Пуринов транспорт в клетку-хозяина паразитами

Поможем в ✍️ написании учебной работы

Имя

Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой

Нажимая кнопку "Продолжить", я принимаю политику конфиденциальности

ВВЕДЕНИЕ

Нуклеотиды и аминокислоты имеют основополагающее значение для репликации и развития токсоплазма и других apicomplexan пары-сайтов. Нуклеотиды являются, в частности, существенное значение для обеспечения Repli-катиона ДНК и транскрипции РНК в быстро делящихся стадиях. Синтез ДНК полагается на достаточный запас пиримидина (дЦТФ, дТТФ) и пурина (дАТФ, дГТФ) дезоксинуклеотид 5'-triphosphates, в то время как синтез РНК использует рибонуклеотиды АТФ, CTP и GTP, а также уридин 5'трифосфата (УТФ). Нуклеотиды также играют важную роль в обеспечении клеточных источников энергии (АТФ и ГТФ) и участвуют в многочисленных других метаболических функций.

Нуклеотиды обеспечивают предшественников более сложных молекул, таких как фолат, служат в качестве нуклеотидных на основе фермента кофакторов, таких как НАД+или FAD, служат в регуляторных функций в качестве внутриклеточных мессенджеров, таких как цАМФ, а также играют роль в контроле метаболизма и регуляции генов. Нуклеотиды являются либо СЕНТОМ размера из небольших молекул и аминокислот, или они приобретены с помощью спасательных путей из предварительно сформированных принимающих полученных нуклеотидных и Núcleo-сторон. В apicomplexan паразитов, рассмотренные в этой главе, токсоплазм, малярийный плазмодий и Cryptosporidium parvum, являются важными патогенами человека, которые вызывают signif-мешающая заболеваемость и смертность. Следует отметить, что в настоящее время стратегии лечения в человеческих инфекций, вызванных

Токсоплазма. Модельные Apicomplexan-перспективы и методы, под редакцией Weiss & Kim

ISBN-13: 978-0-12-369542-0

ISBN-10: 0-12-369542-2

Все права воспроизведения в любой форме зарезервированы.

466 СРАВНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ нуклеотидных и аминокислотного метаболизма в токсоплазма

Т. гондий или P. малярийного основаны на блокировании накопление нуклеотидов. Это подтверждено подход к химиотерапии подчеркивает сущест-Cance дальнейших исследований рассекать детали нуклеотида метаболизма в Apicomplexa, а также потенциал для этого исследования, чтобы привести к разработке новых методов лечения.

Apicomplexa являются облигатными внутриклеточными низших эукариотических организмов одноклеточные, которые только Капа-BLE репликации, когда они правильно ассоциировать с их паразитами клетки-хозяина. Они могут существовать в жизнеспособной форме внеклеточны в течение коротких периодов времени, но не в состоянии даже одного клеточного деления. Сравнительный подход рассматривает три выбранные apicomplexan патогенных микроорганизмов, которые сильно отличаются в их взаимодействии с человеческим хозяином был под принято, чтобы приступить к рассмотрению возможных отношений между клеткой-хозяином и окружающей средой, занятой каждым паразитом, и стратегией, что каждый паразитом принявшеем чтобы обеспечить доставку питания suffi-фективных нуклеотидов и аминокислот для поддержки быстрого репликации паразита. Недавнее завершение геномных последовательностей для Т. гондий (http://toxodb.org), П. малярийного (HTTP: //. Plasmodb орг), и C.

Исследование нуклеотидных и аминокислотных Metab-olism в Apicomplexa чрезвычайно следующ-лаборантом в обязательном присутствии клетки-хозяина. Человеческие клетки-хозяева намного больше, чем их apicomplexan жителей, сами по себе богаты нуклеотидов и аминокислот, а также обладают обширные метаболические способности к транспорту, СЕНТ-размер, взаимопревращаться и катаболизируют нуклеотидов и аминокислот. Нуклеотидная и аминокислотная Metabo-ЛМЗС из облигатных внутриклеточных паразитов еще во многом остаются загадкой из-за сложное взаимодействие паразита и его клетку-хозяина. В то время как исследования изучали внеклеточную форму паразита в отношении транспорта, синтез,

и взаимопревращение нуклеотидов, выделение свободных паразитов без загрязнения материала-хозяин является неопределенным. Следовательно, генетические исследования были особенно информативными подход к экзамену-НСИ фенотип сконструированных паразитов, не имеющих или получающих ген участвует в нуклеотида или аминокислотного обмена, или, альтернативно, при рассмотрении взаимодействия нормальных или мутантных паразитов в мутантной клетки-хозяина , Большинство генетических исследований было проведено в Т. гондиях из-за более быстрые и надежные генетические модели, доступные для работы этого паразита (Kim и Weiss, 2004). Несколько важных модели генетической селекции Devel-Oped для T.gondii, также основаны на паразит нуклеотид и аминокислотный метаболизм. Генетические модели, основанные на нуклеотидном метаболизме доступны в P. малярийного, но эти модели еще не разработаны для культуры C.parvum.

Пуринов

Пуринов имеют решающее значение для всех ячеек в соответствии с требованиями компо-ненты нуклеиновых кислот, источником клеточной энергии и кофакторов или субстратов для конкретных аспектов клеточного метаболизма. Все аспекты apicomplexan образа жизни, в том числе моторики зависящей от вторжения в клетки хозяина, питаются от нуклеотида (Кимат и Танабэ, 1982). Примечательно, что паразитические простейшие, за исключением Acanthamoeba (Hassan и Кумбс, 1986), не обладают способностью синтезировать пуринового кольца De Novo (Марр и др, 1978;. Беренс и др, 1981;. Ван и Симашкевич, 1981; Fish и др, 1982;. Миллер и Linstead, 1983; Ван и Aldritt, 1983; Wang, 1984,). Поскольку Т. гондий и другие APICOM-plexan паразиты не хватает техники для синтеза пуринового кольца De Novo, они полагаются на базисную захвата, транспортировки, и спасательное оборудование, чтобы украсть пуринов из их хозяев для включения в паразит нуклеотидных бассейны (Перотто и Keister, 1971; Шварцман и Pfefferkorn, 1982, Krug и др., 1989, Чаудхари и др., 2004;. Ting и соавт, 2005) , Интеграция этих путей в Apicomplexa, скорее всего, с учетом конкретных потребностей каждого паразита, а также различные пуриновые ресурсы, потенциально доступные в различных клетках-хозяевах, ткани и среды обитаемых каждого паразита.

пуринов

467

Хотя не в состоянии репликации внеклеточно даже в самой богатой среде, ранние исследования в Т. гондии показали, что паразит может получить пурины и удовлетворить все другие требования для нормального внутриклеточного репликации даже в клетках-хозяевах, которые заблокированы в синтезе белка (Пфефферкорн и Пфефферкорн, 1981) , а в энуклеированными клетки-хозяева, которые заблокированы в хост-РНК и синтез ДНК (Jones, 1973;. Sethi и др, 1973), а также в клетках-хозяевах, которые действуют glycolytically за счет Defi-Cient функции митохондрий (Шварцмэн и Пфефферкорн, 1981).

Сбора, транспорт и пути спасанию, необходимые для приобретения пуринов уже давно рассматриваются как существенный недостаток паразита, которые могут быть направлены на химиотерапию, и значительные усилия были направлены на достижении этой цели (Avila и Avila, 1981; Беренс и др. , 1984;. Рыба и др, 1985; Avila и др, 1987;. Марр и Беренс, 1988; Геро и др, 1989, 2003;. Pfefferkorn и др, 2001).. Современные модели предполагают, что паразит пуриновых транспортеров на мембране паразита плазмы являются обязательным механ-ханизм приобретения пуринов от хозяина (Carter и др, 2003;.. Де Конинг и др, 2005). Для APICOM-plexan паразитов, таких как T. гондии или P. фальципарум, эта модель предполагает, что хост-клетки, полученные пурины или пассивно или активно накапливают в паре-sitophorous вакуоли пространства. Поэтому пурины, полученные от хоста внутриклеточного паразита могут быть получены из некоторой комбинации POTEN-TiAl ресурсов, в том числе де ново синтеза пуринов в паразитах клетки-хозяина, существующие бассейны пуриновых в клетке-хозяине, хост-клетка пурин катаболизм, или пуриновый транспортный поток в паразитах клетки-хозяина. В нескольких исследованиях экспериментально рассмотрены, есть ли какое-либо требование к хост-клетка пуринового Tran-носильщики. Значительный прогресс был достигнут в понимании пуриновых транспортную способности к apicomplexan паразитов, а также паразитные ферментов, которые способствуют взаимопревращениям, ликвидационные и включению принимающих пуринов в нуклеотидных бассейны паразита пуринов. Меню множества пуриновых соединений, захват пуринового и транспортная Capa-ности паразита,

Захват и транспорт

Детали пуриновых транспортной емкости и пуриновых транспортеры были недавно выяснены из нескольких простейших, причем большинство работ сообщаются о транспортерах функциях в Leishmania зре. и Trypanosoma зр. (Landfear и др., 2004;. Де Конинг и др, 2005). Нуклеозидные и нуклеотидные транспортеры делятся на две основные группы; концентрирующие нуклеозидные транспортеры натрия-зависимый (CNT) и не-концентрирующий equilibrative нуклеозидные транспортеры (ENT). Млекопитающие и бактерии обладают CNT и ЛОР-переносчиков, а простейшими только ЛОР-типа транспортеров (Landfear и др., 2004; Чаудхари, 2005;. Де Конинг и др, 2005). Другие гены нуклеотидных переносчиков у бактерий, грибов и растений классифицируются как связанные с пуриновым переносчиком растений семейства или микробные пуриновые связанный транспортер семьей, или нуклеотидных / аскорбат Транспортер семьи (де Конинг и Diallinas, 2000). Гены, отвечающие этим трех групп пуриновых транспортеров не были идентифицированы среди простейших.

18.2.1.1 Геном Анализ пуриновых транспортеров в Apicomplexa

Полные последовательности генома токсоплазма, малярийный плазмодий и Крипто-parvum были мелкого спор идентифицированы предполагаемые гены ЛОРА-типа переносчика, предполагаемые каналы и другие транспортеры, которые могут играть роль в пуриновом транспорте. Геном культуры C.parvum показал замечательные транспортные мощности и предполагаемые пуриновые транспортеры, которые ждут функциональной CHARAC-terization (Абрахамсно и др., 2004; Xu и др., 2004). П. фальципарум геном кодирует ранее характеризующееся пуриновое переносчик, PfNT1, а также три дополнительных предполагаемый ЛОР ортологов (Баль и соавт, 2002, 2003;. Chaudhary, 2005;. Кирк и соавт, 2005;. Мартин и др, 2005) , Аналогичным образом, геном Т. гондий показывает TgAT1 и три дополнительных ЛОР ортологи, обозначенный как TgNT1, TgNT2 и TgNT3 (Kissinger и др, 2003;.. Ли и др, 2003; Chaudhary, 2005).

