Им. В. Г. Белинского
Факультет Кафедра
Естественно-географический биохимии
Дипломная работа
Кометаболизм ЭДТА и глюкозы у бактериального штамма LPM-4
Студент __________________________________________ Юдина Е. И.
подпись
Руководители ___________________________________ Сметанин В. А.
подпись
__________________________________ Дедюхина Э.Г.
подпись
К защите допустить. Протокол № от « _ » 200 г
Зав. кафедрой ______________________________________ Генгин М.Т.
подпись
Пенза, 2007 г
Содержание
Введение ………………………………………………………………………….4
Глава 1. Обзор литературы……………………………………………….…….. 6
1.1. Хелатирующие соединения…………………………………………….….. 6
1.1.1. Свойства, строение и комплексообразование ЭДТА ………….……….6
1.2. Бактериальная деградация ЭДТА ………………………………………….7
1.2.1 Бактерии, разрушающие ЭДТА …………………………………………10
1.2.2. Характеристика штамма LPM-4………………………………………… 12
1.3. Понятие о кометаболизме …………………………………………………14
1.4. Периодическое культивирование …………………………………………20
1.5. Периодическое культивирование с подпиткой ………………………….23
Глава 2. Материалы и методы ………………………………………………….25
2.1. Условия культивирования………………………………………………….25
2.2. Методика приготовления питательных сред …………………………….26
2.3. Методы анализа…………………………………………………….……….28
2.3.1 Вычисление энергетического выхода роста штамма LPM-4 …………..29
2.3.2. Вычисление удельной скорости роста штамма LPM-4 ………………..32
Глава 3. Результаты и их обсуждение …………………………………………33
3.1. Исследование влияния степени деградации ЭДТА на ассимиляцию глюкозы бактериальным штаммом LPM-4 ……………………………………33
3.1.1. Динамика роста и потребления глюкозы и ЭДТА …………………….33
3.1.2. Динамика накопления биомассы и удельная скорость роста штамма LPM-4 …………………………………………………………………………….39
3.1.3. Накопление аммония в процессе роста штамма LPM-4 ……………….42
3.1.4. Показатели роста штамма LPM-4 при кометаболизме ЭДТА и глюкозы…………………………………………………………………………..44
3.2. Исследование способности штамма LPM-4 к ассимиляции ЭДТА и глюкозы в процессе длительного культивирования с добавлением субстрата…………………………………………………………………………46
3.2.1. Исследование ассимиляции ЭДТА штаммом LPM-4 в процессе культивирования с добавлением ЭДТА ………………………………………47
3.2.2. Исследование ЭДТА-индуцированной ассимиляции глюкозы штаммом LPM-4 в процессе длительного культивирования с добавлением глюкозы..50
3.2.3. Исследование способности штамма LPM-4 к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА ……………..52
Заключение ………………………………………………………………………60
Выводы …………………………………………………………………………..62
Литература ………………………………………………………………………63
Приложение ……………………………………………………………………..66
Введение
Проблема очистки сточных вод, производство которых в России достигает 500 литров в сутки на душу городского населения, является одной из актуальнейших проблем наступившего века. В настоящее время разработаны и развиваются современные технологии очистки сточных вод. Наибольший интерес и перспективу имеют естественные и самые дешевые биологические методы очистки, представляющие собой интенсификацию природных процессов разложения органических соединений микроорганизмами в аэробных или анаэробных условиях. Существует множество биопрепаратов, используемых для очистки сточных вод. Это консорциумы микроорганизмов, выделенные методом накопительных культур обычно из активного ила аэротенков городских сооружений очистки сточных вод. Они используются для очистки сточных вод местного значения, например в селах, дачных и коттеджных поселках, небольших поселках городского типа, мини-заводах и т.п. Биопрепараты, содержащие ограниченное число видов микроорганизмов, по спектру разлагаемых веществ уступают свежему активному илу. Однако, они содержат быстро растущие штаммы, которые инициируют процессы разложения органических загрязнений. В нестерильном процессе развиваются также микроорганизмы, содержащиеся в отходах, и в микробное сообщество включаются недостающие звенья [1].
Мониторинг окружающей среды показывает, что в ней происходит постоянное накопление ЭДТА. В мире производится примерно 100 000 тонн ЭДТА в год [2-5]. Многочисленные исследования показали, что деградации ЭДТА в очистных сооружениях не происходит, а в природе существует лишь один значимый способ деградации ЭДТА – разложение комплекса Fe (III)EDTA под действием УФ лучей, который происходит лишь на поверхности воды [3]. Накопление ЭДТА в воде приводит к ухудшению качества питьевой воды, так как ЭДТА способствует переходу в растворенное состояние ионов металлов (в том числе тяжелых и токсичных). Большая часть этих комплексов проникает в грунтовые воды и водопроводы, ухудшая качество питьевой воды. Следует обратить внимание на то, что здоровью человека в первую очередь угрожают комплексы ЭДТА с токсичными металлами, а не ЭДТА, как химическое соединение.
До настоящего времени было выделено лишь несколько смешанных культур и всего три чистые культуры ЭДТА-деградирующих бактерий:
Agrobacterium sp. ATCC 55002, грам-отрицательный изолят BNC 1,
грам-отрицательные бактерии DSM 9103 и Pseudomonas sp. LPM-410.
В лаборатории физиологии микроорганизмов ИБФМ РАН был выделен новый ЭДТА-разрушающий бактериальный штамм LPM-4 со специфической потребностью в ЭДТА [6]. Данный штамм является уникальным, т.к. способен расти только на средах, содержащих ЭДТА. Отличительной особенностью данного штамма является то, что он способен метаболизировать глюкозу только в присутствии ЭДТА.
И целью настоящей работы было исследование совместного метаболизма ЭДТА и глюкозы у бактериального штамма LPM-4.
