Высоко объективным является и метод балансировки состава ПС, в основу которого заложено использование уравнения ассимиляции микробной популяции, где учитываются такие показатели:

> концентрация потребляемого субстрата;

> время потребления;

> концентрация биомассы;

> коэффициент метаболизма;

> константы скорости образования и отмирания микроорганизмов;

> концентрация субстрата в начальный момент культивирования.

Обычно при периодическом процессе культивирования большинст­во важных параметров, в том числе и концентрация питательных ве­ществ в культуральной жидкости, изменяется в течение времени. Вме­сте с тем, профили их изменения не всегда близки к оптимальным. Поэтому при подборе ПС для периодического культивирования возни­кает противоречие между необходимостью внесения в нее достаточно большого количества субстратов и ингибирующим влиянием высоких концентраций одного или нескольких элементов питания на рост мик­робной клетки и(или) биосинтез целевого продукта. Снижение кон­центрации таких субстратов в исходной ПС с последующим их добав­лением в ферментер, по определенной программе, позволяет исклю­чить ингибирование процесса в начальной фазе роста и в то же время не допустить его лимитирования в последующий период размножения микробов.

Стандартизация питательных сред

Кроме оптимизированного состава, питательные среды, используе­мые в микробиологической практике для выполнения различных экс­периментальных работ, а также для выпуска стабильных по своим свойствам биопрепаратов, должны быть стандартны.

Под стандартностью ПС принято понимать постоянство их состава по биохимическим показателям: аминокислотному, минеральному, жирнокислотному, углеводному составам, а также содержанию вита­минов, углеводородов, антибиотиков и др. компонентов.

Многогранность и сложность проблемы стандартизации обуславли­вают необходимость использования комплексного подхода к решению данных задач, который предусматривает не только разработку требова­ний к качеству сырья, материалов, полуфабрикатов, унификацию тех­нологии оснастки оборудования, но также и разработку совокупности мероприятий, методов и средств, направленных на установление, обеспечение и поддержание необходимого уровня качества препарата на всех стадиях его изготовления и применения.

Большое значение для получения более стандартных ПС имеют разработки на использование в их производстве сухих питательных основ, готовых сухих ПС промышленного изготовления и сухих вита­минсодержащих добавок.

Примером может служить технология изготовления сухого фермен­тативного гидролизата казеина неглубокой степени расщепления, ко­торый широко используется при конструировании многих ПС, а также сухой экстракт кормовых дрожжей.

Работы, направленные на повышение стандартности ПС, могут приводить к их удорожанию, но это считается оправданным, т.к. при­менение разнокачественных сред может приводить к срыву еще более дорогостоящего эксперимента, к появлению брака и к получению не­сопоставимых результатов.

Создание и развитие системы оценки стандартности состава и свойств ПС, оценка воспроизводимости технологии их приготовления являются как одними из основных принципов конструирования ПС, так и передовыми задачами развития микробиологии на современном этапе.

1.4. ПОДГОТОВКА БИОРЕАКТОРА К ПОСЕВУ

Современные биореакторы изготавливаются из нержавеющей стали и представляют собой довольно сложный аппарат, в который осущест­вляют закачку соответствующей для культивируемого микроба пита­тельной cреды.

Реактор имеет рубашку для нагревания паром и охлаждения водой с соответствующей запорной фурнитурой. Внутри реактора имеется турбинная механическая или электромагнитная мешалка со скоростью 150-200 об/мин и трубка для подачи воздуха. На крышке реактора имеются отверстия для подающей и отводящей трубок, смотровое ок­но, окно для освещения и отверстие для вставления четырёх сифонов, служащих для внесения посевного материала, взятия проб, внесения пеногасителя, глюкозы и других питательных веществ, а при необхо­димости и факторов роста. Современные реакторы оснащены различ­ными измерительными приборами.

Регулирование температуры осуществляется автоматически. Реги­страция её, а также измерения рН осуществляется с помощью элек­тронного потенциометра.

При первичной установке реакторов в цехах и при их последующей эксплуатации важной инженерно-технической проблемой является технологическая обвязка биореакторов трубопроводами. К комплексу наиболее важных проблем технологической обвязки относятся:

1. Стерилизация внутренней полости реактора текучим паром.

2. Подача стерильного воздуха во внутреннюю полость реактора при культивировании, либо при удалении готового продукта из неё на последующую обработку.

Решение этих проблем позволяет получать более стабильные ре­зультаты по стерильности и накоплению микробной массы при реак­торном способе культивирования микроорганизмов.

1.5. ВЫРАЩИВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В РЕАКТОРЕ И КОНТРОЛЬ ЗА ПРОЦЕССОМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Рассмотрим примеры особенностей культивирования некоторых микроорганизмов с применением:

1. Активной аэрации микробных культур.

2. В покоящемся состоянии без применения механических меша­лок (без аэрации).

3. В состоянии анаэробиоза.