Недавние исследования показали, что TgAT1, TgNT1 и TgNT3 выражаются в тахизоитами,

468 СРАВНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ нуклеотидных и аминокислотного метаболизма в токсоплазма

bradyzoites и спорулированных ооцист, в то время как TgNT2 не является (Чаудхари, 2005). TgAT1 и TgNT3 белки локализованы в плазматической мембрану внутриклеточных тахизоитов, в то время как TgNT1 был локализован в качестве точечных маркировок паразита цитозола внутри отсека, что не ко-локализуются с любым другим маркером известной Т. гондиями органеллы (Chaudhary , 2005). Кроме Т. Gondii TgAT1 и П. трехдневный PfNT1, функциональная роль каждого из этих недавно идентифицированного лора ортологов в настоящее время неизвестно.

18.2.1.2 Ранней модель приобретения пуринов в Т. гондий

была предложена первая рабочая модель приобретения пуринового Т. гондий, чтобы быть от хозяина АТФ, самый распространенный хост пуринового присутствующих на более чем 4 мМ в цитозоле клетки-хозяина (Plagemann, 1986;. Plagemann и др, 1988; Траут, 1994) , Hypothe-СИС, что Т. гондий использовал клеточный АТФ-хозяина в качестве источника пуринового был основан на данные из двойного этикетки Experi-ки, показывающих, что внеклеточный Т. гондий легко включен нуклеозид компонента АТФ или АМФА в нуклеиновые кислоты, но не включает фосфатный остаток (Шварцмэн и Пфефферкорн, 1982). В это время также appreci-ованный, что паразитофорная вакуоль, окружающая внутриклеточные тахизоят была покрыта слоем хоста-клетки митохондрий, органеллы, богатой АТФ (Jones и др., 1972).

Открытие удивительно обильные Nucle-oside трифосфат гидролазы (NTPase) активности секретируемых в паразитофорной вакуолей пространства предположил, что хост АТФ может быть гидролизован до АМФ внутри вакуоли пространства (Бермудес и др, 1994;. Сибли и соавт, 1994;. Асаи и др., 1995). Следовательно, было выдвинуто предположение, что Т. гондий может получить свое требование пуринового из потока, созданного с помощью проникновения АТФ в вакуоли пространстве, превращение АТФ в АМФ по вакуолярной NTPase

активность, и преобразование AMP в аденозин с помощью предполагаемого паразита плазматической мембраны 5'-ectonu-cleotidase. Поскольку пул хост-клеток аденозина очень мала, при ~ 1μМ (Plagemann, 1986;. Plagemann и др, 1988; Траут, 1994), использование хост-пулов АТФ была привлекательной моделью, чтобы объяснить, как хост аденозин может быть сосредоточена в пара-sitophorous вакуолей пространства. Первый аденозина переносчик охарактеризован Т. гондий, TgAT1, был описан как не-концентрирующей низкой аффинность (К_м ~ 120 μМ) транспортная система аденозин, что, вероятно, потребует более высокую концентрацию аденозина, чем 1 μМ присутствует в хост-цитозоль клетки для Phys-iological значение (Schwab и др., 1995). Последующие работы показали, что intracel-lular тахизоиты, а также паразитофорную вакуоль пространство и мембрану, не имеют никакого обнаруживаемых-'-ectonucleotidase активность (Нго и др., 2000). Таким образом, Т. гондий не имеет существенного доступа к внутриклеточным пулов клеток хозяина нуклеотидов.

18.2.1.3 Функциональные свойства пуриновых транспортеров в Apicomplexa

Функциональные исследования пуриновых транспортеров в культурах C.parvum еще не доступны. В отличие от этого, несколько пуриновых транспортеров были функционально отличающийся тем, Т. гондий. TgAT1 является низким сродством переносчика аденозина, гуанозина, инозина и (Schwab и соавт., 1995; Чанг и др., 1999). Низкоаффинный перенос аденозина с помощью TgAT1 блокируется дипиридамолом и ингибируется избыток инозина, formycin B, или гипоксантина, но не пиримидины, что указует на роль в транспорте, которое пурин-селективный и широкий спектр.

Последующий отбор и характеристика аденинарабинозида (Ara-A) мутанты, устойчивые идентифицированы мутации в генетическом локусе корреспондентского-диньте к гену, обозначенный как TgAT, и характер-роскопию в качестве предполагаемого 11-трансмембранной области белка семейства ЛОРА (Чанг и др., 1999). Выражение TgAT в Xenopus ооцитах Laevis реконструированных низкой аффинности аденозина транспортную функцию, аналогичную ранее характеризующейся TgAT1, предполагая, что TgAT, вероятно, представляют собой клонированный ген TgAT1 (Schwab и соавт., 1995; Чанг и др., 1999). Нарушение TgAT одного гена вызвало

пуринов

469

полная потеря всех аденозин транспортной функции во внеклеточных тахизоитах (Чанг и др., 1999).

Дополнительно с высоким сродством нуклеозид и Nucle-obase транспортеры были идентифицированы во внеклеточных тахизоитах T.gondii, (де Конинг и др., 2003). Данное исследование характеризуется более низкой аффинности (K аденозин_м ~ 105 ìМ) и инозин (К_м ~ 134 ìМ) транс-портер эквивалентен ранее характеризующейся TgAT1 (TgAT). Кинетическая доказательства показала Pres-ствование высокого сродства аденозина (K_м ~ 0,49 ìМ) и инозин (К_м ~ 0,77 ìМ), что транспортная система была также высоким сродством и широкого спектра транс-порте, способный транспортировать большое количество различных пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов. Эта вторая аденозина транспортная система была обозначена как TgAT2 (де Конинг и др., 2003). Высокое сродство и широкая специфичность TgAT2 предположили, что это может быть эффективным путем для поглощения различных Thera-peutic нуклеозидов (де Конинг и др., 2003). Же работа также показала третью транспортную систему, TgNT1, который является первым пурином переносчик, что было продемонстрировано, чтобы избирательно транспортировать пуриновые нуклеотидные основания. На основе конкуренции KINET-мике, TgNT1 имеет высокое сродство к гипоксантину (K_м ~ 0,91 ìМ), а также гуанин и ксантин.

Наличие TgAT2 и TgNT1 на тахи- zoite плазматической мембраны внеклеточного тахи- zoites предполагает необыкновенную способность T.gondii, чтобы спасти чрезвычайно низкие концентрации пуриновых нуклеотидов и нуклеозидов внутри вакуоли паразитофорного пространства в intracel-lular среды. Эта экстраординарная способность роются пуринов может частично объяснить замечание, в состоянии способности Т. гондий реплицироваться в практически любой тип клеток млекопитающих. Тем не менее, в то время как гондии пара-sitophorous вакуоли мембрана Т. предлагаются представлять собой молекулярные сита, что позволяет пассивное проникновение нейтральных или заряженных молекул до 1300-1900 дальтона между цитоплазмой хоста-клетками и парой-sitophorous вакуолей пространством (Столяре и др ., 1994, 1996;. Шваб и др 1994), экспериментальные исследования-тически Удельной адресации проницаемости или концентрации нуклеотидных,

П. фальципарум выражает 11 трансмембранного лор семьи нуклеозида транспортера

обозначенный PfNT1 (или PfENT1), который локализован на мембране паразита плазмы (Картер и др., 2000;. Паркер и др., 2000; яростень и др, 2001). PfNT1 выражается на всех этапах жизни и заметно повышался у молодых трофозоитов, что соответствует увеличению потребности в пурины в репликации. Выражение PfNT1 в Xenopus ооцитов Laevis наделяет высокую аффинность аденозин транспорта (K_м ~ 13 ìМ) и низкое сродство инозина транспорт (К_м ~ 253 ìМ). Ингибирование исследование показало PfNT1 широкий спектр для ряда пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов и, в отличии от млекопитающего-хозяина, может транс-порт и D- и L-нуклеозиды.

Пуринов взаимопревращения

HOST цитозоль клетки

гипоксантин

ксантин

аденин

гуанин

ADE гуанозин

аденин

гипоксантин

ксантин гуанин

ФРПФ

ПНП ADSS ADSL HXGPRT

HXGPRT

гуанозин

L-аспартат

AMP

IMP

XMP

GMP

AMPD IMPDH GMPS Аляска ФРПФ

HXGPRT

Т. гондий тахизоит цитозол

аденозин инозин

гипоксантин

АДА

ПНП

Т. гондий тахизоит плазматической мембраны

аденозин инозин

Паразитофорная вакуоль ПРОСТРАНСТВО

Паразитофорная вакуоль МЕМБРАНА

HOST цитозоль клетки

Паразитофорная вакуоль МЕМБРАНА

C.PARVUM PLASMA МЕМБРАНЫ

AMP IMP XMP GMP

AMPD IMPDH GMPS

Аляска

аденозин C.PARVUM цитозол

аденозин

Паразитофорная вакуоль ПРОСТРАНСТВО

РИСУНОК 18,1 Модель пуриновых транспорта и спасательных путей в (А) Т. гондий; (В) культуры C.parvum;

474 СРАВНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ нуклеотидных и аминокислотного метаболизма в токсоплазма

HOST цитозоль клетки

паразитофорной вакуоль МЕМБРАНЫ

П. Falciparum PLASMA МЕМБРАНЫ

ксантин

гуанин

гуанозин

П. Falciparumцитозоль

ПНП

_HXGPRT ксантин гуанин гуанозин

ADSL	ADSS	ФРПФ
		ФРПФ
	L-аспартат

HXGPRT _ФРПФ

AMP

AMPD

IMP

XMP

GMP

IMPDH

GMPS

HXGPRT

ФРПФ аденозин инозин гипоксантин MTI MTA PS

АДА

ПНП

АДА

SS S аденозин ? ? инозин

гипоксантин

MTI

MTA

Паразитофорная вакуоль ПРОСТРАНСТВО

Рисунок 18.1 прод (С) П. фальципарум.