Соответственно были поставлены следующие задачи:
1. Исследование влияния степени деградации ЭДТА на ассимиляцию глюкозы бактериальным штаммом LPM-4;
2. Изучение способности клеток к деградации ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду;
3. Исследование ЭДТА-индуцированной способности клеток ассимилировать глюкозу в процессе длительного культивирования с добавлением глюкозы;
4. Изучение способности штамма LPM-4 к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования в присутствии глюкозы.
Глава 1. Обзор литературы
Бактерии, разрушающие ЭДТА
ЭДТА характеризуется высокой устойчивостью; микроорганизмы, способные разрушать это соединение, встречаются в природе очень редко. В настоящее время известно лишь четыре штамма ЭДТА-разрушающих бактерий, выделенные в чистую культуру:
1. Штамм, относящийся к роду Agrobacterium, способный разрушать комплекс Fe (III)-ЭДТА [11];
2. Штамм BNC-1, граммотрицательная бактерия, способный деградировать комплексы ЭДТА с Mg2+, Ca2+, Mn2+, Zn2+ [12];
3. Штамм DSM-9103 граммотрицательная бактерия относится к подклассу α-Proteobacteria [4], способный деградировать комплексы Mg2+-, Ca2+-, Mn2+-ЭДТА и частично хелаты с Co, Cu, Zn, Pb.;
4. Штамм LPM-410 идентифицирован как Pseudomonas sp. [13].
Характеристика штамма LPM-4
Штамм LPM-4 был выделен в лаборатории физиологии микроорганизмов ИБФМ РАН к.б.н. Чистяковой Т. И. из активного ила Пущинских очистных сооружений методом накопительной культуры [6]. Клетки неподвижны, колонии на твердой питательной среде с ЭДТА через неделю роста 0,1-0,3 см в диаметре, круглые, перламутровые с синеватым блеском. Аэроб, не обладающий запахом.
Клетки штамма имеют палочковидную форму (0,1-0,2×0,5-0,6 мкм). На среде с ЭДТА клетки могут быть одиночными или парными. Это типичная граммотрицательная бактерия (рис. 4), о чем говорит достаточно толстая клеточная стенка с волнистыми краями. Клетка содержит электронно-плотные включения (при потреблении ЭДТА), которые, как показали исследования на других штаммах, содержат Ca2+, Mg2+ и PO43- [4].
Штамм LPM-4 уникален по потребностям в питательных веществах. Установлено, что штамм способен расти только на средах, содержащих ЭДТА, и не растет на средах, содержащих глюкозу, этанол, органические кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии и неорганические (сульфат аммония, нитрат калия) или органические (мочевина, пептон, гидролизат казеина, аминопептид, дрожжевой экстракт) источники азота [6].
Данный штамм обладает положительной реакцией на наличие оксидазы и каталазы. Температурный оптимум для роста штамма 32-34˚С. Оптимум рН=7. На жидкой питательной среде с ЭДТА идет защелачивание среды в процессе роста клеток.
Клетки штамма способны разрушать различные комплексы ЭДТА с металлами. Суспензия отмытых клеток штамма разрушала ЭДТА и комплексы Ba2+-, Mg2+-, Ca2+-, Mn2+-ЭДТА с постоянной скоростью в диапозоне от 0,310 до 486 ммоль ЭДТА/(г·ч), удельная скорость разрушения Zn-ЭДТА достигала наибольшего значения (0,137 ммоль ЭДТА/(г·ч)) в течение первых 10 часов инкубации, а затем снижалась [6].
Установлено, что штамм LPM-4 способен совместно метаболизировать ЭДТА и глюкозу. Этот процесс можно назвать кометаболизмом.
Понятие о кометаболизме
Кометаболизм – это особый случай утилизации смешанных субстратов. Кометаболизм впервые наблюдал Фостер [14] в 1962 году у бактерий, утилизирующих углеводороды. Эти бактерии могут расти на метане, как на единственном источнике углерода, то есть они являются метанотрофами. Однако, они не могут утилизировать такие алканы, как этан или пропан, в качестве единственного источника углерода. Когда бактерии росли на смеси метана, этана и пропана, клетки использовали метан, а также этан и пропан, которые окислялись до продуктов, таких как ацетальдегид, уксусная кислота, пропионовая кислота и ацетон соответственно.
Фостер предложил термин соокисление для описания подобного типа трансформации субстратов. Позднее другие исследователи наблюдали подобное явление с другими типами микробной трансформации; они включают не только окисление, но также и гидролиз, дегалогенирование и так далее, то есть термин “кометаболизм” было предложено использовать в более широком смысле.
В 1982 году Дальтон и Стирлинг предложили следующее определение кометаболизма. Кометаболизм – трансформация неростового субстрата в присутствии ростового субстрата или иного метаболизируемого соединения. Под неростовыми субстратами понимают такие, которые не обеспечивают деление клеток. Ростовой субстрат выполняет несколько функций. Во-первых, поставляет энергию для бактериального роста и процессов поддержания метаболизма нерастущих клеток. Во-вторых, поставляет восстановительные эквиваленты, которые позволяют деградировать неростовые субстраты. В-третьих, ростовые субстраты индуцируют синтез катаболических ферментов, которые обнаруживают загрязняющие соединения (поллютанты) и катализируют их трансформацию. Метаболизм неростовых субстратов не поставляет никакой энергии или восстановительных эквивалентов для микроорганизмов.
Структура трансформируемого (соокисляемого) соединения часто не имеет никакой аналогии с ростовым субстратом. В этом случае связь между процессами окисления ростового и трансформируемого (неростового) субстратов реализуется на уровне интермедиатов катаболизма источника углерода. Под этим подразумевают, что при окислении ростового субстрата генерируется энергия, необходимая для функционирования ферментов, осуществляющих окисление неростовых субстратов [14].
