Для осуществления любого биотехнологического процесса необхо­димы:

^ культура микроорганизмов;

^ питательная среда;

^ аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций;

^ средства контроля и управления.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные ха­рактеристики производства биопрепаратов. На стадии культивирования осуществляется накопление как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микро­организмов.

Иногда, например, при производстве бактериальных препаратов, целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продук­ты, синтезируемые клеткой - антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.

В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма, такой способ культиви­рования называют поверхностным.

При твердофазном культивировании клетки растут на поверхности твердой (плотной) среды, содержащей достаточное количество влаги и питательных веществ (чаще всего основу такой среды составляют пшеничные отруби).

При жидкофазном (глубинном) культивировании, микроорганизмы распределяются по всему объекту жидкой питательной среды, а ки­слород поступает к клеткам в результате интенсивной операции пере­мешивания.

Последний способ наиболее широко применяется в настоящее вре­мя в производстве большинства препаратов по следующим причинам:

1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в условиях состояния покоя количество микробов не превышает 1-2 млрд см ^-3, а с применением принудительной аэра­ции урожайность, в зависимости от состава питательной среды, дости­гает 50 - 60 млрд см^-3. Это объясняется тем, что при аэрации практи­чески отсутствует начальная стационарная фаза, и бактерии сразу на­чинают интенсивно размножаться, переходя в логарифмическую фазу.

2. Процесс легко управляем. При глубинном выращивании имеются существенные различия в степени потребления углеродных и азоти­стых веществ. Они интенсивно потребляются при аэрации культураль-ной жидкости, поэтому, чтобы процесс роста и размножения не пре­кращался быстро, нужно в процессе культивирования дополнительно вводить углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста микроорганизмов.

Добавление питательных веществ, особенно углеводных (глюкоза) и биологических стимуляторов усиливает интенсивность размноже­ния, что и приводит к увеличению концентрации микроорганизмов в момент съема их биомассы. Данный способ также позволяет легко корректировать рН среды в процессе культивирования, что очень важ­но для достижения максимальной интенсивности размножения.

3. Максимальная технологичность. Так, поверхностный метод ме­нее технологичен и в промышленных условиях применяется в исклю­чительных случаях, когда нельзя воспользоваться глубинным методом.

Технологический процесс глубинного выращивания микроорга­низмов в реакторах (ферментерах) так же как и при использовании плотных питательных сред, складывается из следующих этапов:

1. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними.

2. Приготовление посевной микробной культуры.

3. Приготовление и стерилизация питательных сред.

4. Подготовка биореактора к посеву.

5. Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль над про­цессом культивирования.

Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций:

> стерилизацию оборудования и коммуникаций;

> приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др. Остановимся на каждом из этапов культивирования.

1.1. ОТБОР ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ И РАБОТА С НИМИ

Эталонные, или референтные, штаммы хранятся и поддерживаются на заданном уровне во ВГНКЙ ветеринарных препаратов. Эти штам­мы, в свою очередь, являются производственными, поскольку на их основе готовятся вакцины. При этом инактивированные вакцины, как правило, готовятся из высоковирулентных штаммов, а живые вакцины - из аттенуированных (ослабленных), авирулентных штаммов.

Наряду с производственными и эталонными штаммами во ВГНКИ хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки каче­ства вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетически однородными популяциями микроорганизмов со стабильными морфо­логическими, специфическими и биологическими свойствами. Основ­ными требованиями к этим штаммам являются их высокие антигенные и иммуногенные свойства.

Антигенные свойства штаммов оцениваются по титру антител в сыворотке крови чувствительных животных через определенные сроки после введения им микроорганизмов.

Иммуногенньхе свойства штаммов определяются по устойчиво­сти привитых животных к заражению возбудителем болезни опреде­ленной дозой контрольного (вирулентного) штамма и выражают 50%-ной дозой иммуногенности или по нарастанию титра антител в сыво­ротке крови. При этом 80% привитых животных должны быть невос­приимчивы к инфекции, против которой их вакцинировали.

Безвредность (реактогенность) эталонного, производственного штамма проверяют по выраженности реакции у лабораторных и есте­ственно-восприимчивых животных на 5-10-кратное увеличение приви­вочной дозы.

Производственные, эталонные штаммы, должны сохранять генети­ческую стабильных антигенных, иммуногенных и других присущих им биологических свойств на протяжении 10-20 последовательных пере­севов как in vivo, так и in vitro.

1.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСЕВНОЙ МИКРОБНОЙ КУЛЬТУРЫ

Обычно производственное культивирование микроорганизмов при изготовлении вакцин осуществляют в больших объемах. Поэтому вна­чале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, находяще­гося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ампуле, де­лают посевы в небольшие емкости, например во флаконы емкостью 100-200 см³, заполненные по 50-150 мл производственной средой. За­тем из флаконов делают высевы в большие емкости - бутыли объемом 18-20 литров.