Промышленное культивирование микроорганизмов с применением активной аэрации

Процесс осуществляют в реакторах объёмом от 0,01 до 100 м³, как правило, в асептических условиях. Пустой аппарат тщательно моют, проверяют герметичность стерильность и стерилизуют острым паром. Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор пода­ют простерилизованную в УНСи охлажденную до 25-35°С питатель­ную среду, вносят посевной материал в количестве 5-10% объёма пи­тательной среды (0,2-0,4 млрд. живых микробных клеток в 1 мл по оптической концентрации), включают систему аэрации и перемеши­вающее устройство. Так, например, для листерий и сальмонелл ско­рость вращения механической мешалки составляет 150-180 об/мин, а культура микробов аэрируется подогретым до 37°С очищенным, сте­рильным воздухом с коэффициентом подачи 1,5 л воздуха на 1 л среды в одну минуту. Коэффициент заполнения реактора обычно 0,5-0,8.

Превышение этой величины может привести к значительному уносу пены с отходящим воздухом и нарушению асептических условий.

Температуру культивирования поддерживают путём подачи охла­ждающей воды в рубашку и другие теплообменные устройства аппа­рата.

Оптимальная температура для разных микроорганизмов различна, обычно от 25 до 37°С.

Для регулирования рН культуральной жидкости в ходе культиви­рования добавляют соответствующие титрующие агенты (щёлочи, ки­слоты, раствор аммиака и др.). Продолжительность выращивания мик­роорганизмов в культиваторе 18-24 ч, спорообразующих - 40-48 ч и 200-250 ч - для актиномицетов и микроскопических грибов.

Процесс культивирования контролируют по показателям приборов - изменение температуры, рН, расход воздуха, частота вращения ме­шалки, а также путём периодического отбора проб (через 1-12 ч в зависимости от длительности процесса).

В отобранных пробах определяют содержание углеводов, общего и аммонийного азота, фосфора, биомассы, целевого продукта метабо­лизма, морфологию микробных клеток, наличие посторонней микро­флоры.

Технология культивирования микроорганизмов в покоящемся состоянии без аэрации

Некоторые микроорганизмы относятся к группе микроаэрофильных (возбудители бруцеллёза, лептоспироза, кампилобактериоза и др.), которые не требуют принудительной аэрации питательной среды, в которой они выращиваются.

Применяют баллонный и реакторный способы культивирования.

Баллонный способ, в частности для культивирования лептоспир, заключается в том, что микробные культуры лептоспир каждого серо­логического варианта выращиваются в 16-литровых стеклянных бал­лонах с 10-12 л сывороточной или альбуминно-сывороточной (произ­водственной) средами при температуре 27-28°С в течение 5-7 суток.

При реакторном способе культивирование проводят в ферментерах, которые могут быть объединены в единую технологическую цепочку. Так, на Ставропольской биофабрике при культивировании лептоспир было смонтировано 54 реактора объёмом от 250 до 5000 л.

Технология промышленного культивирования анаэробных микроорганизмов

К анаэробным микроорганизмам относятся такие, которые способ­ны жить и размножаться при отсутствии атмосферного кислорода.

В силу биологических особенностей анаэробов методы культиви­рования их в промышленности имеют свои особенности.

1. При культивировании анаэробных микроорганизмов нужно в реакторах создать условия полного вытеснения из питательной среды свободного кислорода. Это достигается путём заполнения анаэро(бо)статов газовой смесью водорода и двуокиси углерода, а оста­точный кислород может быть удалён путём каталитического связыва­ния с воздухом.

Анаэробные условия могут быть достигнуты также добавлением в среду восстанавливающих агентов, таких как цистина и сульфида на­трия, аскорбиновой кислоты.

2. Степень анаэробиоза определяется окислительно-восстанови­тельным потенциалом (Eh). Для этих целей в среду вводят окисли­тельно-восстановительные индикаторы, чаще всего используют резазурин (диазорезоурин)-10^-4 ч л ^-1, меняющий цвет от сине-розового до бесцветного. Бесцветное состояние достигается при Eh около 100 мВ и указывает на наличие анаэробных условий.

3. При культивировании анаэробов необходимо постоянно коррек­тировать рН среды, поддерживая её в пределах 7,2-7,8. В процессе роста анаэробов рН среды очень быстро снижается в кислую сторону, что приводит к ингибированию их роста.

1.6. ПЕРИОДИЧЕСКИЕ И ХЕМОСТАТНЫЕ СИСТЕМЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

При глубинном выращивании микроорганизмов их культуры могут находиться в периодических, или "закрытых", и хемостатных (непре­рывных) - "открытых" системах.

Закрытой называют такую систему (культуру), когда хотя бы один из компонентов питательной среды или она вся не может ни поступать в систему, ни покидать её. В такой системе скорость роста микроорга­низмов должна после ускорения стремиться к нулю из-за недостатка субстрата или из-за гибели микробных клеток вследствие накопления продуктов метаболизма. Следовательно, периодические культуры микроорганизмов находятся в неустойчивом состоянии.

Открытая (хемостатная) система - это система, когда все питатель­ные компоненты могут поступать в реактор, в котором выращивается тот или иной микроорганизм, и удаляться из реактора в виде продук­тов синтеза микроорганизмов (антибиотики, витамины, ферменты и т.д.) или биомасса самих микроорганизмов. При этом скорость посту­пления питательной среды в реактор и удаление из него продуктов синтеза или биомассы можно регулировать в нужной нам среде раз­множения микроорганизмов.