На основе разных механизмов трансформации неростового субстрата, а также в зависимости от того, является косубстрат ростовым или неростовым, условно можно выделить четыре типа кометаболизма.
Первый тип – трансформация неростового субстрата до продукта при использовании в качестве косубстрата ростового субстрата.
Второй тип - трансформация неростового субстрата без использования ростового субстрата. Неростовой субстрат используется не как источник углерода, а только как источник энергии, необходимой для осуществления реакций кометаболизма. В обоих рассмотренных случаях трансформация ростового субстрата должна обеспечивать энергией метаболизм другого субстрата, и этот процесс осуществляется только до определенного продукта, который дальше не ассимилируется клетками.
К третьему типу кометаболизма относятся процессы ассимиляции неростовых субстратов, что сопряжено с использованием ростовых субстратов, в результате чего соединения углерода включаются в компоненты клетки. Сначала подобные процессы были описаны как миксотрофия, однако поскольку один из субстратов не является ростовым, этот термин в данном случае является некорректным. Включение углерода неростовых субстратов или продуктов их трансформации в конструктивный метаболизм, который приводит к увеличению биомассы, предложено называть дополнительным метаболизмом [15]. Поскольку данные процессы осуществляются только при ассимиляции ростового субстрата, их можно отнести к кометаболизму. В этом случае продукты трансформации неростовых субстратов являются компонентами клеток.
Четвертый тип кометаболизма – синтаболизм – способность микроорганизмов расти на смеси двух или больше неростовых субстратов [16]. Синтаболизм был выявлен у облигатных метанотрофов. Показано, что в определенных условиях они способны расти при наличии двух субстратов одновременно, каждый из которых сам по себе не является ростовым. В основе синтаболизма лежит способность метанотрофных бактерий сооокислять (вследствие неспецифичности метанмонооксигеназы) С2Н6 или СО. Установлено, что для прохождения реакции монооксигенирования С2Н6 необходима энергия, источником которой может служить окисленные производные метана или этана (метанол, формиат, этанол). Соответствующие эксперименты показали, что метанотрофы способны расти на этане (неростовой субстрат) в присутствии названных выше дополнительных неростовых субстратов.
Конечные продукты трансформации могут использоваться другими микроорганизмами в сообществе. Конечные продукты кометаболизма сложно прогнозировать, но несколько типов эффектов можно представить: если косубстрат исходно токсичен, то в результате кометаболизма будет происходить его детоксикация. Конечные продукты кометаболизма будут поставлять питательные вещества для каких-нибудь других микроорганизмов и это может привести к большему биологическому разнообразию. Конечные продукты могут быть токсичными для данных продуцентов или других микроорганизмов и результатом этого может быть эффект ингибирования. Конечные продукты кометаболизма могут быть устойчивыми и это может быть результатом увеличения устойчивости конечных продуктов [14].
В целом, процессы кометаболизма изучены недостаточно. Дальнейшее исследование их механизмов имеет не только практическую ценность, но и большое теоретическое значение, поскольку может раскрыть закономерности взаимодействия микроорганизмов с несколькими субстратами [17].
Кометаболизм – важный инструмент при изучении процессов микробиологического разложения ароматических и циклических соединений. Многие виды Pseudomonas, Nocardia, Corynebacterium, Alcaligenes, Mycobacterium, Micrococcus, Cellulomonas, Streptococcus, Flavobacterium, а также микромицетов кометаболизируют ароматические циклические и полициклические углеводороды, высшие полициклические ароматические углеводороды, их алкилзамещенные и другие производные. У одних и тех же микроорганизмов могут функционировать различные механизмы расщепления ароматического кольца, что обусловлено как строением молекулы неростового субстрата, так и условиями культивирования.
Так, Nocardia sp. DSM 43251 осуществляет кометаболизм фенола, изомеров крезола и оксианизола, 3,4-диметилфенола, галогенфенолов, 4-(метилтио)-фенола в присутствии косубстратов - сахарозы, этанола, фумарата. Фенол и монохлорзамещенные производные метаболизируются через путь 1,2-расщепления катехола (катехол-1,2-диоксигеназа); замещенные производные фенола в пара-положении (метокси- или метилтиогруппа) – через путь 2,3- расщепления.
Некоторые нокардии соокисляют n-ксилол и образуют или n-толуиловую кислоту и дигидрокси-п-толуиловую кислоты, или α, α’-диметилмуконовую кислоту в зависимости от рН среды. п-Ксилол трансформируется видами Nocardia двумя путями. Регуляция осуществляется за счет изменения специфичности оксигеназы при изменении рН. При рН 8 функционирует метильная группа оксигеназной системы и образуется п-толуиловая кислота и дигидрокси-п-толуиловая кислоты. При рН 6 метильная группа оксигеназы не функционирует, что приводит к образованию метилзамещенных муконовых кислот путем прямого дигидроксилирования и разрыва бензольного кольца. Иногда п-ксилол окисляется до п-оксиметилбензойной кислоты. Соокисление метил- и этилзамещенных нафталинов клетками Nocardia и Streptomyces, выращенными на гексадекане, приводит к окислению только одного метильного или этильного заместителя до соответствующей карбоновой кислоты. При этом имеет значение стерическое положение метильной группы.
Изучено соокисление циклоалканов. Культура граммотрицательных бактерий при росте на 2-метилбутане соокисляла циклоалканы и циклические моноалкены. Только при соокислении циклопропана происходил разрыв кольца. Соокисление С5-С8- циклопарафинов приводило к накоплению соответствующих эпоксидов, спиртов и кетонов.