Клетка-хозяин цитозоль показан вне паразитофорной мембраны вакуолей. Паразитофорное вакуоль пространство и паразит плазматическая мембрана указаны. Пурин транспортеры показаны в виде цилиндров, опирающихся в мембране паразита плазмы. Пуриновые соединения, доступные для каждого паразита показаны внутри вакуоли паразитофорного пространства. Внутри паразита цитозоля ферментативного механизма управляющей пуринов взаимопревращения и сэлвидж принимающих пуриновых нуклеотидных и нуклеозидов в аденилат (AMP) и гуанилатциклазы (GMP) нуклеотидных пулов показано. Сплошные линии и стрелки показывают активные пути. Где информа-ция по потоку пуринов доступно взвешивание пути подчеркивается веса линий и стрелок. Взвешивание путей описаны в рисунке 18.1 отражает наиболее вероятные предсказания с толком-состоянием данных; тем не мение, Веса, показанные на этих диаграммах являются лишь гипотетическими и пуриновых поток принимающей пуринов в паразита, а также взаимопревращения и включения в пределах внутриклеточного паразита, остается быть проверена экспериментально. Субстраты каждой активности фермента показаны на стороне сплошной линии, и продукт (ы) каждую активность фермента показаны на стороне стрелки. Активность фермента, ответственная за каждый шаг преобразующего показана в капитальном курсиве рядом с линией стрелки. Аденозин-киназа (АК) и гипоксантин-ксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HXGPRT) предста направил основные пути для спасения и включения в состав нуклеотида пула, и эти ключевые виды деятельности, если они присутствуют, показано на рисунке. ААР, аденозиндезаминазы; АДЭ, аденин деаминазы; ПНП, пуриновых нуклеозидов фос-phorylase; ADSS, adenylosuccinate синтетазы; ADSL, adenylosucccinate лиазы; AMPD, АМФ деаминазы; IMPDH, инозин 5'монофосфат-дегидрогеназы; GMPS, GMP-синтетазы; СС, спермидин синтетазы; MTA, 5'-methylthioadenosine; MTI, 5'-methylthioinosine; ФРПФ, 5-фосфорибозил-1-пирофосфат. Закрытые треугольники: PS, синтез полиаминов; S, спермидин.

пуринов

475

еще раз, что паразит с нарушенной функцией АК по-прежнему размножается, как правило, скорее всего, по спасанию через HXGPRT (Sullivan и др., 1999).

Т. гондий АК была выражена в E.coli для биохимических, кинетических и структурных исследований, в которых выявлены существенные различия между паразитами АК и АК млекопитающих, которые могут быть использованы для разработки лекарственных средств (Darling и соавт, 1999;.. Шумахер и др 2000a, 2000b). Подрывной субстраты Т. гондий АК было показано, чтобы быть селективно токсичен для паразита (Pfefferkorn и Pfefferkorn, 1976; Iltzsch и др., 1995; эль Kouni и др., 1999). Интересно, что ген АК из культуры C.parvum дополняет АК-дефицитную Т. гондий. Такое дополнение система может представлять собой полезную модель с высокой пропускной способностью, по которому для скрининга потенциальных ингибиторов культуры C.parvum АК (Striepen и др., 2004).

HXGPRT представляет собой второй основной путь включения хозяевах пуринов. Однако, как АК, нарушение Т. гондий HXGPRT не оказывает существенного влияния на репликации или жизнеспособности тахизоитов (Pfefferkorn и Borotz, 1994;. Дональда и др, 1996). Уникальная ксантин фосфорибозилтрансфераза активность HXGPRT, которая отсутствует в организме человека, может быть использована для разработки лекарственных средств с использованием токсичных аналогов ксантина. Этот подход был Вели-датировано в исследованиях с использованием 6-thioxanthine, соединением с селективной токсичностью по отношению к T. гондиям (Pfefferkorn и Borotz, 1994; Пфефферкорн и др., 2001). Кристаллическая структура и ферментативные механизмы Т. гондий HXGPRT были определены, и паразит HXGPRT является потенциальной мишенью препарата (Шумахер и др, 1996;.. Heroux и др, 1999a, 1999b).

Паразиты, полностью лишенный АК HXGPRT или являются жизнеспособными, предполагая, что либо путь может быть достаточным для введения пуринового и паразит Repli-катиона (Donald и соавт, 1996;. Салливан и др., 1999). В нокауте паразит Т. гондий HXGPRT, хост аденозин требовался бы для паразита реплик-ции, и будет включен в аденилат нуклеотидов от АК, а затем в гуанилатциклазах нуклеотидов по АК, AMP Аденозиндеминазным, IMPDH и ГМРУ (рис 18.1A). И наоборот, в нокауте-мутанте Т. гондий АК, принимающий гуанин, гуанозин и ксантин обеспечит гуанилатциклазы нуклеотидов, но никакие аденилатный нуклеотиды не могут быть сформированы

из этих пуринов. В этом мутантном принимающем аденине, аденозин, инозин, или гипоксантин может POTEN-ственно удовлетворить спрос паразита для обоих adeny-поздний и гуанилатциклазов нуклеотидов (рис 18.1A). Все потенциальных предшественники хозяина пуриновыха бы воронка через гипоксантин в IMP пул, который может пойти в гуанилатциклазы нуклеотидов через IMPDH и ГИП и аденилатный нуклеотиды через ADSS и ADSL.

Поэтому, в отличие от P. малярийного и культуры C.parvum (обсуждается ниже), Т. гондий обладает функционально избыточной пурином реутилизацией (АК и HXGPRT) с емкостью для удовлетворения требования пурина, используя ассортимент потенциальных нуклеотидного хоста-клетку пуриновой и нуклеозиды. Эта особенность Т. гондий может помочь объяснить, как паразит способен реплицироваться в таком широком Vari-щества клеток-хозяев и тканей, которые могут представлять весьма разнообразные потенциальные ресурсы пурина. Комплекс пурина реутилизация Т. гондий также предполагает, что этот путь может быть подвергнуто сложными регуляторными механизмы (рис 18.1A). Например, паразиты, которые рост ингибируется путем обработкой 6-thioxanthine включают в четыре раз больше гипоксантина и ксантина в нуклеиновые кислоты, чем делать необработанные контрольные паразиты.

Недавние генетические исследования были проведены на Т. Gondii АК и HXGPRT, которые помогают прояснить previ-ОЕ наблюдения. деятельность HXGPRT и АК не могут быть одновременно нарушены в Т. гондий, предполагая, что они являются единственными функциональные маршруты к пуриновых нуклеотидов в паразита (Chaudhary и др., 2004). Следовательно, feasi-BLE выбить АК и HXGPRT деятельность паразита до тех пор, по меньшей мере, один функциональный путь, способ пуриновых нуклеотидов представлена в транс. Низкая активность Aprt активности обнаружена в линиях, дополненных функциональный геном Aprt из Leishmania donovani, но одновременное удаление генов АК и HXGPRT до сих пор не possi-BLE (Chaudhary и др., 2004).

Это генетическое исследование также показало, что одиночный нокаут гена паразита АК или HXGPRT есть

476 СРАВНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ нуклеотидных и аминокислотного метаболизма в токсоплазма

небольшие, но обнаруживаемые дефекты в пригодности, так как отпугнуть-добытую скорости роста тахизоитов. АК-дефицитные паразиты обладают фитнесом дефекта в скорости роста на 7,6 процента поколения, в то время как HXGPRT-дефицитные паразиты проявляют фитнес дефекта в скорости роста 3,7 процента поколения (Chaudhary и др., 2004). Это важное открытие предполагает, что приобретение пуринового может быть лимитирующей скорость роста паразита. В случае нокаут пара-сайта АК тот же источник хозяина аденозина будет доступен как в диком типе родителе, таким образом, поток аденозина, когда отвлекается из-за отсутствием активности АК, в инозин в гипоксантин в МВП, затем guany-поздно и аденилатный нуклеотиды, не является достаточным, чтобы полностью поддерживать нормальную скорость роста паразита.

Таким образом, паразит транспорт и включение хозяина аденина, аденозина, инозин, гипоксантин, гуанозина, гуанин, ксантин и через паразита HXGPRT недостаточно, чтобы полностью поддерживать нормальную репликацию паразита (рис 18.1A). Аналогичным образом, в HXGPRT нокаут, транспорт и включении принимающего аденозина через высокую активность АК путь-дорогу недостаточно для полной поддержки паразита реплики-ции, что указует на поставку хозяина аденозина само по себе не вполне достаточно, чтобы в полной мере поддерживать макси-маму паразит скорость репликации. В совокупности эти наблюдения указуют на несколько хост пуриновых Nucle-obases и / или нуклеозиды, и оба пути инкорпорации принимающих пуринов в нуклеотидных пулы T.gondii, вероятно, будет необходимо для поддержки максимальной скорости репликации.

Множественные изоформы и локализация HXGPRT Новым признаком Т. гондий пурин реутилизации является выражением двух форм HXGPRT из одного локуса генов путем альтернативного сплайсинга мРНК (Donald и соавт, 1996;. Уайт и др., 2000). Две изоформы отличаются друг от сегмента 49 амино-кислоты, содержащей дополнительный экзон в изоформы II. Обе изоформы ведут себя кинетический аналогичным образом, хотя изоформы II, немного менее эффективно

признание гуанина в качестве субстрата (Уайт и др., 2000). Клеточная компартментализация два HXGPRT изоформа отличается. Изоформы я это цитозольный, в то время как более длинная версия изоформы II, является локальной-роскопией к внутренней мембране комплексу (IMC) из тахизоишь (Чаудхарьте и др., 2005). 49 аминокислот вставки на N-конце изоформы II необходим для локализации в IMC. -Механич низм ИМК локализации был идентифицирован, чтобы быть Palmi-toylation, которые произошли в трех соседних остатков цистеина в течение 49-амино-кислоты вставкой. Мутация этих трех цистеинов заблокирована пальмитоилирование и локализация в ИКА (Chaudhary и др., 2005).

Биологическая основа функциональной избыточности HXGPRT в T.gondii, не является очевидной, поскольку обе изоформы функционально компетентного HXGPRT Activ-ности, (Donald и соавт, 1996;. Дональд и Русы, 1998). Вполне возможно, что эта функциональная избыточность HXGPRT позволяет T.gondii, чтобы расти в более широком разнообразии типов клеток, где пурины могут быть ограничивающими, и дополнительные механизмы могут потребоваться для пуринового транспорта и спасения. Кроме того, эта новая двойная локализация HXGPRT может отражать экономику метаболизма пуринов внутри самого паразита, или, возможно, какой-то неизвестный аспекта регулирования пуринов.

Исследования Т. гондий пуриннуклеозидфосфорилаза Ген Т. гондий ПНП был клонирована и экспрессирована в E.coli. Подобно человеческому и P. Falci-parum ПНПА, рекомбинантный Т. гондий ПНП фермент распознает инозин и гуанозин, как хорошие субстраты, а также аденозин и ксантозин, как плохие субстраты. Оба Т. гондий ПНП ПНП и малярия являются необычными в том, что дезоксинуклеозидов являются плохими субстратами (Chaudhary и др., 2006). Этот необычный субстрат свойство паразита ПНП показывает, что внутриклеточный паразит может иметь доступ к хост-пула гуанозин и инозин, но будет плохо включать хост дезоксигуанозин или дезоксиинозин транспортируемого паразита. Т. гондий ПНП не показали Activ-итй против 5'-methylthioadenosine (МТ) или 5'-methylthioinosine (MTI), и был нечувствительным к ингибированию метилтио (MT) -immucillin-H (Chaudhary и др., 2006). Immucillin-Н является сильным ингибитором нМ фермента паразита в пробирке (Chaudhary и др., 2006).

