Поможем в ✍️ написании учебной работы

Имя

Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой

Выберите тип работыЧасть дипломаДипломная работаКурсовая работаКонтрольная работаРешение задачРефератНаучно - исследовательская работаОтчет по практикеОтветы на билетыТест/экзамен onlineМонографияЭссеДокладКомпьютерный набор текстаКомпьютерный чертежРецензияПереводРепетиторБизнес-планКонспектыПроверка качестваЭкзамен на сайтеАспирантский рефератМагистерская работаНаучная статьяНаучный трудТехническая редакция текстаЧертеж от рукиДиаграммы, таблицыПрезентация к защитеТезисный планРечь к дипломуДоработка заказа клиентаОтзыв на дипломПубликация статьи в ВАКПубликация статьи в ScopusДипломная работа MBAПовышение оригинальностиКопирайтингДругое

Нажимая кнопку "Продолжить", я принимаю политику конфиденциальности

УЛЬЯНОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

 

 

ЛЕКЦИИ ПО КУРСУ: БИОТЕХНОЛОГИЯ

ДЛЯ СТУДЕНТОВ ФАКУЛЬТЕТОВ: ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ, БИОТЕХНОЛОГИИ 

 

 

Подготовлен для печати:

д.б.н. Васильевым Д.А.

 к.в.н. Золотухиным С.Н.

д.б.н. Щербаковым А.А.

         к.б.н. Молофеевой Н.И.

 

                                                        

 

                                                     

 

УЛЬЯНОВСК 2005

 

УДК 619 : 616

 

 Д.А. ВАСИЛЬЕВ, С.Н.ЗОЛОТУХИН, А.А.ЩЕРБАКОВ, Н.И. МОЛОФЕЕВА

 

УЧЕБНО – МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ  ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ БИОТЕХНОЛОГИИ

                  

                                    

 

Данное учебное пособие подготовлено: д.б.н. Васильевым Д.А.,

К.б.н. Золотухиным С.Н., д.б.н. Щербаковым А.А., к.б.н. Молофеевой Н.И.

 

Цель издания – восполнить существующий пробел в учебном процессе при изучении материала по лабораторному практикуму курса биотехнология. Некоторые разделы изложены более детально, а по некоторым дан описательный материал, что обусловлено лабораторными возможностями кафедры.

Рекомендовано к изданию кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии ветеринарно – санитарной экспертизы для студентов факультета ветеринарной медицины. Рецензент - ст преподаватель, кбн, Афонин Э.А.

 

 

 

«Б иотехнология знаменует собой еще одну рево­ люцию в науке, которая может изменить жизнь и будущее... людей так же радикально, как это сдела­ ла Промышленная революция два века назад и компьютерная революция в наши дни».

                            из  отчета отдела по оцен­кам новых технологий США за 1987 г.

 

  

Лекция 1 .

ЛЕКЦИЯ 2.

Оптимизация модели

 

 

 

Экспериментальная проверка расчетных концентраций компонентов среды

 

 

 

Получение прописи оптимальной ПС

 

     

 

ЛЕКЦИЯ 3.

ЛЕКЦИЯ 4. ВАКЦИНЫ.

 

Вакцинация способствует формированию у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам и тем самым защищает его от инфекции. В ответ на пероральное или парентеральное введение вакцины в организме хозяина вырабатываются антитела к патогенному микроорганизму, которые при последующей инфекции приводят к его инактивации (нейтрализации или гибели), блокируют его пролиферацию и не позволяют развиться заболеванию.

Эффект вакцинации открыл более 200 лет назад — в 1796 г. — врач Эдвард Дженнер. Он доказал экспериментально, что человек, перенесший коровью оспу, не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, становится невосприимчивым к оспе натуральной. Натуральная оспа - высококонтагиозное заболевание с высокой смертностью: даже если больной не погибает, у него нередко возникают различные уродства, психические расстройства и слепота. Дженнер публично провел прививку коровьей оспы 8-летнему мальчику Джеймсу Фиппсу, использовав для этого экссудат из пустулы больной коровьей оспой, а затем через определенное время дважды инфицировал ребенка гноем из пустулы больного натуральной оспой. Все проявления заболевания ограничились покраснением в месте прививки, исчезнувшим через несколько дней.

Ранее такие инфекционные болезни, как туберкулез, оспа, холера, брюшной тиф, бубонная чума и полиомиелит, были настоящим бичом для человечества. С появлением вакцин, антибиотиков и внедрением мер профилактики эти эпиидемические болезни удалось взять под контроль. Однако защитные меры со временем становились неэффективными, и возникали новые вспышки заболеваний. В 1991 г. эпидемия холеры поразила Перу; в течение трех следующих лет было выявлено примерно 1 млн. заболевших, несколько тысяч из них умерли. К сожалению, против многих болезней человека и животных вакцин не существует. Сегодня во всем мире более 2 млрд. людей страдают заболеваниями, которые можно было бы предотвратить с помощью вакцинации. Вакцины могут оказаться полезными и для профилактики постоянно появляющихся «новых» болезней (например, СПИДа).