Приведенные примеры кометаболизма циклических соединений свидетельствуют о том, что типы реакций превращения этих неростовых субстратов достаточно хорошо изучены. Чаще всего способность кометаболизировать неростовые субстраты объясняется неспецифичностью некоторых ферментов. Если структурно неростовой субстрат подобен ростовому, то чаще всего реакции окисления двух субстратов катализируются одними и теми же ферментами, однако процессы трансформации ростового и неростового субстратов не всегда аналогичны. Например, клетки Arthrobacter продуцируют 2-, 3- и 4-гексадеканон из н- гексадекана при росте на дрожжевом экстракте, при этом обнаружены и соответствующие 2-, 3- и 4-спирты. Глюкоза стимулирует процесс кометаболизма гексадекана. Образование этих продуктов окисления, которые далее не трансформируются, свидетельствует о том, что начальные реакции окисления гексадекана являются результатом неспецифичности ферментов, функции которых не заключаются в окислении углеводородов [17].
Классический пример кометаболизма: окисление этана метаноокисляющими бактериями: образующийся при начальной довольно неспецифической монооксигеназной реакции этанол не метаболизируется далее метилотрофами и может только служить субстратом для других бактерий в данном местообитании. В результате активность окисления этана метаноокисляющей популяцией не увеличивается, пока присутствует метан как дополнительный субстрат [18].
Еще один пример, при разложении древесины легко гидролизуемая целлюлоза (косубстрат) служит источником энергии и электронов для образования Н2О2, с участием которого расщепляется устойчивый к деградации лигнин.
Такие микроорганизмы, как Bacillus cereus SNK 12, Paenibacillus polymyxa SNK 2, Azotobacter chroococcum ANK ΙΙ, Ochrobactrum intermedium ANK Ι cпособны к деградации азобензола в условиях кометаболизма. При этом В.cereus SNK 12 в качестве более доступного источника углерода использует глюкозу, а О. intermedium – хризоидин и метиловый оранжевый [19].
Другой пример: кометаболизм флуорена культурами Rhodococcus rhodochrous и Pseudomonas fluorescens. Исследована зависимость интенсивности трансформации флуорена бактериями Rhodococcus rhodochrous 172 при росте на сахарозе и Pseudomonas fluorescens 26K при росте на глицерине от концентрации ростового субстрата и фазы роста культур [20].
Исследования численности и функционирования различных групп бактериобентоса водохранилища вблизи г. Череповца выявили явление кометаболизма. При наличии легкоусвояемых соединений органических веществ, бактериальные сообщества подвергают соокислению трудноминерализуемые соединения сточных вод, таких как полихлорированные бифенилы, полиароматические углеводороды, нефтепродукты, металлы, фенолы, соединения азота, серы и др. вещества [21].
При исследовании кометеболизма винилхлорида и этена у Pseudomonas aeruginosa strain DL1 было обнаружено, что при длительном культивировании (более 40 суток) неростовой субстрат винилхлорид становится ростовым [22].
Глава 2. Материалы и методы
Условия культивирования
Штамм LPM-4 стерильно пересевали на скошенные косяки ЭДТА-содержащего агара и выдерживали в термостате 5 суток. Для получения инокулята осуществляли смыв культуры с косяков, засевали в жидкую среду с ЭДТА и культивировали 3-4 суток. После чего инокулят в количестве 10 мл переносили в стерильные 750-мл колбы с 200 мл стерильной жидкой среды и культивировали в течение 10 суток на качалке при 150 - 200 об/мин при температуре 28º- 30ºС.
Опыт включал два этапа. Эксперимент первого этапа состоял из 8 вариантов (рис. 6), а эксперимент второго этапа – из 10 вариантов (рис. 7).
 | |||||||||||||||
 | |||||||||||||||
 |  |  |  |  |  | ||||||||||
 | |||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
Рис. 6. Схема эксперимента первого этапа опытов
|
| |||||||||||||||||||||
 |  |  | ||||||||||||||||||||
 | | |||||||||||||||||||||
 |  | |||||||||||||||||||||
 |  |  |  | |||||||||||||||||||
 | | | |||||
| |||||||
Рис. 7. Схема эксперимента второго этапа опытов
Методы анализа.
Пробы из колб отбирали один раз в сутки и проводили измерения рН, биомассы, концентрации глюкозы, ЭДТА и аммония.
Биомассу определяли спектрофотометрически на приборе Specol 221 (Germany) при 546 нм, после подкисления анализируемой пробы 5% раствором НNO3 до рН=2,0 для растворения солей, выпадающих в осадок в процессе культивирования. Содержание биомассы рассчитывали на основании оптической плотности клеточной суспензии используя раннее построенную калибровочную кривую.
Концентрацию ЭДТА определяли высокоэффективной жидкостной хроматографией на хроматографе HPLC (Waters. Great Britan), оснащенном колонкой Nukleosil 100 (Machery und Nagel, Germany) при 285 нм. В качестве элюента использовали раствор, содержащий Fe(NO3)3* 9H2O 0,5 г/л, бромид тетрабутиламмония 0,4 г/л, HNO3 (65%) 0,8 мл, рН 2,1. Концентрацию ЭДТА рассчитывали, используя калибровочную кривую
Концентрацию глюкозы определяли энзиматически с использованием реактива Глюкоза ФС “ДДС” (“Диакон”). Принцип метода: глюкозооксидаза катализирует окисление β-D-глюкозы кислородом воздуха с образованием эквимолярных количеств глюколактона и перекиси водорода. Пероксидаза катализирует окисление хромогенных субстратов перекисью водорода в присутствии фенола с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы в пробе и измеряется фотометрически при длине волны 500 нм. Состав реагента: буферно-ферментный раствор, который содержащит калий фосфорнокислый -250 ммоль/л, фенол - 5 ммоль/л, 4-аминоантипирин - 0,5 ммоль/л, глюкозооксидазу - 10 000 Е/л, пероксидазу - 1000 Е/л. Пробы центрифугировали при 8 000 об/мин в течение 6 минут. Затем отбирали 20 мкл надосадочной жидкости и добавляли 2 мл реагента. Пробы перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем измеряли оптическую плотность при 500 нм. Содержание глюкозы определяли по калибровочному графику.