пуринов

477

В то время как репликация T.gondii, пара-сайтов дикого типа полностью не зависит от immucillin-H в пробирке, АК нокаута мутант Т. гондий является inhib-ITED по immucillin-H (Chaudhary и др., 2006). Ингибирование роста immucillin-H в нокаут фоне АК в значительной степени восстанавливается посредством Provid-ки избытка гипоксантина в пробирке культуральной среды в (Chaudhary и др., 2006). Если хост-аденин и гипоксантин подаются в достаточном количестве к реплицирующемуся паразиту, этот запас пурина должен придавать устойчивость к immucillin-H даже в нокауте-мутанте АК (рис 18.1A). Таким образом, на основе ингибирования роста с нокаутом АК путем immucillin-H, то возможно, что снабжение принимающего аденозина и инозина в intracel-lular среды превышает потенциальный запас хозяина аденина и гипоксантина, предполагая, что хост-нуклеозиды, а не принимающие нуклеотидные являются более важным пурином бассейном (рис 18.1A). Предостережение этой интерпретации ингибирования паразита ПНПА путем immucillin-H вероятность того, что гипоксантин может, отчасти, антагонизм ингибирования PNP, или что хост ПНП также ингибируется immucillin-H, таким образом уменьшая хост пуриновых бассейнов (Kicska и др., 2002а). Тем не менее, эти исследования дополнительно Вели-дата предложенные пути для пуринов incorpora-ции и спасения в Т. гондий (рис 18.1A). 2002a). Тем не менее, эти исследования дополнительно Вели-дата предложенные пути для пуринов incorpora-ции и спасения в Т. гондий (рис 18.1A). 2002a). Тем не менее, эти исследования дополнительно Вели-дата предложенные пути для пуринов incorpora-ции и спасения в Т. гондий (рис 18.1A).

Генетический отбор, основанный на Т. гондий HXGPRT Ранние исследования установили HXGPRT паразита и как потенциальной цель лекарственного средства, и ген, который был бы пригоден как для положительной и отрицательной генетической селекции в Т. гондиях (Pfefferkorn и Borotz, 1994). Механизм 6-thioxanthine inhibi-ции основан на активации 6-thioxanthine до 6-thioxanthine 5'монофосфат от паразита HXGPRT (Пфефферкорн и др., 2001). В отличие от mercap-topurine у млекопитающих (Elion, 1989a, 1989b), 6-thioxanthine и его нуклеотидная продукта 6-thioxanthine 5'монофосфат не является субстрат для Т. гондия GMPs и не включен в нуклеиновые кислоты. Механизм ингибирования parasitostatic, и в первую очередь включает в себя ингибирование паразита IMPDH на 6-thioxanthine 5'монофосфата (Пфефферкорн и др., 2001).

Т. гондий мутанты, дефицитные по HXGPRT полностью устойчивы к токсическому воздействию

6-thioxanthine (Пфефферкорн и Borotz, 1994). После того, как 6-thioxanthine сопротивления был выбран нокаутом HXGPRT, паразиты с функциональным HXGPRT может быть положительно отбирали по росту в микофеноловой кислоты (MPA) с добавками ксантина или гуанин (Pfefferkorn и Borotz, 1994). Эта схема выбора основана на способности MPA специфический ингибировать IMPDH, блокируя превращение ИМФ в XMP (рис 18.1A). Таким образом, паразиты с нефункциональным HXGPRT не могут быть спасены с ксантина или гуанина, когда IMPDH ингибируется, тогда как паразиты с функциональной HXGPRT будет спасен ксантина или гуанин добавок среды роста, и этот путь будет обходить ингибирование при IMPDH. Биохимический описание этой стратегии селекции также доказали, что Т.

Идентификация гена HXGPRT включен тест этого биохимического прогнозирования и привела к созданию прочной генетической схемы селекции для позитивной и негативной селекции с использованием принципов отбора, описанные выше (Donald и др., 1996). Схема выбора HXGPRT была создана первая система для генетической хит-беги мутагенеза в Т. гондий, где может быть установлен стабильный псевдо-диплоидный во время позитивной селекции, то негативный отбор используется, чтобы вытеснить ген HXGPRT, чтобы создать тонкое или основная мутация в локусе гена интереса (Donald и Руса, 1998). Генетическая модель HXGPRT широко используются для генерации мутантов с нокаутом в несущественных генах паразита, а также в генетических исследованиях развития паразита.ε-proteobacterium типа гена IMPDH из культуры C.parvum (Striepen и др., 2002).

18.2.3.2 пуринов спасательных путей в культуры C.parvum

Экспериментальная работа по пуриновому пути в культурах C.parvum была ограничена отсутствием надежного

478 СРАВНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ нуклеотидных и аминокислотного метаболизма в токсоплазма

системы для культивирования этого паразита, отсутствие каких-либо генетических моделей, а также трудности с получением очищенных паразитов для биохимического анализа. В Cryptosporidium геном дали первое подробное понимание стратегии паразита принявшую удовлетворить его аппетит к хост-клетки пуринов (Абрахамсено и др., 2004; Striepen и др., 2004; Xu и др., 2004). В дополнении к своей ограниченной способности синтезировать аминокислоты и пиримидины (обсуждается ниже), культуры C.parvum также обладает очень ограниченным репертуаром пуриновых и гаражей Intercon-версия ферментов по сравнению с другими apicomplexans (Chaudhary и др., 2004; Striepen и др. , 2004). Хотя раннее исследование с использованием экстрактов сырой паразитные предложил культуры C.parvum выразил HXGPRT и Aprt деятельности (Doyle и др., 1998), культуры C.parvum отсутствует какой-либо ген ортолог для Aprt или HXGPRT,

Примечательно, что аденозин является единственным хозяином пурин, что имеет какое физиологическое значение для культуры C.parvum, и поставляется в среде кишечника или клетки-хозяева, занимаемого культуры C.parvum (рис 18.1B). Подобно Т. гондий и П. фальципарум, культуры C.parvum обладает геном ортолог аденозина транспортера, которая может нести ответственность за транспорт хозяина аденозина в цитозоль паразита (Абрахамсно и др., 2004). Когда хозяин аденозин доступен в паразите цитозоле, паразит может включать в себя аденозин в нуклеотидном бассейн на АК пути-пути к AMP. После того, как паразит имеет нуклеотидный пул AMP, этот пул удовлетворяет весь спрос на весь аденилат и гуанилатциклазы нуклеотидов (Абрахамсно и др., 2004). AMP является первым деаминированы ИМП по AMPD. ИМФЫ затем преобразуются в XMP с помощью IMPDH и ХМР преобразуются в GMP с помощью ГИП (рис 18.1B). Так как не существует обратный путь от IMP до АМФ, нуклеотидная поток распространяется только от AMP до GMP. Ген parvum IMPDH С. был приобретен горизонтальным переносом генов изε-proteobacterium (Striepen и Киссинджер, 2004; Striepen и др., 2002, 2004). Паразита обладает только эти четыре ферменты, чтобы направить unidirec-ционных потока транспортируемой хозяина аденозина паразитировать аденилатциклазы и гуанилатциклазы нуклеотидов (рис 18.1B).

Потенциальные цели наркотиков в Пурин культуры C.parvum спасательных путей В отличие от Т. гондий, каждый из культуры C.parvum пурин ферменты пути метаболизма (АК, AMPD, IMPDH и ГМР) по отдельности представляет собой потенциальную мишень лекарственного средства. Активность АК культуры C.parvum была Вели-датирована в качестве мишени лекарственного средства в генетических экспериментах с использованием АК-дефицитным мутантом Т. гондия. Культуры C.parvum АК дополняет дефицит АК в Т. гондий, RESTOR-ки значительного АК активности (Striepen и др., 2004).

IMPDH ингибирование с помощью лекарственных средств, таких как рибавирин, мизорибин, и МРА была продолжена в качестве стратегии для индуцирования гуанилата нуклеотидного истощения для Ther-APY при раке, иммунодепрессивной химиотерапии и инфекционных заболеваний (Allison и Eugui, 2000, 2005;. Pockros и др 2003). Способность человека и многих патогенов phosphoribosylate гуанина к GMP может разбавить потенциальный терапевтический эффект ингибирования IMPDH путем предоставления второго маршрута к GMP. Отсутствие этого второго пути к GMP в parvum предполагает C. гуанилатциклазов голодание может быть эффективно индуцируется посредством ингибирования IMPDH или GMPs, а также АК и AMPD. Рибавирин и MPA были показаны в начале работы для ингибирования культуры C.parvum Devel-тие (Woods и Upton, 1998). Недавние работы показали, что C. parvum развитие ингибируется в зависимости от дозы этих ингибиторов IMPDH (Striepen и др., 2004).

18.2.3.3 пуринов спасательных путей в П. фальципарум

Пурин и взаимопревращение Б путь является более разнообразным в P. фальципаруме, чем в культурах C.parvum, и может быть немного менее надежным, чем пути, присутствующие в Т. гондиях. Тем не менее, П. фальципарум (и Plasmodium зр.) Однозначно обладают ферментами метаболизма пуринов, которые высоко адаптированы к внутриклеточным проблемам, с которыми сталкиваются этим паразитом. В Apicomplexa, Plasmodium зр. является уникальным в живых и тиражирование в эритроцитах. Эритроцита является весьма дифференцирован типом клеток, который потерял много возможностей, как правило, присутствует в других типах клеток млекопитающих, и, следовательно, имеет очень ограниченные требования нуклеотидных. Человек эритроциты также не имеет ядра, не Synthe размера ДНК, РНК или белок, и испытывает недостаток как пуриновых и пиримидинового De Novo пути синтеза.

пуринов

479

Для выполнения своих нуклеотидных требований, П. Falci-parum по-видимому, способен транспортировать пуриновые нуклеотидные гипоксантин, ксантин и гуанин, а также пуриновых нуклеозидов, аденозина, инозин и гуанозин. П. фальципарум обладает соответствующей ферментативной машиной для взаимопревращения и включения любых из этих шести потенциальных источников пуриновых (рис 18.1C) (Chaudhary и др., 2004). P. фальципарум не имеет обратного пути от гуанилата к аденилатный нуклеотидам, и в то время как хост поставляемого ксантина, гуанин, или гуанозин, коллективно, мог бы удовлетворить спрос паразита для гуанилатциклазов нуклеотидов, эти предшественники не могли поставлять любую аденилатный нуклеотиды. Хост аденозина, инозин и hypox-anthine, индивидуально или коллективно, Поэтому, вероятно, будет необходимы для удовлетворения спроса на паразит для аденилата и гуанилатциклазов нуклеотидов. В то время как паразит может транспортировать дополнительные соединения пурина, их физиологическое значение, если таковые имеются, не ясно, в это время. Так, например, аденин транспортируется П. фальципарум, пока не incorpo рейтинг, так как паразит не хватает Aprt и АДЭ генов и активностей (Chaudhary и др., 2004).