Как правило, современные вакцины создают на основе убитых (инактивированных) патогенных микроорганизмов либо живых, но невирулентных (аттенуированных) штаммов. Для этого штамм дикого типа выращивают в культуре, очищают, а затем инактивируют или модифицируют таким образом, чтобы он вызывал иммунный ответ, достаточно эффективный в отношении вирулентного штамма. Несмотря на значительные успехи в создании вакцин против таких заболеваний, как краснуха, дифтерия, коклюш, столбняк, оспа и полиомиелит, производство современных вакцин сталкивается с целым рядом ограничений:

• Не все патогенные микроорганизмы удается культивировать, поэтому для многих заболеваний вакцины не созданы.

• Для получения вирусов животных и человека необходима дорогостоящая культура животных клеток.

• Титр вирусов животных и человека в культуре и скорость их размножения часто бывают очень низкими, что удорожает производство вакцин.

• Необходимо строго соблюдать меры предосторожности, чтобы не допустить инфицирования персонала.

• При нарушении производственного процесса в некоторые партии вакцины могут попасть живые или недостаточно ослабленные вирулентные микроорганизмы, что может привести к неумышленному распространению инфекции.

• Аттенуированные штаммы могут ревертировать к исходному штамму, поэтому необходимо постоянно контролировать вирулентность.

• Некоторые заболевания (например, СПИД) нельзя предупреждать с помощью традиционных вакцин.

• Большинство современных вакцин имеют ограниченный срок годности и сохраняют активность только при пониженной температуре, что затрудняет их использование в развивающихся странах.

В последнее десятилетие, с развитием технологии рекомбинантных ДНК, появилась возможность создать новое поколение вакцин, не обладающих недостатками традиционных вакцин. Для их разработки применяют методы генной инженерии.

• Патогенный микроорганизм модифицируют, делетируя гены, ответственные за вирулентность. Способность вызывать иммунный ответ при этом сохраняется. Такой микроорганизм можно безбоязненно использовать в качестве живой вакцины, поскольку выращивание в чистой культуре исключает возможность спонтанного восстановления целого гена.

• Создают живые непатогенные системы переноса отдельных антигенных детерминант неродственного патогенного организма. Такая система переноса способствует развитию выраженного иммунного ответа на патогенный микроорганизм.

• Если патогенные микроорганизмы не растут в культуре, можно изолировать, клонировать и экспрессировать в альтернативном хозяине (например, в Е. coli или линии клеток млекопитающих) гены тех белков, которые содержат основные антигенные детерминанты, и использовать эти белки как «субъединичные» вакцины (см. следующий раздел).

• Некоторые патогенные микроорганизмы действуют опосредованно, вызывая развитие аутоиммунной реакции на инфицированные клетки организма-хозяина. Для таких заболеваний можно создать систему специфического уничтожения клеток-мишеней, сконструировав ген, кодирующий химерный белок, одна часть которого будет связываться с инфицированной клеткой, а другая - уничтожать ее. Эта система не является истинной вакциной, хотя она и действует только на инфицированные клетки, устраняя саму причину развития аутоиммунной реакции.

К вакцинам для животных предъявляются менее жесткие требования, поэтому первыми вакцинами, полученными с помощью технологии рекомбинантных ДНК, были вакцины против ящура, бешенства, дизентерии и диареи поросят. Создаются и другие вакцины для животных, а в скором времени появятся и рекомбинантные вакцины, предназначенные для человека .

Субъединичные вакцины

Как правило, вакцины содержат неповрежденные патогенные микроорганизмы, но при этом неживые или аттенуированные. Антитела, вырабатываемые в ответ на их введение, связываются с поверхностными белками патогенного организма и запускают иммунный ответ. В связи с этим возникает вопрос: должна ли вакцина содержать целые клетки или лишь какие-то специфические поверхностные компоненты? Что касается вирусов, то, как было показано, для  выработки в организме-хозяине антител в ответ на вирусную инфекцию достаточно очищенных поверхностных белков вируса (белков капсида или внешней оболочки). Вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют «субъединичными»; для их разработки с успехом используется технология рекомбинантных ДНК.

Субъединичные вакцины имеют свои достоинства и недостатки. Достоинства состоят в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызывать нежелательные побочные эффекты в организме-хозяине. Недостатки заключаются в том, что очистка специфического белка стоит дорого, а конформация выделенного белка может отличаться от той, которую он имеет in situ (т. е. в составе вирусного капсида или оболочки), что может приводить к изменению его антигенных свойств. Решение о производстве субъединичной вакцины принимается с учетом всех имеющих отношение к делу биологических и экономических факторов.