Содержание ионов аммония определяли потенциометрическим методом с помощью ионселективного электрода “Эком-NH4”. Метод анализа заключается в измерении величины равновесного потенциала ионселективного электрода, погруженного в раствор анализируемого иона. Потенциал измеряют относительно электрода сравнения, с помощью иономера Экотест - 120 (ИЭЛРАН НПП ЭКОНИКС). Погружали в раствор электрод “Эком-NH4” и электрод сравнения и измеряли значение равновесного потенциала.
Таблица 3.2.1.1
Показатели
Время внесения добавок ЭДТА
Из полученных данных можно сделать следующее заключение. Во-первых, культура сохраняет способность ассимилировать ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду. Во-вторых, повторное добавление ЭДТА в среду приводит к увеличению биомассы, то есть запаса питательных компонентов среды достаточно для поддержания роста клеток. В-третьих, голоданием культуры по ЭДТА в течение одних суток привело к снижению активности фермента, ответственного за деградацию ЭДТА. И в четвертых, снижение показателей выхода клеток по массе и по энергии из ЭДТА в вариантах 2 и 3 очевидно связано с постепенным истощением питательной среды.
Показатели
Показатели
Добавки
Таблица 3.2.3.2.
Показатели роста штамма LPM-4 при добавлении ЭДТА или глюкозы к 13-суточной культуре, выращенной в присутствии глюкозы
|
Показатели | Добавки | ||
| Контроль (вариант 6) | ЭДТА (вариант 7) | Глюкоза (варианты 8) | |
| ЭДТА потребленный, г/л | - | 1,58 | - |
| Глюкоза потребленная, г/л | 1,69 | - | 1,64 |
| Биомасса максимальная, г/л | 0,721 | 0,845 | 0,839 |
| Биомасса в день добавки, г/л | 0,426 | 0,699 | 0,682 |
| Биомасса, образованная из внесенного субстрата, г/л | 0,295 | 0,146 | 0,157 |
| Выход клеток по массе из ЭДТА,UЭДТА% | - | 9,2 | - |
| Выход клеток по массе из глюкозы, UГлюкоза% | 17,5 | - | 9,6 |
| Выход клеток по энергии из ЭДТА, hЭДТА% | - | 13,1 | - |
| Выход клеток по энергии из глюкозы, hГлюкоза% | 21,9 | - | 12.0 |
Таблица 3.2.3.3.
Показатели роста штамма LPM-4 при добавлении ЭДТА или глюкозы к 21-суточной культуре, выращенной в присутствии глюкозы
|
Показатели | Добавки | ||
| Контроль (вариант 8) | ЭДТА (вариант 9) | Глюкоза (вариант 10) | |
| ЭДТА потребленный, г/л | - | 1,57 | - |
| Глюкоза потребленный, г/л | 1,64 | - | 0,87 |
| Биомасса максимальная, г/л | 0,839 | 0,880 | 0,851 |
| Биомасса в день добавки, г/л | 0,682 | 0,777 | 0,818 |
| Биомасса, образованная из внесенного субстрата, г/л | 0,157 | 0,103 | 0,033 |
| Выход клеток по массе из ЭДТА,UЭДТА% | - | 6,6 | - |
| Выход клеток по массе из глюкозы, UГлюкоза% | 9,6 | - | 3,8 |
| Выход клеток по энергии из ЭДТА, hЭДТА% | - | 9,4 | - |
| Выход клеток по энергии из глюкозы, hГлюкоза% | 12.0 | - | 4,8 |
Таким образом, полученные результаты показывают, что штамм LPM-4 сохраняет способность к деградации ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду, что приводит к увеличению биомассы. Также доказано, что ЭДТА-индуцированная способность штамма LPM-4 к ассимиляции неростового субстрата глюкозы является стабильной и сохраняется в течение длительного культивирования с подпиткой глюкозой. Снижение прироста биомассы с увеличением времени культивирования объясняется, по-видимому, истощением питательной среды. Показано, что неростовой субстрат, то есть глюкоза, в процессе длительного культивирования становится ростовым субстратом. Установлена способность бактерий к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования.
Заключение
В результате проведенных исследований установлено, что присутствие косубстрата (глюкозы) не оказывает влияния на деградацию ростового субстрата (ЭДТА) штаммом LPM-4.
При внесении глюкозы в среду до посева ее потребление началось после завершения деградации ЭДТА и сопровождалось увеличением плотности биомассы в два раза по сравнению с контролем. При внесении косубстрата в момент исчерпания ростового субстрата, индукция ассимиляции косубстрата требует длительной лаг фазы, вероятно, из-за недостатка энергии. Не обнаружено ассимиляции глюкозы при ее внесении в среду через 1-3 суток после потребления ЭДТА.
Величины выхода клеток по массе из ЭДТА и глюкозы (при внесении глюкозы до посева или на 1-3 сутки) мало различались и составили 22,4% и 19,9-21,4% соответственно. Однако, поскольку ЭДТА и глюкоза характеризуются различным энергосодержанием, более правильно сравнивать энергетический выход клеток из этих субстратов. Энергетический выход характеризует долю энергии субстрата, перешедшую в биомассу. Поскольку энергосодержание глюкозы выше, чем ЭДТА (значения gs составляют 1,6 и 1,4 соответственно), выход биомассы по энергии из ЭДТА был выше, чем из глюкозы и составлял 32%, тогда как выход клеток по энергии из глюкозы изменялся в пределах от 24,9 до 26,8 %.