Подобно Т. гондий, П. фальципарум может конвертировать аденозин в инозин с помощью ADA, и инозин затем превращают в гипоксантин от паразита ПНП (рис 18.1C). Подобно человеку и Т. гондий ПНП, П. фальципарум ПНП не распознает ни ксантозина или аденозина в качестве субстрата хорошей (Kicska и др., 2002а). Гипоксантин вводят в пул нуклеотидов в качестве IMP по HXGPRT. После того, как IMP доступен, паразит может удовлетворить все свои потребности в аденилате и гуанилатциклазы нуклеотидов. Следует отметить, что P. фальципарум не хватает какой-либо обнаружить ген АК или активность. IMP преобразуется в AMP в два этапа путем последовательных реакций ADSS и ADSL. Это единственный путь к АМП. Паразит может сбалансировать ИМФ и AMP пулов в обратной реакции AMP дезаминирования к IMP (рис 18.1C).

Поскольку П. фальципарум не имеет прямой путь к АМФ из аденозина, наиболее важным пуриновых для включения в пуриновых нуклеотидов становится гипоксантин. Гипоксантин является единственным пуриновым соединением, которое может полностью удовлетворить спрос паразита для оба аденилата и гуанилатциклазов нуклеотидных бассейнов. Как также видно в обоих T.gondii, и

культуры C.parvum (Рисунок 18.1), ИМП превращается в XMP от паразита IMPDH, а впоследствии GMP на паразита ГМР. ХМР и GMP, также включены в P. малярийного через phosphoribosylation ксантина и гуанина, соответственно. Таким образом, в конечном счете, паразит включает в себя все нуклеотиды пуриновых через паразит HXGPRT активность, и обладает мини-мамой из семи различной пурина взаимопревращения или включения деятельности (рис 18.1C).

Потенциальные цели наркотиков в П. фальципарума пурина реутилизация Механизм, используемый P. фальципарум, чтобы удовлетворить свой пуриновый ауксотрофию предполагает, что пуриновые транспортеры, паразит HXGPRT, некоторые пурины взаимопревращения ферменты или недавно обнаружили новые переработки пуриновой или реутилизации могут все быть аменабельными мишенями для лекарственного средства развитие. Из-за отсутствия активности АК в П. малярийного деятельность ADA и PNP были RECOG-зовал в качестве потенциальных мишеней для лекарственных средств в ранних исследованиях (Daddona и др, 1984, 1986;. Webster и др., 1984).

Гипоксантин может быть непосредственно транспортирует паразит из паразитов клетки-хозяина или, изменять-нативно, гипоксантин может подаваться от транспортируемого инозина и аденозина через ADA и деятельность ПНФА. Хост эритроцитов гипоксантин бассейны могут увеличиться в течение инфекции от хозяина catabo-ЛМЗСА АТФ в ухудшении паразитируют эритро-cytes. Хост эритроцитов АТФ катаболизируется последовательно, с помощью АДФ, АМФ, аденозина, и инозина, чтобы произвести гипоксантин через хост ПНФ (Тин и др., 2005). Известно, что истощение гипоксантина эффективно ингибирует репликацию малярийного П. в пробирке (Берман и др, 1991;. Берман и человеческий, 1991); Таким образом, физиологический источник гипоксантина является важным вопросом, требующим ответа оптимизации стратегий для ингибирования приобретения пурина Plasmodium инфекции. Если масса объединенной гипоксантин происходит строго в паразита цитозоле от транспортируемых пуринов хозяина, паразит ААР и деятельность PNP могут быть оптимальные цели наркотиков. Осложняет этот анализ, однако, недавние исследования, которые демонстрируют П. фальципарум быть крайне необычным в обладании тропу от 5'-methylthiopurines в гипоксантин. Если П. фальципарум может перевозить 5'-methylthiopurines из среды эритроцита, паразит

480 СРАВНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ нуклеотидных и аминокислотного метаболизма в токсоплазма

потенциально могут спасти дополнительный гипоксантин этим новым пути (обсуждается ниже).

Ингибирование ПНФ в П. П. фальципарум фальципарум обладает структурно новый PNP фермент, который ингибируется immucillin соединений (Kicska и др., 2002a). Несколько immucillin соединений связываются P. фальципарум ПНФА с низкими константами ингибирования наномолярных и ингибируют активность ферментов. Человек ПНП также является объектом immucillins, с суб-нмоль констант ингибирования, и в настоящее время эти соединения изучаются для лечения рака и иммуносупрессии химиотерапии. Immucillin-Н, immucillin, который ингибирует как человек и P. фальципарум PnP, индуцированные пуриновые менее смерти в P. фальципарум инфекции (Kicska и др., 2002b). Рост паразита inhibi-ции, индуцированный immucillin-H восстанавливается путем дополнения культуральной среды с высокими дозами гипоксантина, предполагая, что эффект immucillin-H в первую очередь блокировать приобретение основных пуринов, в результате чего пуринового менее смерти (Kicska и др., 2002b). Кристаллическая структура и энергетические исследования по картированию П. трехдневной ПНП и immucillin интер-акций находятся под следствием, чтобы идентифицировать селективные ингибиторы паразита ПНП (Shi и др., 2004;. Lewandowicz и др, 2005).

Ингибирование HXGPRT в П. фальципарум Ранние шпилька-х годов на ингибиторы роста поддержки фальципарум П. HXGPRT активности паразита для разработки лекарственного единения (Queen и др., 1990). П. рост фальципарум в пробирке ингибируется аналоги пурина 6-меркапто-пурин, 6-тиогуанин и 8-азагуанин. Исследования не проводились, чтобы установить, является ли механизм 6-меркаптопурин торможения в P. малярийного аналогичен механизму у млекопитающих, который требует активации с помощью фосфо-рибозилирования через хост HGPRT, а затем Понимать-ции GMPs включать токсическое аналог в гуанилатциклазах нуклеотидного пул для его токсического incorpo-рациона в нуклеиновые кислоты (Elion, 1989a, 1989b).

Ранние исследования характеризуются ферментативные проп-erties и ген, кодирующий P. фальципарум HXGPRT (Queen и др, 1988;.. Vasanthakumar и др, 1989, 1990). Кристаллическая структура P. фальципарум HXGPRT выявили уникальные структурные особенности

Паразит фермента по сравнению со структурой человеческого фермента (Ши и др., 1999а, 1999b). Дополнительные исследования исследовали механизмы ферментов, и особенности направляя субстратной специфичности и свинца ингибиторы переходного состояния были зарегистрированы (Саркар и др., 2004; Томас и Field., 2002; Ши др, 1999a; Li и др., 1999). На основе пуриновых инкорпорации путей выясненных для P. фальципарум, селективно блокирует включение гипоксантин путем ингибирования HXGPRT было предсказано, как правило, чтобы побудить пуринового меньше смерти в P. малярийного (рис 18.1C). Экраны были созданы, чтобы идентифицировать селективные субстраты P. фальципарум HXGPRT (Shivashankar и др., 2001). Вполне возможно, что ксантин phosphoribo-syltransferase деятельность П. трехдневный HXGPRT, которая отсутствует в организме человека,

Inhibitionofguanylatenucleotidepoolsin

П. фальципарум гуанилатциклазы нуклеотиды могут возникнуть из гуанина, поставляемого хоста, гуанин, полученного из хост-гуанозина от паразита ПНП, и ксантин через HXGPRT. Эритроцит хозяин П. малярийного не хватает активности киназы гуанозина, и биохимические данные свидетельствуют о том, что хозяин гуанин и бассейны гуанозиновых доступны для P. малярийных ограничены (Reyes и др., 1982). П. рост фальципарум в пробирке подавляется psicofuranine, ингибитора бактериального GMPs (McConkey, 2000). Psicofuranine ингибирования роста паразита антагонист путем подачи дополни-тельного гуанина паразитировать среды роста (McConkey, 2000). Эти наблюдения дают убедительные доказательства того, что основной путь к GMP лежит через ГИП, и демонстрирует, что при культивировании в пробирке потенциальное предложение хозяина гуанина и гуанозина ограничен (рис 18.1C).

К сожалению, возможное значение хозяина ксантина в формировании GMP не выяснено эти исследования. Ксантин может быть включен в бассейн GMP на последовательных реакции HXGPRT и ГИП. Эритроциты человека, как сообщает, имеет концентрацию ксантина в ~ 3.6ìM,

пуринов

481

который может быть достаточным для физиологического транспорта и включения пути HXGPRT и ГМРОМ (Траут, 1994). МРА, высоко специфический ингибитор IMPDH, блоки П. фальципарум репликация на микромоле доза в пробирке (Королева и др., 1990). Хотя эти наблюдения указывают на то, что хозяин ксантина бассейны не являются достаточными, чтобы обойти торможение на паразита IMPDH, эти результаты не могут быть окончательно между preted, потому что MPA также подавляет хозяина IMPDH и истощает хост гуанилатциклазы нуклеотидные бассейны.

Inhibitionofadenylatenucleotidepoolsin

П. фальципарум Единственный путь к АМФ из ИМФ нуклеотида пула через последовательные REAC-ций, катализируемых ADSS и ADSL. П. фальципарум ADSL был клонирован и экспрессирован в E.coli для кинетического анализа, а кристаллическая структура теперь помогло-состоянию (Джаялакшй и др., 2002; Eaazhisai и др., 2004). Уникальный механизм реакции был недавно описан для этого необходимого фермента паразита (комбинационный и др., 2004). Ориентация либо ADSS или ADSL, или оба, по прогнозам, чтобы полностью истощить P. Falci-parum существенных аденилат нуклеотидов и ингибируют репликацию паразита (рис 18.1C).

18.2.3.4 новой альтернативы пурина п athway в Apicomplexa

Из apicomplexans, рассмотренный в этой главе, только П. фальципарум обладает уникальным альтернативным путем к пуринам через переработку-'-метил-Thiopurines генерируется во время полиаминов метаболизма (Тин и др., 2005) (рис 18.1C). В то время как ранние исследования намекают на существование этого нового пути (Sufrin и др., 1995), недавние исследования помогли проиллюстрировать важную физиологическую роль для пути, и в пробирке исследования подтверждено компоненты пути, чтобы быть наркотиков цели , Это захватывающая и новая область биологии в П. малярийного плазмодия и зр., И потребует дальнейшего детальные исследований для определения физико-логического значения этого недавно описанного путем-путь оптимизации стратегии для разработки лекарственных средств. Ингибирование роста достигается за счет обработки паразитов-инфицированных эритроцитов с immucillins (Kicska и др., 2002a, 2002b) может быть многогранной, поскольку П. фальципарум ПНП играет двойную роль

как в преобразование инозина в гипоксантин, а в утилизации 5'-methylthioinosine к гипо- ксантина (Тин и др., 2005). Таким образом, П. фальципарум имеет новый путь к гипоксантину. Текущие данные свидетельствуют этот новый путь играет важную роль в обмене веществ паразита во время репликации в эритроцитах (Ting и др., 2005).

