Метод основан на переводе углеводов типа глюкозы, фруктозы, арабинозы, ксилозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, раффинозы, а также полиолов — сорбита и инозита в пищевых продуктах в триметилсилильные производные с последующей их идентификацией на газовом хроматографе.

Аппаратура, реактивы и материалы: а) Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором и устройством для программирования температуры. б) Стеклянная насадочная колонка длиной 2...3 м и диаметром З...4 мм или капиллярная колонка длиной 25...30 м с нанесенной фазой. в) Микрошприц емкостью 1,0...10мкл. г) Роторный испаритель. д)Гексан, х.ч. е)Гексаметилдисилазан. ж) Трифторуксусная кислота или триметилхлорсилан. з) Пиридин, х.ч., безводный. и) Ксилит, х.ч. или инозит. й) Свинец уксуснокислый, х.ч. к) Неподвижные фазы для ГЖХ SE-30, OV-17, ХЕ-60, СКТФТ-50. л) Инертный носитель для ГЖХ: хромосорб-W DMCS, хроматон-N DMCS.

Ход работы.

1. Подготовка образцов к анализу углеводов. Для получения достоверных результатов анализа необходимо учитывать содержание жира и лимонной кислоты в испытуемом образце. Предварительно содержание этих компонентов в пищевых продуктах можно оценить по «Таблицам химического состава пищевых продуктов» и на основании этого выбрать один из следующих способов подготовки образца к анализу.

1.1. Продукты с низким содержанием жира (менее 1,5%).

1. 1.1. Продукты с низким содержанием лимонной кислоты (менее 1,5 %). Содержание лимонной кислоты устанавливается по «Таблицам химического состава». К ним относятся соки, вина, пиво, фруктово-ягодные кондитерские изделия, мед, сиропы и др. Навеску гомогенизированной пробы продукта с высоким содержанием сухих веществ (более 60 %) наносят на полиэтиленовую пластинку в количестве 50... 150 мг и взвешивают на аналитических весах с точностью 0,0001 г. На этой же пластинке взвешивают 5... 10 мг ксилита. Пластинку помещают в круглодонную колбу емкостью 10...25 см³ и силилируют без обезвоживания с использованием трифторуксусной кислоты. При использовании триметилхлорсилана содержимое колбы упаривают досуха на роторном испарителе при 60 "С под вакуумом. В случае медленного упаривания в колбу добавляют 1 см³ бензола. После упаривания проводят силилирование. Жидкие продукты отмеряют пипеткой в количестве 0,5... 1,0 см³ и помещают в круглодонную колбу емкостью 10...25 см³, снабженную шлифом. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеску 5... 10 мг ксилита, взвешенного с точностью 0,0001 г. Содержимое колбы упаривают досуха на роторном испарителе.

1.1.2. Продукты с содержанием лимонной кислоты более 1,5 %. Для исключения наложения пика ТМС-производного лимонной кислоты на ТМС-производное (3-глюкозы, лимонную кислоту осаждают уксуснокислым свинцом. Навеску средней гомогенизированной пробы продукта (свежие цитрусовые плоды, цитрусовые соки, продукты, содержащие лимонную кислоту как пищевую или консервирующую добавку) в количестве 1...1,5г взвешивают с точностью до 0,0001 г в конической колбе емкостью 100 см³, приливают 30 см³ 75...80 %-ного раствора этанола и экстрагируют 30 минут при температуре 60...70°С. Используют водяную баню и обратный холодильник. Экстракцию повторяют трижды, экстракты объединяют. Содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой. В центрифужную пробирку на 10 см³ вносят пипеткой 5 см³ отфильтрованного экстракта, 0,5 см³ насыщенного раствора уксуснокислого свинца. Осадок центрифугируют. 1 см³ надосадочной жидкости переносят в круглодонную колбу со шлифом емкостью 10...25 см³. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеску ксилита 5... 10 мг. Содержимое колбы упаривают на роторном испарителе при 60 "С под вакуумом.

1.2. Продукты с высоким содержанием жира (более 1,5%).

1.2.1. Продукты с содержанием лимонной кислоты менее 1,5 % (детское молочное питание, сухие молочные смеси и др.). Навеску средней гомогенизированной пробы продукта с высоким содержанием сухих веществ (более 60%) в количестве 500...1000 мг помещают в центрифужную пробирку. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят с точностью до 0,0001 г навеску ксилита 2...5 мг. Проводят экстракцию с 2 см³ гексана с последующим центрифугированием. Экстракцию проводят трижды, декантируя гексановый слой. Остатки гексана высушиваются в токе азота, после чего проводят силилирование.

Пробу сгущенного молока взвешивают в центрифужной пробирке и проводят обезжиривание, как описано выше, затем добавляют 20 см³ 50 %-ного водного раствора этанола, тщательно перемешивают, затем обрабатывают аналогично жидким молочным продуктам.

10 см³ жидких молочных продуктов помещают в центрифужную пробирку, смешивают с 10 см³ 96 %-ного этанола, выдерживают 30...40 минут и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 минут. 1 см³ надосадочной жидкости помещают в круглодонную колбу, туда же на полиэтиленовой пластинке вносят 2...5 мг ксилита, содержимое упаривают насухо на роторном испарителе при 60 °С, после чего проводят силилирование.