Анализируя результаты второго этапа опытов, мы убедились, что культура сохраняет способность ассимилировать ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду. Повторное добавление ЭДТА в среду приводит к увеличению биомассы, то есть запаса питательных компонентов среды достаточно для поддержания роста клеток.
Показано, что штамм LPM-4 сохраняет ЭДТА-индуцированную способность ассимилировать глюкозу при многократном ее введении. Несколько сниженная ассимиляция глюкозы по сравнению с контролем и незначительный прирост биомассы при длительном культивировании бактерий (в течение 13-21 суток) объясняется тем, что в среде уже отсутствуют компоненты питательной среды, необходимые для роста культуры. Низкие показатели выхода клеток по массе и энергии при длительном культивировании говорят о том, что хоть глюкоза и потребляется, но синтеза биомассы не происходит.
Показано, что клетки штамма LPM-4 сохраняют способность к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования.
Результаты данного исследования важны для дальнейшей разработки нового биопрепарата по очистке сточных вод, который будет включать ЭДТА-разрушающий штамм LPM-4. Полученные данные помогут в выборе условий, оптимальных для деятельности штамма. Но нужно провести еще много работы, чтобы получить этот биопрепарат.
Выводы
1. Установлено, что кометаболизм ЭДТА и глюкозы у штамма LPM-4 не оказывает влияния на деградацию ЭДТА.
2. Показано, что ассимиляция глюкозы бактериальным штаммом
3. LPM-4 индуцируется только в процессе интенсивной деградации ЭДТА.
4. Обнаружено, что штамм LPM-4 сохраняет способность к деградации ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду.
5. Доказано, что бактерии сохраняют способность к ЭДТА-индуцированной ассимиляции глюкозы в процессе длительного культивирования с многократным добавлением глюкозы.
6. Установлено, что штамм LPM-4 способен к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования в присутствии глюкозы.
Литература
1. Биологическая очистка сточных вод. http://www.rfbr.ru
2. Босоло Ф. Химия координационных соединений.- М.: Мир, 1966.-145с.
3. Kari F.G. Modeling the photochemical degradation of ethylenediaminetetraacetate in the river Glatt/ F.G. Kari, W. Giger// Environ.Ski Technol.- 1995.-V.29.-P.2814-2827.
4. Bucheli-Witschel M., T. Egli Environmental fate and microbial degradation of aminopolycarboxylic acids // FEMS Microbiol. Rev. - 2001. - V.25. - P.69 – 106
5. Gschwind N. Biologischer Abbau von EDTA in einem Modelwasser // Wasser Abwasser. – 1992. – V.133. – P.546 – 549.
6. Chistyakova T.I., Dedyukhina E.G., Satroutdinov A.D., Kaparullina E.N.,
Gavrish E.Yu., Eroshin V.K. EDTA- dependent bacterial strain.//Process Biochem. 2005. V. 40. N 2. P. 601-605.
7. Бек М. Химия равновесий реакций комплексообразования. - М.: Мир, 1973. 145с.
8. Арчаков А.И. Оксигеназы биологических мембран. - М.: Наука, 1983. – 120 с.
9. Ляхович В.В. Структурные аспекты биохимии монооксигеназ. – Новосибирск.: Наука, 1978. – 47 с.
10. Witschel M., Nagel S., Egli T. Identification and characterization of the two-enzyme system catalyzing the oxidation of EDTA in the EDTA-degrading bacterial strain DSM-9103 // J.Bacteriol. – 1997. – V.179. – P.6937 – 6943.
11. Lauff J.J., Steele D.B., Coogan L.A., Breitfeller J.M. Degradation of the ferric chelate of EDTA by a pure culture of an Agrobacterium sp. // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V.56. P. 3346-3353.
12. Nötermann B. Total degradation of EDTA by mixed cultures and a bacterial isolate // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58. P. 671-676.
13. Chistyakova T.I., E.N. Kaparullina, E.Yu. Garvish, V.K. Eroshin. A novel-EDTA-degrading Pseudomonas sp. // World Journal of Microbiology and Biotechnology 2003 P.977-980
14. Foster J.W. Hidrocarbons as substrates for microorganisms.// Antonie van Leeuwenhock J. Microbiol. And Serol. 1962
15. Higgins I.J., Best D.J., Hammond R.C. New findings in methane-utilizing bacteria highlight their importance in the biosphere and their commercial potential// Nature (London). – 1980. - 286
16. Malashenco Yu.R. Syntabolism, the transformation of non-growth substrates up to biomass by obligate methane-oxidizing bacteria // 4th Int. symp. Microbial growth on C1- compounds (Minneapolis, Sept., 1983): Abstrs. – Minneapolis,1983. – Thes. 2-10
17. Малашенко Ю.Р., Соколов И.Г., Романовская В.А. Микробный метаболизм неростовых субстратов.- Киев. Изд-во “ Наукова думка” 1987
18. Современная микробиология. Прокариоты. Под редакцией Ленгелера Й., Древса Г.- М.: Мир 2005.
19. Ваккеров-Коузова Н.Д. Характеристика почвенных бактерий, трансформирующих азобензол.// Прикладная биохимия и микробиология. 2005, №2. М.: Наука.
20. Бабошин М. А. Кометаболизм флуорена культурами Rhodococcus rhodochrous и Pseudomonas fluorescens / Бабошин М. А., Финкельштейн З. И., Головлева Л. А. // Микробиология. - 2003. - Т. 72, N 2. - С. 194-198
21. Дзюбан А. Н., Косолапов Д. Б., Кузнецов И. А. Влияние промышленно-коммунальных стоков г. Череповца на функционирование бактериальных сообществ илов Рыбинского водохранилища // 11 Международный симпозиум по биоиндикаторам "Современные проблемы биоиндикации и биомониторинга" Сыктывкар , 17-21 сент.,2001 - С. 51-52 . Рус.; рез. англ.