Пересечение полиаминов и пуринового Metabo-ЛМЗС в П. фальципарум Эритроциты не синтезируют полиамины, П. фальципарум, в отличие от Т. гондий, должен синтезировать свои собственные полиамины. Таким образом, репликация фальципарума П. может быть заблокирована difluo-romethylornithine (DFMO), ингибитор механизма на основе орнитиндекарбоксилазы (ODC), участвующий в превращении орнитин в путресцин в синтезе полиаминов (Muller и др., 2001). Биосинтеза полиаминов путь образует молекулу-'-methylthioadenosine (МТ) на каждый моль-Cule спермидина, или спермина, то есть СЕНТ размера. В организме человека и других организмов, АПС, как правило, возвращают к регенерации как аденин и метионин бассейны.

Удивительно, но гены, связанные с пуринового спасанием (Aprt) и утилизации MTA в метионин бассейне отсутствуют в геноме P. фальципарум (Гарднер и др, 2002а, 2002b;.. Chaudhary и др, 2004). Тем не менее, П. фальципарум ААР было недавно обнаружено, чтобы иметь новую способность распознавать MTA в качестве субстрата и преобразовать MTA до 5'-methylthioinosine (MTI) (Тины и др., 2005). Кроме того, П. фальципарум ПНП было обнаружено, обладают уникальной способностью распознавать MTI в качестве субстрата и конвертировать MTI в гипоксантин. Этот новый путь был доказан, чтобы быть функциональным, когда exoge-изуча- лося поставляется MTI был включен в P. тропических нуклеиновые кислоты (Тины и др., 2005). Таким образом, уникальные субстратные свойства P. фальципарум ADA и PNP содержат новую мету-Болич пути от МТА MTI к гипоксантину для селективной утилизации пуринов из polyaminine биосинтеза (рис 18.1C).

Ранние исследования показали, что П. фальципарум выражены очень обильные уровни ADA, PnP, и HXGPRT по сравнению с соответствующей деятельностью, присутствующих в принимающей эритроцита, следовательно, указывает на потенциально важную вторичную роль

482 СРАВНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ нуклеотидных и аминокислотного метаболизма в токсоплазма

за их роли в нормальных путях пуриновых (Reyes и др., 1982). Несмотря на то, П. фальципарум растет нормально в PNP- и ААР-дефицитных эритроцитов принимающих (Daddona и др., 1984, 1986), ингибиторы паразита и хозяина АДА, такие как coformycin, deoxyco-formycin и L-рибозил аналогов coformycins блок P. фальципарум репликации (Daddona и др, 1984;.. Геро и др, 2003). Селективное ингибирование P. фальципарум ПНФ, но не пройдет ПНФ, с МТ-immucillin-Н блокировали репликацию паразита почти столь же эффективно, как immucillin-H (Ting и др., 2005).

Эффективность МТ-immucillin-H против малярии указывает на то, что P. фальципарум ПНП является критическим активность паразита. Это маловероятно, что МТ-immucillin-Н ингибирует полиамин путь пути ингибирования продукции на MTA, так как П. фальципарум АД преобразует MTA в MTI (рис 18.1C) и, что существенно, экзогенно гипоксантин обращает ингибирование ин витро, достигнутое обработка с МТ-immucillin-H или immucillin-H (Kicska и др, 2002b;.. Ting и соавт, 2005). Эти наблюдения указывают на то, что хозяин бассейна (или поток) в одиночку гипоксантин, вероятно, будет недостаточно для поддержания роста паразита в процессе культивирования в пробирке. Таким образом, узел инозин бассейн, хозяин аденозин бассейн или hypoxan-твой восстанавливается в новой рециркуляции пурина пути-дороге, вероятно, будет необходимо для нормальной репликации P. малярийного (рис 18.1C).

Утилизация и / или спасательные? Ключевой вопрос остается-ки на который нужно ответить, играет ли роман путь утилизации пуриновых в П. малярийного любую непосредственную роль в пуринов спасанию. Экзогенно MTI транспортируется П. малярийного и включены в паразита нуклеиновых кислот (рис 18.1C) (Тин и др., 2005). Любые поставки хост MTA транспортируют P. малярийного можно было бы спасти, чтобы hypoxan-Твое и включены в пул нуклеотидов IMP (рис 18.1C). МТА может представлять собой источник сущеста-косяк пуринов для P. фальципарума, если МТ в изобилии в эритроцитах и паразит имеет транспортер, способный красть эту молекулу из

хост цитозол / паразитофорное вакуоль пространство. С другой стороны, это также вероятно, что П. фальципарум может либо секретирует ADA в эритроцитах цитозол или паразитофорную вакуоля пространство для преобразования хоста-АПСА в MTI, или секретирует ПНФ в эритроцитах цитозол или паразитофорную вакуоля пространство для преобразования хоста MTI в гипоксантине. Оба из этих стратегий может увеличить поставки пуринов П. фальципарум, потому что оба MTI и гипоксантин транспортируются и включены в паразита нуклеиновых кислот (рис 18.1C) (Ting и др., 2005). Таким образом, исследования локализации П. Falci-parum АДА и ПНП в пораженных эритроцитов, а также возможностей MTI и MTA транс-порта, необходимо полностью решить основную Phys-iological функции этого нового пути.

18.2.3.5 Источником полиаминов в Apicomplexa

малярийный плазмодий Принимающие Эритроциты не синтезируют полиамины. В отличие от этого, рост П. фальципарум в пробирке эффективно блокируется ингибитором ОДК DFMO (Muller и др., 2001). ODC катализирует превращение орнитина в путресцина на первой стадии в синтезе спермидин и спермин (Tabor и Tabor, 1985). Включение радиоактивно глутамина в орнитин бассейна в П. малярийного было незначительным, что свидетельствует о том, что паразит обладает еще один важным маршрутом, чтобы приобрести или синтезировать орнитин (Gafan и др., 2001). В организмах, которые синтезируют полиамины, другие основные маршруты через ферментов для аргиназы и ODC, или аргинин декарбоксилазы (превращения аргинина в Agmatine) и агматиназой. Аргиназы непосредственно преобразует аргинин в орнитин, в то время как агматиназа обходит орнитин полностью CON-инвертирующий агматин к путресцину (Wu и Morris, 1998).

A П. фальципарум ген аргиназы был клонирован и рекомбинантный фермент, при экспрессии обладает активностью аргиназы без заметной агматиназы активности (Мюллер и др., 2005). Как обсуждалось в разделах 18.3 и 18.4 (пиримидинов и аминокислоты), все apicomplexan паразитов не способны де ново синтеза аргинина и, следовательно, должны приобрести аргинин от хоста.

пуринов

483

Аргинин взято от хоста П. малярийного используются в синтезе белка, а также биосинтез полиаминов. Простейшим паразитом Leishmania зр. также использует аргиназную активность, которая необходима для биосинтеза полиаминов (Satriano, 2003; Roberts и др., 2004).

Чувствительность P.falciparum к ДФМО предполагает, что ODC активность имеет важное значение. П. фальципарум имеет новый ODC активность, которая существует в виде bifunc-ционных фермента с S-аденозилметионин decar-boxylase. Этот бифункциональный фермент обеспечивает хорошо сбалансированный синтез путресцина из орнитина без вовлечения взаимодействий домен-домен (Krause и др., 2000;. Мюллер и др., 2000; Wrenger и др, 2001; Birkholtz и др., 2004). Путресцин и deoxyadenosylmethionine объединены спермидин-синтазы, создавая одну молекулы спермидина и молекулу MTA, который рециркулирует на MTI АДА, а затем к гипоксантину с помощью ПНФА (рис 18.1C) (Muller и др., 2000; Chaudhary, 2005;. Тины и соавт, 2005). П. фальципарум также транспортирует хозяин spermi-дину (Muller и др., 2001). Нет P.

Cryptosporidium parvum В отличие от П. фальципарум, культуры C.parvum, как представляется, biosynthesize полиамины от пути преимущественно бактерий, присутствующих в и растений, связанных с аргинином decar-boxylase и агматиназу (Yarlett и др., 1996). На основе экстраординарных транспортных мощностей культуры C.parvum, также вероятно, что этот паразит может также транспортировать путресцин или другие полиамин из богатой среды кишечника человека. АЦП культуры C.parvum активность ингибируется difluoromethylargi девять, и не зависит от DFMO (Keithly и др., 1997). Так как культуры C.parvum отсутствует какой-либо ген ортолог или активность для ПНФА (рис 18.1B), этот паразит-инк pable утилизации 5'-methylthiopurines обратно в паразит пуринов бассейна.

токсоплазма Происхождение полиаминов в Т. гондий четко не решен в это время, хотя вес текущих данных свидетельствует о том, что этот паразит ауксотрофная для полиаминов и должны обитать клетки-хозяева, которые могут поставлять полиамины.

Паразита, как представляется, транспортеры, способные транспортировать орнитин, путресцина, или другие полиамины (Chaudhary, 2005). Т. гондий, как представляется, не хватает ODC активности (Seabra и др., 2004), а также рост тахизоитов не зависит от ДФМО (Chaudhary и др., 2006).

Генома Т. гондий действительно показывает наличие гена ортолога с гомологией к АЦП / ODC семейства генов (Киссинджер и др., 2003). Если функциональные, этот ген ортолог будет представлять собой потенциальный АЦП, основанный на отсутствии чувствительности к ДФМ. В настоящее время нет гену ортолог не может быть идентифицирован для члена семейства генов, связанной аргиназа / агматиназы, или любого другого элемента гена в пути биосинтеза полиаминов (Чаудхарьте, 2005). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что Т. гондий не в состоянии биосинтеза полиаминов, и, скорее всего, полагается на прямой транспортировки и спасение предварительно сформированных полиаминов, поставляемых клеткой-хозяином. Отсутствие какого-либо гена ортолога для спермидина-синтазы или спермина-синтазы предполагает, что паразит не производит MTA. Даже в маловероятном случае, что МТ или MTI присутствовал в

T. гондий, 5'-methylthiopurines не может быть переработана в паразит пуринового пула. Т. гондий ПНП не может использовать MTI в качестве действительного субстрата (рис 18.1A) (Chaudhary и др., 2006).

Адаптация полиаминов и пуриновых пути в Apicomplexa Селективная адаптация П. фальципарум ADA и PNP ферментов, чтобы переработать-'-methylthiopurines к гипоксантину может возникнуть в ответ на потерю активности АК (Тины и др., 2005). Потенциал поток пурина отражаются как требованиями паразита и ограничениями пуриновых принимающего эритроцита. Репликация П. малярийный происходит путем шизогонии, где репликация ДНК и ядерное деление координируются в узком окне времени. Шизогония, где многие дочерние ядра быстро формируется, может потребовать повышенное требование для потока пуринового в П. фальципарум. В противоположность этому, Т. гондий реплицируется по endodyogeny и создание дочери паразитов примерно каждые 7 часов. Endodyogeny, где дочернее ядро образуется из одного материнского ядра, может по своей природе требует более низкий потока пуринов поддерживать репликацию.