 

Аттенуированные вакцины

В некоторых случаях в качестве живых вакцин можно использовать генетически модифицированные (рекомбинантные) микроорганизмы (бактерии или вирусы). Такие вакцины содержат  либо непатогенные микроорганизмы, синтезирующие антигенные детерминанты определенного патогенного агента, либо штаммы патогенных микроорганизмов, у которых модифицированы или делетированы гены вирулентности. В этих случаях основные антигенные детерминанты являются составными компонентами бактерериальных или вирусных частиц и имеют такую же  конформацию, какую они принимают в болезнетворном микроорганизме. Изолированным антиген часто утрачивает исходную конформацию и вызывает лишь слабый иммунный ответ.

Заключение

Традиционные вакцины содержат инактивированные или аттенуированные патогенные микроорганизмы (бактерии или вирусы). Эти вакцины имеют ряд недостатков: не все патогенные микроорганизмы можно вырастить в необходимых для производства вакцины количествах; работа с большим количеством патогенных микроорганизмов требует соблюдения строжайших мер предосторожности; аттенуированные штаммы нередко ревертируют и становятся вирулентными; инактивация часто бывает неполной; срок годности вакцины зависит от условий ее хранения.

Технология рекомбинантных ДНК позволяет создавать надежные вакцины, используя при этом разные подходы. Делетируя гены, ответственные за вирулентность, получают живые вакцины, содержащие непатогенные, иммунологи-чески активные штаммы, которые не могут ревертировать и становиться патогенными. Клонированные гены, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенного организма, встраивают в геном непатогенного носителя (обычно вируса) и получают безопасную, не содержащую болезнетворных микроорганизмов вакцину. Наконец, гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенных микроорганизмов, встраивают в экспрессирующие векторы, получают нужный продукт в большом количестве и используют его как вакцину. Последний подход позволяет производить субъединичные и пептидные вакцины (если используются полноразмерные гены в первом случае и фрагменты генов, кодирующих домены основных антигенных детерминант — во втором). Пептидные вакцины получают и с помощью химического синтеза пептидов.

 

 

ЛЕКЦИЯ 5.

Молекулярная диагностика

Успехи современной медицины и сельского хозяйства часто зависят от того, удается ли обнаруживать специфические вирусы, бактерии, грибы, паразитические микроорганизмы, белки и низкомолекулярные соединения в организме человека или животных, в растениях, воде или почве. Например, профилактику и лечение любого инфекционного заболевания значительно облегчает ранняя и точная идентификация вызвавшего его патогенного микроорганизма. Для проведения многих диагностических процедур необходимо сначала вырастить культуру потенциально патогенного микроорганизма и лишь затем проанализировать спектр его физиологических свойств. Хотя подобные тесты весьма эффективны и обладают достаточно высокой специфичностью, они часто занимают много времени и являются дорогостоящими. Это относится к идентификации и бактерий, и паразитических микроорганизмов (табл.1). Кроме того, весьма ограничена возможность выявления тех патогенных микроорганизмов, которые плохо растут в культуре либо вообще не поддаются культивированию. В качестве примера можно привести облигатных внутриклеточных паразитов Chlamydia trachomatis , которые вызывают хламидиоз, болезнь, передающуюся половым путем и распространенную в Северной Америке и Европе. Хламидиоз трудно диагностировать, поскольку для этого необходима перевиваемая культура клеток. При этом часто получают ложноотрицательные результаты (т. е. ошибочно диагностируют отсутствие микроорганизма), в результате чего не проводится адекватное лечение. Безусловно, если для выявления микроорганизма необходимо выращивать его в культуре, то рутинной может стать идентификация лишь нескольких из всех известных патогенных микроорганизмов. Чтобы устранить это принципиальное ограничение, были разработаны методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК.

Таашца 1. Сравнение некоторых методов диагностики инфекционных заболеваний, вызванных паразитическими микроорганизмами

 

Метод	Преимущества	Недостатки
Mикроскопическое исследование	Простота Прямое выявление паразитических микроорганизмов Возможность разграничения микроорганизмов по морфологическим признакам	Трудоемкость, длительность Низкая чувствительность Невозможность азграничения сходных микроорганизмов Необходимость высокой квалификации для интерпретации результатов
Культивирование in vitro u иммунизация мышей	Обнаружение только жизнеспособных паразитических микроорганизмов Возможность определения вирулентности и инфекционности	Длительность анализа, высокая стоимость.  Разные породы животных дают разные ответы Потеря.жизнеспособности в организме животного Использование животных
Определение антител в сыворотке	Простота, непродолжительность анализа Возможность автоматизации Возможность тестирования большого числа образцов	Не всегда специфичен Невозможность разграничения острой и латентной форм инфекции
Гибридизация и ПЦР	Быстрота, высокие чувствительность и специфичность Прямое обнаружение паразитических микроорганизмов Возможность разграничения разных видов Независимость результатов от предыдущих инфекций Не требуют жизнеспособности паразитов Возможность автоматизации	Высокая стоимость анализов, многоэтапность  Невозможность различить живые и мертвые микроорганизмы Возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов

Любой метод выявления патогенных микроорганизмов должен быть достаточно простым и обладать высокой специфичностью и чувствительностью. Специфичный диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм- или молекулу-мишень, чувствительный — обнаруживать очень малые количества такой мишени даже на фоне других микроорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффективным и недорогим для рутинного применения.