22. Matthew F. Verce, Ricky L. Ulrich and David L. Freedman. Transition from Cometabolic to Growth-Linked Biodegradation of Vinil Chloride by a Pseudomonas sp. Isolated on Ethene.// Environ. Sci. Technol. 2001. V.35. P. 4242-4251.
23. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функционирования клетки. – М: Мир. 1974 –957с.
24.Шлегель Г. Общая микробиология. М: Мир 1987. c. 194-197
25. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. – М: Мир. 1978. 331с.
26. bioengineering@yandex.ru, copyright 2003
27. Характеристики культур с подпиткой рекомбинантной Escherichia coli, содержащих аналог человеческого коллагена кДНК при различных удельных скоростях роста. http://www.biogene.ru/articles2.html
28. Гибридные системы биодеструкции с использованием биологически агрессивного химического реагента / Кузнецов А. Е., Сафронов В. В. // Сб. науч. тр. - Рос. хим.-технол. ун-т. , 2001 . № 179 .- С. 227-241.].
29. Минкевич И.Г. Материально-энергетический баланс и кинетика роста микроорганизмов.- Москва-Ижевск: НИЦ “Регулярная и хаотическая динамика”; Институт компьютерных исследований, 2005.-352с.
30. Satroutdinov A., Dedyukhina E., Chistyakova T., Witschel M., Minkevich I., Eroshin V., Egli T. Degradation of Metal-EDTA Complexes by Resting Cells of the Bacterial Strain DSM 9103. Environ. Sci. Technol. 2000, 34, 1715-1720
Приложение 1.
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА (вариант 1)
| Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | ЭДТА, г/л | Аммоний, г/л |
| 0 | 7,35 | 0,025 | 0,873 | 0 |
| 1 | 8,13 | 0,026 | 0,734 | 7,0 |
| 2 | 8,52 | 0,072 | 0,526 | 8,0 |
| 3 | 9,21 | 0,183 | 0 | 9,9 |
| 4 | 9,64 | 0,179 | 0 | 13,6 |
| 5 | 9,77 | 0,196 | 0 | 30,0 |
| 6 | 9,64 | 0,182 | 0 | 33,8 |
| 7 | 9,59 | 0,160 | 0 | 36,2 |
| 8 | 9,76 | 0,157 | 0 | 36,6 |
| 9 | 9,55 | 0,149 | 0 | 27,0 |
| 10 | 9,53 | 0,128 | 0 | 30,5 |
Приложение 2
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы до посева бактерий (вариант 2)
| Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | ЭДТА, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, мг/л |
| 0 | 7,50 | 0,019 | 0,873 | 0,91 | 0 |
| 1 | 8,18 | 0,031 | 0,735 | 0,86 | 7,7 |
| 2 | 8,33 | 0,121 | 0,440 | 0,88 | 8,2 |
| 3 | 9,18 | 0,257 | 0 | 0,72 | 9,7 |
| 4 | 9,39 | 0,297 | 0 | 0,61 | 14,3 |
| 5 | 9,40 | 0,293 | 0 | 0,46 | 28,6 |
| 6 | 9,27 | 0,311 | 0 | 0,39 | 32,3 |
| 7 | 8,95 | 0,348 | 0 | 0,09 | 31,4 |
| 8 | 9,61 | 0,378 | 0 | 0 | 28,2 |
| 9 | 8,72 | 0,442 | 0 | 0 | 14,8 |
| 10 | 8,82 | 0,528 | 0 | 0 | 13,9 |
| 11 | 8,85 | 0,599 | 0 | 0 | 9,0 |
| 12 | 8,87 | 0,657 | 0 | 0 | 8,0 |
| 14 | 8,62 | 0,594 | 0 | 0 | 6,9 |
Приложение 3.
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы на первые сутки роста (вариант 3)
| Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | ЭДТА, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, мг/л |
| 1 | 8,20 | 0,022 | 0,743 | 0,98 | 7,8 |
| 2 | 8,33 | 0,082 | 0,452 | 0,98 | 8,7 |
| 3 | 9,16 | 0,232 | 0 | 0,80 | 10,4 |
| 4 | 9,36 | 0,268 | 0 | 0,71 | 19,2 |
| 5 | 9,23 | 0,274 | 0 | 0,60 | 27,2 |
| 6 | 9,25 | 0,306 | 0 | 0,50 | 34,3 |
| 7 | 8,90 | 0,360 | 0 | 0,22 | 31,0 |
| 8 | 9,52 | 0,391 | 0 | 0 | 26,4 |
| 9 | 9,49 | 0,371 | 0 | 0 | 14,6 |
| 10 | 9,55 | 0,361 | 0 | 0 | 14,9 |
Приложение 4
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы на 2 сутки роста (вариант 4)
| Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | ЭДТА, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, мг/л |
| 2 | 8,43 | 0,069 | 0,477 | 1,02 | 9,2 |
| 3 | 9,19 | 0,223 | 0 | 0,98 | 11,4 |
| 4 | 9,47 | 0,205 | 0 | 0,78 | 15,1 |
| 5 | 9,45 | 0,235 | 0 | 0,79 | 29,4 |
| 6 | 9,53 | 0,244 | 0 | 0,76 | 34,7 |
| 7 | 9,40 | 0,208 | 0 | 0,64 | 33,8 |
| 8 | 9,05 | 0,304 | 0 | 0,34 | 32,8 |