484 СРАВНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ нуклеотидных и аминокислотного метаболизма в токсоплазма

Пиримидинов

Пиримидины являются важными компонентами нуклеиновых кислот, а также участвуют в других аспектах клеточного метаболизма, а также. Большинство apicomplexan паразиты сохранили способность к De Novo синтеза молекулы родительского пиримидина, уридин 5'монофосфата (УМФ). В apicomplexan паразиты, которые полагаются на De Novo синтетического пути-пути, таким образом, зависит от соответствующего источника молекул-предшественников для биосинтеза пиримидинов. Эти молекулы-предшественники включают небольшие молекулы, такие как бикарбонат, аминокислоты, и пуриновых нуклеотидов. Следовательно, получение аминокислот и удовлетворяющей пуриновый auxotro-PHY из apicomplexan паразитов необходимо для биосинтеза пиримидинов.

Большинство apicomplexans, в том числе Т. гондия и П. малярийного, имеет функциональные пути для де Novo синтеза пиримидинов. Т. гондий необычен в также обладающем пиримидине спасательной деятельности. Тем не менее, путь биосинтеза пиримидина имеет важное значение для репликации как Т. гондия и П. фальципарум. Некоторые apicomplexans, такие как культуры C.parvum, потеряли способность синтезировать UMP по пути De Novo, и полностью полагаться на гаражи пути приобрести необходимые пиримидины от хоста. В этих apicomplexans, приобретение -пиримидина-idines полностью зависит от транспорта и спасания преформированного pyrmidine нуклеотидных и нуклеозидов от хоста. Культуры C.parvum, однозначно, приобрела несколько видов деятельности пиримидина спасанию не наблюдается в других apicomplexan паразита.

Относительно мало экспериментальных работы были выполнены на соответствующие транспортных путях, необходимых для биосинтеза пиримидинов, или отношений и кросс-регуляторных разговоров могут произойти между пиримидиновыми и пуриновыми путями. Интересно, что пиримидин голодание является одним из триггеров, используемых экспериментально индуцировать в пробирке стадии дифференцировки у Т. гондий от тахизоят к этапам брадизоитных (Bohne и Roos, 1997; Русо и др., 1997). Недавние исследования прояснили функциональную организацию пиримидинового обмена в Apicomplexa, и выявили новые стратегии для целевых

существенные пиримидиновые пути приобретения в apicomplexan паразитов.

CPSII

ATC

бикарбонат

DHO

дигидрооротат

DHODH

электроны

в КоО

оротат

ФРПФ

OPRT

оротидин 5'-монофосфата

OMPDC

уридин 5'Монофосфата (UMP)

см. 18.3 для

CMP DTMP

цитидиновое

ФРПФ

УПРТ

дезоксицитидин

ФРПФ

CYTD

DCYTD

УПРТ

УПРТ-UK

Т.К.

URDP

DURDP

Урацил

уридин

деоксиуридин

урацил

уридин

цитидиновое

тимидина

Тд, Pf

Шикимата Тропинка

Фолиевая Синтез

Тд, Pf

GTP

Фолиевая Поврежденный

хоризмат

5,6,7,8-тетрафолата

Тд, Pf, Ср

ПАБК

DHPS

7,8-dihydropteroate

L-серин

SHMT

DHFS

DHFR

ПАБК Поврежденный

ДУМФ

Тд, Pf

7,8-dihydropteroate

5,10-метилентетрагидрофолат

тимидина

DTMP

Т.К.

Фолиевая Поврежденный

РИСУНОК 18,3 Тимина нуклеотид синтез и путь к фолиевой кислоте в Apicomplexa. Подготовка присутствующие в Т. гондий (Tg), П. малярийного (Pf), и культуры C.parvum (Cp) обозначены прямоугольниками. Цикл тимидилата заключен большой треугольник. Потенциальные синтетические или slavage источники фолиевой кислоты, поступающей в цикл тимидилата показаны. Сплошные линии и стрелки изображают активные дорожки присутствуют. Субстраты нескольких ферментативных активностей приведены в начале сплошных линий, и продукт (ы), показаны на стороне стрелки. Несколько ключевых ферменты указаны в капитальном курсиве рядом стреловидных линий. Все пути, показанные по всей видимости, будет присутствовать, как указано; Однако, значение фолата гаражей и ПАКА гаражей путей неясно в Tg и Pf и обозначается вопросительным знаком. Polyglutamated форма фолиевой кислоты не показана. Синтез DTMP показан в нижней части цикла тимидилата. Поврежденный тимидина в Cp показано. DHPS, dihydropteroate-синтазы; DHFS, дигидрофолатредуктазы синтетазы; SHMT, серин hydromethyltransferase; DHFR, дигидрофолатредуктазы; TS, тимидилат синтетазы; ТК, тимидинкиназа.

что он также выражает Т.К. деятельность, которая предоставляет эту	5'трифосфата (ГТФ), пуриновое нуклеотид, который
паразитировать потенциально значительный реутилизации	протозойные паразиты не могут синтезировать De Novo.
к DTMP (рис 18.2, 18.3) (Абрахамсен и др.,	Люди не обладают способностью синтезировать фолат De Novo,
2004; Striepen и др., 2004). В настоящее время неизвестно	и полагаться на фолатый транспорт из пищевых источников.
является ли ингибирование DHFR будет препятствовать культуры C.parvum	Напротив, некоторые из apicomplexans обладают
Репликация.	эндогенный путь биосинтеза фолата, который
	восприимчивы к антифолату ингибиторы. Т. гондий и
18.3.4.1 Биосинтез фолатов	П. фальципарум обладают полным набором генов
18.3.4.1 Биосинтез фолатов	кодирующий все семь ферментативных действий, описанные в De Novo
в Apicomplexa
в Apicomplexa	Биосинтез 7,8-дигидрофолат (рис 18.3). От
	Биосинтез 7,8-дигидрофолат (рис 18.3). От
Основные предшественники для синтеза De Novo из	контраст, анализ генома указывает на то, что культуры C.parvum
фолатов являются пара-аминобензойной кислоты и гуанозин	отсутствует какой-либо идентифицируемой гена ортолог для фолата

пиримидинов

493

биосинтетические ферменты, и по-видимому, зависит от-лор фолата спасения, чтобы получить 7,8-дигидрофолат для цикла тимидилата (рисунок 18.3) (Абрахамсно и др., 2004;. Striepen и др, 2004).

П. фальципарум, Культуры C.parvum, и T. гондий обладают генными ортологами для предполагаемого фолата транспортеров, указывая, что эти паразиты имеют потенциал, чтобы спасти фолат от хоста (Striepen и др., 2004; Chaudhary, 2005). Оба спасательного пути к пара-аминобензойной кислоты и синтеза De Novo 7,8-дигидрофолатредуктазы от GTP и пара-аминобензойной кислоты являются функциональными в P. малярийного потому, что меченные предшественники включены в конечные продукты (Wang и др., 2004а). Функциональные данные о фолате спасании в Т. гондиях и культуре C.parvum не доступны. Кроме того, чтобы спасти от хоста, второй путь к пара-аминобензойной кислоты существует в виде продукта шикимата пути через choris-мат. В то время как культуры C.parvum не обладает ни один из генов, участвующих в этом пути, Т. гондий и П. фальципарум кодирует некоторые из ферментов этого пути (рис 18.3) (Roberts и др., 1998; МакКонки и др., 2004).

18.3.4.2 антифолата химиотерапия и сопротивление антифолата

В течение нескольких десятилетий, антифолатов, такие как пириметамин (PYR) и прогуанил (PG), которые нацелены на DHFR и утилизацию фолиевой кислоты, а также серосодержащие препараты, которые нацелены на dihydropteroate-синтазы (ДГП), были в клиническом применении для лечения P. малярийного и T . гондий инфекция (Рисунок 18.3) (Брукс и др, 1987;. Грегсон и Plowe, 2005). В то время как люди зависят от монофункциональной дигидрофолатредуктазы (DHFR) для ДНК-реплика-ции, в Apicomplexa активность DHFR присутствует на бифункциональном полипептид с активностью TS (DHFR-TS) (Bzik и др., 1987). Серосодержащие препараты целевого ДГП, который представляет собой монофункциональный фермент в организме человека, но также является бифункциональным ферментом в Т. гондии и П. малярийного с hydroxymethylpterin пирофосфокиназы активности (Триглией и скотопромышленником, 1994;. Пашл и др, 1997).

Мутации в П. трехдневный DHPS были Corre-ведены с устойчивостью к сульфаниламидным препаратам (Триглия и др., 1998; Wang и др, 2004b.). Генетические исследования

Документально подтверждено, что различные мутации в DHPS коррелируют с устойчивостью к сульфаниламидным препаратам в естественных условиях (Триглия и др., 1998).

Устойчивость к антифолатам, которые нацелены на DHFR быстро возникла в П. малярийного. Текущий антифолат терапия основана на синергизме, достигнутом в комбинированной терапии ингибитора DHFR в сочетании с сульфаниламидными препаратами (Грегсоном и Plowe, 2005). Современное лечение инфекции Т. гондий использует ту же стратегию с использованием PYR и сульфадиазина. В то время как Т. гондий не развилась устойчивость к antifo-ЛАТЕС, длительное применение этой терапии для лечения Тохо-plasmosis у больных СПИДом, оказалось трудным из-за значительных неблагоприятных клинических реакций (Haverkos, 1987;. Leport и др, 1988 ).

Антифолаты также под следствием как POTEN-TiAl ингибиторов культуры C.parvum (Anderson, 2005). Однако, геномные данные культуры C.parvum указывают на наличие гена TK, которые могли бы обойти inhibi Тион по антифолаты, если ТЗ деятельность physiologi-чески актуальной. Атипичный присутствие гена TK в культурах C.parvum, а также отсутствие гену ДГП, мишень серосодержащих соединений, позволяет предположить, что непосредственно ориентацию культуры C.parvum DHFR для ингибирования репликации может быть трудной целью (Striepen и др., 2004).

Антифолатом сопротивление П. фальципарум и культура C.parvum В начале работы, мутация DHFR в бифункциональном DHFR-TS было идентифицировано в качестве основы устойчивости к PYR в P. малярийного (Inselburg и др., 1987, 1988). В лабораторных изолятов, дублирование генов и CHRO-mosomal изменения также сообщалось как механизм устойчивости к PYR (Inselburg и соавт, 1987;.. Танака и др, 1990a, 1990b). Ранние исследования сопротивления PYR в изолят P. тропических идентификаторов-Fied мутаций в ключевых аминокислотных остатках (кодоны 51, 59 и 108), которые были связаны с устойчивостью высокого уровня для PYR (скотопромышленник и соавт, 1988;. Inselburg и др аль, 1988;.. Петерсон и др, 1988). Кристалл струк-ры дикого типа и мутанта P. фальципарум DHFR-TS предполагает, что эти ключевые мутации устойчивости вызывают стерических взаимодействий с ингибиторами или ослабляют связывание ингибиторов в активном сайте (Yuvaniyama и др., 2003).