При хорошем накоплении микроорганизмов такую культуру вно­сят в реактор и называют посевной (матрацной, матровой, маточной). При этом нужно предварительно рассчитать необходимое количество посевной культуры для производственного культивирования микроор­ганизмов, исходя из посевной дозы, которая обычно составляет от 1 до 10 % по объему. Посевные микробные культуры также контролиру­ются на сохранение ими типичных морфологических, культурально-биохимических, антигенных и иммуногенных свойств и отсутствие в них посторонней микрофлоры (ПМФ).

1.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

  Одним из этапов получения биопрепаратов является культивирова­ние микроорганизмов, которое невозможно без достаточного количе­ства разнообразных стандартных, эффективных и недорогих питатель­ных сред (ПС).

  В этой связи представляется целесообразным рассмотреть основ­ные принципы, лежащие в основе конструирования ПС, к которым относятся:

  - удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов;

  - выбор сырьевых источников для конструирования ПС;

  - дифференциация ПС по целевому назначению;

      - оптимизация ПС;

    - стандартизация ПС.

Удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов

Основополагающим принципом конструирования ПС является полноценность, т.е. состав среды должен удовлетворять питательным потребностям культивируемых микроорганизмов.

В процессе роста микроорганизмы потребляют из окружающей их питательной среды целый ряд разнообразных химических веществ, составляющих основу энергетического и конструктивного обмена в клетках.

Поступление питательных веществ в цитоплазму может осуществ­ляться через всю поверхность клетки и связано с их диффузией, а так­же с действием специальных транспортных систем. Причем необходи­мые для роста и жизнедеятельности клетки элементы должны нахо­диться в определенной, легкоусваиваемой форме.

К основным компонентам, формирующим клеточное вещество, от­носятся: углерод, азот, кислород и водород. Содержание этих элемен­тов в различных микроорганизмах практически постоянно.

Синтетические возможности микроорганизмов и способы получе­ния ими энергии разнообразны, следовательно, и очень индивидуаль­ны их потребности в источниках питания.

Отсюда ясно, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов и клеток не существует.

Разнообразие микроорганизмов проявляется, прежде всего, в отно­шении к источникам углерода и азота. Эти элементы представлены в средах различными веществами, и именно они определяют специфич­ность сред.

В зависимости от формы, в которой микроорганизмы используют необходимые им питательные вещества, их подразделяют на две большие группы:

1. Автотрофы — микроорганизмы, которые могут синтезировать вещества своей протоплазмы из простых неорганических соединений. Например, они ассимилируют углерод из углекислоты воздуха, азот из аммиака.

2. Гетеротрофы - микроорганизмы, для которых источником угле­рода и азота служат органические вещества. Они усваивают органиче­ские углеродсодержащие соединения: углеводы, органические кисло­ты, спирты и углеводороды. Наиболее доступные из источников угле­родного питания-углеводы, такие как глюкоза, сахароза или мальтоза.

В зависимости от типов используемых азотистых соединений мик­роорганизмы разделяют на две группы:

1. Протеолитические, расщепляющие высокомолекулярные белко­вые вещества и пептиды;

2. Дезаминирующие, требующие присутствия в среде готовых ами­нокислот, расщепление которых сопровождается выделением аммиака.

Очень часто микроорганизмы и клетки нуждаются во многих при­родных аминокислотах, которые являются универсальными компонен­тами питания. Они целиком включаются в структуру клетки.

Из всех незаменимых аминокислот ключевая роль принадлежит глутамину, а также аргинину, который имеет принципиальное значе­ние для обезвреживания токсичных метаболитов незаменимых амино­кислот и аммиака.

Неорганические соли, входящие в состав ПС, удовлетворяют по­требности микроорганизмов в ионах К⁺, Mg²⁺, Мп²⁺ , Fe²⁺ или Fe³⁺, Р0₄^3-, S0₄^2-. Они же определяют необходимое осмотическое давление среды, величину рН и буферную емкость.

В ПС необходимо также наличие некоторых других ионов, в част­ности, Zn²⁺ Cu²⁺ , Co²⁺ ,Ca²⁺, СL^- и др. Обычно они присутствуют в дос­таточном количестве в виде примесей в питательных основах, мине­ральных компонентах среды или содержатся в водопроводной воде, используемой для приготовления ПС.

Функция необходимых микроорганизмам и клеткам ионов метал­лов заключается в том, что они служат активаторами и кофакторами

многих ферментов, кроме того, участвуют в регуляции синтеза белка, являются компонентами белковых комплексов.

Считается также, что в ПС должны присутствовать факторы роста, различные по химической природе соединения, главным образом, ор­ганические вещества (витамины, аминокислоты, жирные кислоты, пу-риновые и пиримидиновые основания), добавление которых в очень незначительных количествах стимулирует рост и размножение микро­организмов.

К факторам роста относят витамины группы В, гемин (фактор X), путресцин, олеиновую кислоту, козимазу (фактор Y) и ее ферменты, пуриновые основания (аденин, гуанин, ксантин, гипоксантин) и пири­мидиновые (цитозин, тиамин, урацил), гормоны и др.