1.2.2. Продукты с содержанием лимонной кислоты более 1,5 % и хлебобулочные изделия. Навеску средней гомогенизированной пробы продукта в количестве 10...15 г, взвешенную с точностью до 0,0001 г, помещают в центрифужную пробирку и подвергают трижды экстракции 30 см³ гексана, объединяя гексановый слой декантированием. Осадок шпателем переносят в коническую колбу вместимостью 100 см³, тщательно смывая остатки со шпателя и пробирки 75 %-ным раствором этанола. Затем трижды экстрагируют содержимое колбы 75 %-ным раствором этанола, подогревая колбу на водяной бане при 60 °С. Отфильтрованные экстракты объединяют и доводят дистиллированной водой до метки в мерной колбе на 100 см³. В мерную пробирку на 10 см³ вносят 5 см³ экстракта и 0,5 см³ насыщенного раствора уксуснокислого свинца. После выпадения осадка надосадочную жидкость в количестве 1,0 см³ переносят в круглодонную колбу вместимостью 10...25 см³. Туда же вносят на полиэтиленовой пластинке 2...5 мг ксилита (с точностью до 0,0001 г) и содержимое колбы упаривают на роторном испарителе при 60 °С под вакуумом, после чего проводят силилирование.

2. Силилирование сахаров.

2.1. Способ с использованием трифторуксусной кислоты. В подготовленную навеску образца приливают 1,0 см³ пиридина (нуклеофильный катализатор), 0,9 см³ гексаметилдисилазана, 0,1 см³ трифторуксусной кислоты (облегчающий алкилирование), плотно закрывают и энергично встряхивают в течение 30 секунд. Вначале наблюдают расслоение жидкости на 2 фазы, при этом нижний слой незначителен. По мере стояния раствора в течение 20...30 минут это расслоение исчезает и начинает выделяться аммиак, что указывает на успешное протекание реакции силилирования:

После прекращения выделения аммиака раствор выдерживают 12 часов при комнатной температуре или 1 час при 60 "С. Длительно сохраняющееся расслоение, исчезающее только при нагревании, говорит о том, что реакция силилирования прошла не полностью из-за высокого содержания влаги (более 40%) или повышенного содержания углеводов. В этом случае подготовку пробы повторяют, уменьшив при этом навеску или увеличив время высушивания на роторном испарителе.

2.2. Способ с использованием триметилхлорсилана. В подготовленную навеску образца приливают точно 1,0 см³ пиридина, 0,2 см³ гексаметилдисилазана и 0,1 см³ триметилхлорсилана, встряхивают в течение 1 минуты и нагревают в термостате 45 минут при 60 °С:

Затем хроматографируют.

Для упрощения идентификации и количественных расчетов (если не требуется знания аномерного состава сахаров) определение сахаров производят в виде ТМС-производных сахаров. В подготовленную пробу образца добавляют 100 г гидроксиламина солянокислого, приливают 10 см³ пиридина и выдерживают в термостате при 80 °С в течение 2 часов:

Охлаждают и далее приливают силилирующие агенты.

3. Газохроматографический анализ.

3.1. Подготовка хроматографической колонки. Стеклянную колонку, заполненную готовым сорбентом (количество неподвижной фазы 3...5% от массы носителя) длиной 2 м и внутренним диаметром З мм устанавливают в термостате хроматографа и проводят термокондиционирование при продувании потоком газа-носителя (гелий, азот, водород) 2 ч при 100°С, 2 ч при 150°С, 4 ч при 200°С и 8 ч при 250"С. Затем устанавливают рабочий режим: температуру колонки профаммируют от 125 до 270°С со скоростью 4 °С в 1 мин, температуру испарителя 250 °С, расход газа-носителя 40см³/мин, температура пламенно-ионизационного детектора 250 °С, продолжают кондиционировать в течение рабочего дня.

3.2. Газохроматографическое определение. 1 мкл пиридинового раствора триметилсилильных производных углеводов вводят в испаритель и элюируют из колонки газом-носителем. Идентификацию индивидуальных триметилсилильных производных проводят по времени удерживания триметилсилильных производных сахаров-метчиков и методом добавок.

3.3. Приготовление стандартных растворов сахаров.

3.3.1. Сахара, имеющие аномеры . Навеску ксилита и навеску определяемого сахара, взятую с точностью 0,0001 г, помещают в коническую колбу и заливают дистиллированной водой до полного растворения углеводов. Раствор выдерживают в течение суток. Аликвотную часть раствора отбирают пипеткой, помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха, после чего проводят силилирование.

3.3.2. Сахара, не имеющие аномеров. Силилируются без предварительного растворения.

Массовую долю отдельных сахаров (в %) в навеске продукта определяют по формуле:

где С, — содержание отдельного сахара в навеске, %; К₁ — поправочный коэффициент данного сахара; С — масса навески стандарта, мг; m — масса навески образца; А_с — площадь пика стандарта в относительных единицах; Л_с— площадь пика данного сахара в относительных единицах.

 Ввиду того, что альфа-лактоза и сахароза выходят на хроматограмме одним пиком, площадь пика альфа-лактозы определяют, исходя из соотношения площадей альфа- и бета-лактозы в модельном соединении лактозы. За основу берется площадь пика бета-лактозы. Площадь пика сахарозы определяют вычитанием от суммарного пика сахарозы пика альфа-лактозы, из пика бета-лактозы. За окончательный результат принимают среднеарифметическое результатов двух параллельных определений и округляют до трехзначной цифры.