494 СРАВНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ нуклеотидных и аминокислотного метаболизма в токсоплазма

Кристаллическая структура Cryptosporidium Hominis DHFR-TS недавно была определена (О'Неила и др., 2003a, 2003b), и раскрыли некоторые новые знания о естественной резистентности культуры C.parvum DHFR к антифолатам (Васкес и др., 1996) , Так как никакого тока генетическая модели выбора не доступна для культуры C.parvum, выявление сильных ингибиторов культуры C.parvum DHFR или ТЗА может быть полезным подходом для определения наиболее поддающимися целей для блокирования DTMP accumu-ляционного и репликации ДНК в parvum инфекции C. ,

Антифолатом сопротивление Т. гондий Сопротивление пириметамин не часто наблюдается при клиническом лечении токсоплазмоза. Даже сопротивление низкого уровня, чтобы PYR было трудно выбрать под давлением наркотиков в пробирке, но было продемонстрировано в генетической модели прямого мутагенеза плазмиды переносимых Т. гондии DHFR-TS с последующей трансфекцией Pyr-чувствительной Т. гондия и выбор роста при PYR в пробирке (Рейнольдс и др., 2001). (. Bzik и др, 1987) Путем моделирования мутаций устойчивости к P. фальципарум в кодонах, эквивалентных 59 и 108, на высоком уровне PYR сопротивление было получено в T.gondii, DHFR-TS (Donald и Roos, 1993; Roos, 1993). Плазмиды, придающие высокого уровня PYR сопротивление Т. гондий были полезны в генетической рассечения эволюции и механизмов, связанных с PYR и cycloguanil сопротивления (Reynolds и Roos, 1998). Этот подход был адаптирован для изучения эволюционной приспособленности DHFR-TS мутаций, ассоциированных с резистентностью PYR. Это исследование показало, тонкие, но потенциально значимым, воздействие на приспособленность мутантных ферментов DHFR-TS в пробирке, которые, как представляется, связаны с естественным внешним видом, или неявки, этих мутантов в естественных условиях (Fohl и Руса, 2003).

Моделирование исследование T.gondii, DHFR-TS предположило, что длинный домен линкера подключения к DHFR TS доменов в Apicomplexa жертвует спираль, которая пересекает ко второй области DHFR из гомодимер комплекса и контактирует с внешней оболочкой активного сайта DHFR (O» Нил и др, 2003b;.. Belperron и др, 2004). Генетические исследования Т. гондий DHFR-TS показали, что различные мутации в пределах домена линкер сопротивления инактивированной пириметамин и ферментативной активности в пробирке и в естественных условиях (Belperron и др., 2004).

АМИНОКИСЛОТ

Аминокислоты играют важную роль в различных областях паразит обмена веществ, и являются необходимыми предшественниками для синтеза нуклеотидов. L-аспартат имеет важное значение для синтеза АМФ из ИМФ в Т. гондий и П. малярийного (Фигуры 18.1A, 18.1C), а также аминокислоты L-глутамин и L-аспартат являются важными для молекулы-предшественники де Novo пиримидинового синтеза УМП в Т. гондий и П. малярийного (рис 18.2). В Apicomplexa, серин также необходим для синтеза DTMP во время тимидилата цикла (рис 18.3). В этом разделе кратко рассмотрим приобретение аминокислот в Apicomplexa. Другие обзоры аминой-кислота Metab-olism в простейших можно найти в предыдущих текстах (Гаттеридж и Кумбс, 1979; Северное и Локвуд, 1995).

ВВЕДЕНИЕ

Токсоплазма. Модельные Apicomplexan-перспективы и методы, под редакцией Weiss & Kim

ISBN-13: 978-0-12-369542-0

ISBN-10: 0-12-369542-2

Все права воспроизведения в любой форме зарезервированы.

466 СРАВНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ нуклеотидных и аминокислотного метаболизма в токсоплазма

Пуринов

пуринов

467

Захват и транспорт

18.2.1.1 Геном Анализ пуриновых транспортеров в Apicomplexa

Недавние исследования показали, что TgAT1, TgNT1 и TgNT3 выражаются в тахизоитами,

468 СРАВНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ нуклеотидных и аминокислотного метаболизма в токсоплазма

18.2.1.2 Ранней модель приобретения пуринов в Т. гондий

18.2.1.3 Функциональные свойства пуриновых транспортеров в Apicomplexa

пуринов

469

полная потеря всех аденозин транспортной функции во внеклеточных тахизоитах (Чанг и др., 1999).

П. фальципарум выражает 11 трансмембранного лор семьи нуклеозида транспортера

пуринов транспорт в клетку-хозяина паразитами

П. фальципарум-паразиты эритроциты имеют замечательные изменения в транспортных функциях по сравнению с нормальным эритроцитом (Кирк и соавт, 1994;. Геро и др., 2003). Нуклеозиды ввести пар-sitized эритроцитов через, по меньшей мере, три паразит-индуцированные путей проникновения, в том числе насыщающейся высокого сродство аденозина транспортной системы (Upston и Геро, 1995), через сеть tubulovesicular мембраны (ТВМ), соединяющий пар-sitophorous вакуоль в эритроцит периферия (Лауэр и др., 1997), а также через не насыщаемый, анион-селективный тип канал, который также имеет CAPAC-ность транспортировать L-нуклеозиды, аминокислоты, сахар, и катионы (Кирк и др., 1994) , П.

Способность эритроцитов селективно зараженных для транспортировки L-нуклеозиды недавно был использован для элегантно доставки терапевтических агентов к intracellu-LAR P. фальципарум паразитов, избирательно убивать их (Геро и др., 2003). Конъюгирование 5-фторуридин с L-аденозина или L-тимидина избирательно доставлен цитотоксической 5-фторуридина к внутриклеточному P. Falci-parum, в то время как эти гибридные молекулы, не показали транспорта или цитотоксичности в клетках млекопитающих. Неизвестно, являются ли новые транспортные функции

470 СРАВНИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ нуклеотидных и аминокислотного метаболизма в токсоплазма

из паразитировали эритроцит обусловлена modifica Тион или включение новых транспортеров, Chan-NELS, протоков, или TVM вблизи эритроцит периферии.

В то время как клетки млекопитающих, не имеют какой-либо способности транспортировать аденозина у млекопитающих ингибитор транспортера 6-thiobenzylthioinosine (NBMPR), Т. гондий-зараженные клетки-хозяева избирательно транспортировать NBMPR (Al Safarjalani и др., 2003). NBMPR селективно цито-токсичен по отношению к внутриклеточным Т. гондий (El Kouni и др., 1999). Активация NBMPR цитотоксичности связана со способностью Т. гондиями, полученными из экстрактов ферментов, но не пройдет-клетки, полученная экстракт фермента, чтобы фос-phorylate NBMPR его нуклеозид-'-monophos-Фейт. Аденозин-киназа (АК) с дефицитом Т. гондии не фосфорилируют NBMPR его нуклеозид-'монофосфата, показывая АК быть основным путем селективного включения и цитотоксичности (Al Safarjalani и соавт, 2003;.. Раис и др, 2005).

Подобно П. фальципарум-паразитировали эритроцитов,

T. гондий-parasitized клетки-хозяева также избирательно транспортировать без физиологическоеβ-L-энантиомера пуриновых нуклеозидов, β-L-аденозина, β-L-дезоксиаденозин и β-L-гуанозин. Неинфицированные клетки-хозяева не перевозят NBMPR или томуβ-L-нуклеозидов. NBMPR также ингибирует транспортную функцию хост-узла-клеточного нуклеозида транспортера ent1 (ов) (Gupte и др., 2005). дипиридамол,

другой ингибитор нуклеозида транспорта, inhib-ITED транспорт из NBMPR и β-L-нуклеозидов в

паразитирует клетки-хозяева. Транспорт NBMPR иβ-L-нуклеозиды в клетке-хозяине паразитов требуется функциональный TgAT1 транспортер (Чанг и др, 1999;.. Аль Safarjalani и др, 2003). В то время как эти наблюдения объясняют потребность в транспорте во внутриклеточное тахизоит из пара-sitophorous вакуолей пространства, эти исследования конкретно не рассматривается, почему Т. гондий-паразитируют клетка-хозяин избирательно транспортирует эти соединения. Таким образом, инфекция с T. гондий дает паразитные специфические механизмы переноса в клетку-хозяина.

Новый транспортный потенциал зараженных клеток-хозяев открывает новые возможности на пути разработки химиотерапевтических подходов, а также адрес-ки других биологических модификаций паразитами хозяина. Новые транспортные механизмы, характерные для Т. гондий-паразитировал клетки-хозяина, может повлечь за собой NUMER-OUs возможности, в том числе недавно сообщили

equilibratory с высоким сродством аденозин транспортер (де Конинг и др., 2003), A концентрирующим ионно-зависит-лор канал, tubulovesicular мембранной системы (ТВМ), соединяющая паразитофорную вакуоль на клетки-хозяина периферию, и канал для транспортировки макромолекул, что обходит мембрану хост-клеток (Геро и др., 2003).

Элегантный электрофизиологическое описание механизма формирования паразитофорной вакуолей в T.gondii, предположил, что, после того, как Inva-сионной и вакуолей формирования Т. гондий, поры деления остаток остается на поверхности хост-клеток (Süß-Toby и соавт. , 1996). Вскоре после вторжения в клетках-хозяина, A белкова и мембранная богатые intravacuolar сеть, полученная из электронно-плотных гранул образуются в паразитофорных вакуолях пространства (Сиб и др., 1995;. Мерсье и др, 1998, 2002). Трехмерная визуализация Т. гондий в пределах недавно образованных вакуолей показали, волокнистый материал и трубчатую, который соединяет паразитом плазматическую мембрану на внутриклеточных тахизоитов в паразитофорной вакуоли к остатку поры деления на мембране клетки-хозяина плазмы (Schatten и Ris, 2004 ). Коллективно, Эти наблюдения указывают на то, что перенос питательных веществ, таких, как пуринов к тахи- zoite внутри паразитофорной вакуоль может быть облегчено за счет дополнительных механизмов вне простой диффузии питательных веществ внутри принимающей цитозоле клетки через поры предлагаемых в паразитофорной мембраны вакуолей. Дальнейшие исследования необходимы, чтобы назначить функциональные роли для гена ЛОРА ортологов, идентифицированных в Т. гондиях, требование для хоста-клеточных транспортеров, а также потенциальная роль tubulovesicular сети в паразитофорных вакуолях пространства, или понять, другие механизмы, которые способствуют проникновению принимающие пурины к внутриклеточному паразиту.

Пуринов взаимопревращения

Дата: 2019-05-28, просмотров: 211.

12 3 Следующая ⇒