| 9 | 9,42 | 0,392 | 0 | 0,06 | 22,0 |
| 10 | 9,56 | 0,399 | 0 | 0 | 14,1 |
Приложение 5
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы на 3 сутки роста (вариант 5)
| Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, мг/л |
| 3 | 9,64 | 0,183 | 1,06 | 13,2 |
| 4 | 9,62 | 0,201 | 0,95 | 15,9 |
| 5 | 9,65 | 0,199 | 0,95 | 34,8 |
| 6 | 9,77 | 0,196 | 0,93 | 34,4 |
| 7 | 9,75 | 0,165 | 0,89 | 32,3 |
| 8 | 9,64 | 0,188 | 0,86 | 31,0 |
| 9 | 9,37 | 0,211 | 0,83 | 21,3 |
| 10 | 8,57 | 0,362 | 0,34 | 12,5 |
| 11 | 9,09 | 0,413 | 0 | 10,7 |
| 12 | 9,.48 | 0,423 | 0 | 9,5 |
| 14 | - | 0,389 | 0 | 6,4 |
Приложение 6
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы на 4 сутки роста (вариант 6)
| Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, мг/л |
| 4 | 9,60 | 0,179 | 0,98 | 18,1 |
| 5 | 9,67 | 0,197 | 0,98 | 30,9 |
| 6 | 9,81 | 0,199 | 0,96 | 37,5 |
| 7 | 9,75 | 0,142 | 0,99 | 34,2 |
| 8 | 9,75 | 0,168 | 0,98 | 36,2 |
| 9 | 9,65 | 0,146 | 0,94 | 27,9 |
| 10 | 9,62 | 0,145 | 0,92 | 26,9 |
Приложение 7
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы на 5 сутки роста (вариант 7)
| Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, г/л |
| 5 | 9,73 | 0,223 | 1,09 | 39,9 |
| 6 | 9,77 | 0,221 | 1,10 | 38,9 |
| 7 | 9,75 | 0,162 | 1,08 | 42,5 |
| 8 | 9,72 | 0,181 | 1,02 | 38,2 |
| 9 | 9,66 | 0,164 | 1,02 | 33,0 |
| 10 | 9,63 | 0,171 | 0,98 | 31,5 |
Приложение 8
Таблица. Рост культуры на среде с ЭДТА с добавлением глюкозы на 6 сутки посева (вариант 8)
| Время культивирования, сутки | рН | Биомасса, г/л | Глюкоза, г/л | Аммоний, мг/л |
| 6 | 9,64 | 0,227 | 0,78 | 47,1 |
| 7 | 9,75 | 0,179 | 0,77 | 44,2 |
| 8 | 9,72 | 0,193 | 0,72 | 41,6 |
| 9 | 9,67 | 0,166 | 0,75 | 36,8 |
| 10 | 9,73 | 0,149 | 0,71 | 35,6 |
Приложение 9
Таблица. Влияние добавок ЭДТА в среду на рост штамма LPM-4
Время
культиви-
рования,
сутки
Время внесения добавок ЭДТА
Контроль (до посева) (вариант 1)
4сутки
(вариант 2)
4, 6 сутки
(вариант 3)
Приложение 10.
Таблица
ЭДТА-индуцированная ассимиляция глюкозы у штамма LPM-4 при многократном добавлении глюкозы в среду.
Время
Культиви-
рования,
сутки
Время внесения добавок глюкозы
Контроль (до посева) (вариант 4)
9сутки
(вариант 6)
13 сутки
(вариант 8)
21 сутки
(вариант10)
Время
Культиви-
рования,
сутки
Время внесения добавок глюкозы
Контроль (до посева) (вариант 4)
9сутки
(вариант 6)
13 сутки
(вариант 8)
21 сутки
(вариант10)
Приложение 11
Таблица. Ассимиляция ЭДТА 9-суточной культуры штамма LPM-4, выращенной в присутствии глюкозы
Время
Культивирования,
сутки
Время внесения ЭДТА
Контроль (до посева) (вариант 4)
9 сутки (вариант 5)
ЭДТА, г/л
Глюкоза, г/л
Биомасса. г/л
ЭДТА, г/л
1,23
1,35
0,011
1,23
н/о
1,39
0,014
н/о
1,06
1,38
0,019
1,06
0,91
1,38
0,075
0,91
0
1,04
0,280
0
-
1,0
0,262
-
-
0,91
0,287
-
-
0,62
0,293
-
-
0,22
0,383
-
-
0
0,422
1,92
-
-
0,423
0,01
-
-
0,446
0
-
-
0,477
-
Время
культивирования,
сутки
Время внесения ЭДТА
Контроль (до посева) (вариант 4)
9 сутки (вариант 5)
ЭДТА, г/л
Глюкоза, г/л
Биомасса. г/л
Биомасса. г/л
13
-
-
0,477
0,713
14
-
-
0,507
0,679
15
-
-
0,474
0,700
16
-
-
-
0,733
17
-
-
-
0,748
18
-
-
-
0,759
19
-
-
-
0,716
20
-
-
-
0,666
21
-
-
-
0,725
22
-
-
-
0,739
23
0,748
24
0,747
Приложение 12
Таблица. Деградация ЭДТА 13-суточной культуры штамма LPM-4,выращенной в присутствии глюкозы.
Время
культивирования,
сутки
Время внесения ЭДТА
Контроль
(вариант 6)
13 сутки
(вариант 7)
Приложение 13
Таблица. Ассимиляция ЭДТА 21-суточной культуры штамма LPM-4,выращенной в присутствии глюкозы.
Время
культивирования,
сутки
Время внесения добавок ЭДТА
Контроль
(вариант 8)
21 сутки
(вариант 9)
Им. В. Г. Белинского
Факультет Кафедра
Естественно-географический биохимии
Дипломная работа
Дата: 2019-07-24, просмотров: 232.