Функции факторов роста разнообразны. Они участвуют в процес­сах обмена веществ. Отсутствие или недостаток их в среде приводит к бактериостатическому эффекту.

Выбор сырьевых источников для конструирования питательных сред

Другим наиболее важным принципом конструирования ПС являет­ся выбор сырьевых источников.

Качество ПС во многом определяется полноценностью состава пи­тательных субстратов и исходного сырья, используемого для их при­готовления. Большое разнообразие видов сырьевых источников ставит сложную задачу выбора наиболее перспективных, пригодных для кон­струирования ПС требуемого качества. Определяющую роль в данном вопросе играют, прежде всего, биохимические показатели состава сы­рья, от которых зависит выбор способа и режимов его переработки с целью наиболее полного и эффективного использования содержащих­ся в нем питательных веществ.

Для получения ПС с особо ценными свойствами применяют прежде всего традиционные источники белка животного происхождения, а именно мясо крупного рогатого скота (КРС), казеин, рыбу и продукты ее переработки. Наиболее полно разработаны и широко применяются ПС на основе мяса КРС.

Учитывая дефицит кильки каспийской, широко применяемой в не­далеком прошлом, для получения рыбных питательных основ стала использоваться более дешевая и доступная непищевая продукция рыб­ной промышленности - сухой криль, отходы переработки мяса криля, филетированный минтай и его перезрелую икру. Наибольшее же рас­пространение получила рыбная кормовая мука (РКМ), удовлетворяю­щая требованиям биологической ценности, доступности и относитель­ной стандартности.

Довольно широкое распространение получили ПС на основе казеи­на, который содержит все компоненты, имеющиеся в молоке: жир, лак­тозу, витамины, ферменты и соли. Однако необходимо отметить, что в связи с удорожанием продуктов переработки молока, а также повыше­нием спроса на казеин на мировом рынке, применение его носит не­сколько ограниченный характер.

Из непищевых источников белка животного происхождения в каче­стве сырья для конструирования полноценных ПС необходимо выде­лить кровь убойных животных, которая богата биологически активны­ми веществами и микроэлементами и, кроме того, содержит продукты клеточного и тканевого обмена. Гидролизаты крови сельскохозяйст­венных животных используются в качестве заменителей пептона в дифференциально-диагностических питательных средах.

К другим видам белоксодержащего сырья животного происхожде­ния, которые могут быть использованы для конструирования ПС, от­носятся: плацента и селезенка КРС, сухой белковый концентрат - про­дукт переработки мясных отходов, спилковая обрезь, получаемая при обработке кожи, эмбрионы домашних птиц - отход вакцинного произ­водства, кровезаменители с истекшим сроком годности, творожная сыворотка, мягкие ткани моллюсков и ластоногих.

Перспективно использование тушек пушных зверей из зверо-хозяйств, крови КРС, получаемой на мясокомбинате, обезжиренного молока и молочной сыворотки (отходы маслозаводов).

В целом же ПС, приготовленные из сырья животного происхожде­ния, имеют высокое содержание основных питательных компонентов, являются полноценными и сбалансированными по аминокислотному составу и достаточно хорошо изучены.

Из продуктов растительного происхождения в качестве белкового субстрата для ПС возможно использование кукурузы, сои, гороха, кар­тофеля, люпина и др. Однако, растительное сельскохозяйственное сы­рье содержит белок, несбалансированный состав которого зависит от условий выращивания культур, а также липиды в больших количест­вах, чем продукты животного происхождения.

Обширную группу составляют ПС, изготавливаемые из белкового сырья микробного происхождения (дрожжи, бактерии и т.д.). Амино­кислотный состав микроорганизмов, служащих субстратом для приготовления ПС, хорошо изучен, а биомасса используемых микроорга­низмов является полноценной по составу питательных веществ и ха­рактеризуется повышенным содержанием лизина и треонина.

Разработан целый ряд ПС комбинированного состава из белковых субстратов различного происхождения. К ним относятся дрожжевая казеиновая питательная среда, дрожжевая мясная и т.д.

Основой большинства известных ПС являются гидролизаты казеи­на, мяса КРС и рыбы (до 80%). Удельный же вес непищевого сырья в технологии конструирования ПС составляет всего 15% и в дальней­шем требует увеличения.

Используемое для получения питательной основы (ПС) непищевое сырье должно удовлетворять определенным требованиям, а именно быть:

^ полноценным (количественный и качественный состав сырья должен, в основном, удовлетворять питательным потребностям микро­организмов и клеток, для которых разрабатываются ПС);

^ доступным (иметь достаточно обширную сырьевую базу);

^ технологичным (затраты на внедрение в производство должны осуществляться с использованием имеющегося оборудования или су­ществующей технологии);

^ экономичным (затраты на внедрение технологии при переходе на новое сырье и его переработку не должны превосходить нормы за­трат для получения целевого продукта);

^ стандартным (иметь длительные сроки хранения без изменения физико-химических свойств и питательной ценности).