сутки
Время внесения ЭДТА
Контроль (до посева) (вариант 4)
9 сутки (вариант 5)
ЭДТА, г/л
Глюкоза, г/л
Биомасса. г/л
Биомасса. г/л
13
-
-
0,477
0,713
14
-
-
0,507
0,679
15
-
-
0,474
0,700
16
-
-
-
0,733
17
-
-
-
0,748
18
-
-
-
0,759
19
-
-
-
0,716
20
-
-
-
0,666
21
-
-
-
0,725
22
-
-
-
0,739
23
0,748
24
0,747
Приложение 12
Таблица. Деградация ЭДТА 13-суточной культуры штамма LPM-4,выращенной в присутствии глюкозы.
Время
культивирования,
сутки
Время внесения ЭДТА
Контроль
(вариант 6)
13 сутки
(вариант 7)
Приложение 13
Таблица. Ассимиляция ЭДТА 21-суточной культуры штамма LPM-4,выращенной в присутствии глюкозы.
Время
культивирования,
сутки
Время внесения добавок ЭДТА
Контроль
(вариант 8)
21 сутки
(вариант 9)
Дата: 2019-07-24, просмотров: 227.