Методы иммунодиагностики

Многие иммунологические системы детекции обладают высокой чувствительностью и специфичностью, являясь в то же время достаточно простыми. Они широко используются для тестирования лекарственных препаратов, оценки мониторинга различных онкологических заболеваний, определения специфических метаболитов, идентификации и контроля патогенных микроорганизмов, но имеют и свои ограничения. Если молекулой-мишенью является белок. то необходимо обеспечить экспрессию детермипирующих его генов и создать условия, в которых не происходит маскирование или блокирование сайта связывания с антителом. Традиционные процедуры диагностики возбудителей инфекции опираются либо на набор характеристик патогенного микроорганизма, либо, что предпочтительнее, на одну уникальную, легко различимую его особенность. Клинические микробиологи пытаются найти тот минимальный набор биологических характеристик, при помощи которого можно будет гарантирование обнаруживать и идентифицировать патогенные микроорганизмы. Например, некоторые возбудители вырабатывают специфические биохимические соединения, которые и необходимо обнаружить в биологическом образце. Часто подобную маркерную молекулу можно выявить непосредственно, проведя высокоспецифичный биохимический анализ. Но такой подход неизбежно приведет к увеличению числа индивидуализированных систем детекции патогенных микроорганизмов. Более предпочтительным был бы универсальный метод, позволяющий выявлять любую маркерную молекулу независимо от ее химической природы. Именно таким является метод, основанный на идентификации комплексов антиген—антитело.

Ферментный иммуносорбентный анализ

 Существует целый ряд подходов, позволяющих определить, произошло ли связывние антитела с антигеном-мишенью. Один из них - это ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), который часто используют для диагностики. Процедура включает следующие этапы.

1. Образец, в котором хотят обнаружить специфическую молекулу или микроорганизм, фиксируют на твердой подложке, например на  пластиковой микротитровальной плашке обычно имеющей 96 лунок.

2. К фиксированному образцу добавляют антитело, специфичное к маркерной молекуле (первое антитело), затем промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы первого антитела .

3. Добавляют второе антитело, которое специфически связывается с первым антителом и не взаимодействует с маркерной молекулой. К этому антителу присоединен фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза или уреаза), катализирующий превращение неокрашенного субстрата в окрашенный продукт. Промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы конъюгата второе антитело—фермент.

4. Добавляют неокрашенный субстрат .

5. Проводят качественное или количественное определение окрашенного продукта.

Если первое антитело не связывается с мишенью образца, то оно удаляется при первом промывании. Поскольку при этом конъюгату второе антитело—фермент не с чем связываться, он удаляется при втором промывании, и образец остается неокрашенным. Если связывание с мишенью происходит, то второе антитело присоединяется к первому, и конъюгированный фермент катализирует образование легко регистрируемого окрашенного продукта.

Основной принцип ELISA — специфическое связывание первого антитела с мишенью. Если молекула-мишень представляет собой белок, то его очищенный препарат обычно используют для получения антител, при помощи которых затем и выявляют данную мишень. Антитела, которые образуются в сыворотке (антисыворотке) крови иммунизированного животного (обычно кролика), связываются с разными антигенными детерминантами (эпитопами) молекулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлональным препаратом. Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для некоторых методов диагностики: 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две сходные мишени, т. е. когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой. Однако эти проблемы вполне разрешимы, поскольку сейчас научились получать препараты антител, выработанных к одной антигенной детерминанте, т. е. препараты моноклональных антител.

Моноклональные антитела

У млекопитающих в ходе эволюции выработался сложный набор клеточных систем, защищающих организм от токсичных веществ и инфекционных агентов. Составной частью защитной реакции является индуцированная выработка клетками лимфатической системы специфических белков (антител), которые соединяются с чужеродными веществами (антигенами) и при помощи других белков иммунной системы, включая системы комплемента, нейтрализуют их эффект. В ответ на иммунологический стимул каждая антителопродуцирующая клетка синтезирует и выделяет единственный вид антител, которые с высоким сродством распознают отдельный участок (эпитоп, антигенную детерминанту) молекулы антигена. Поскольку в молекуле антигена обычно присутствует несколько разных эпитопов, антитела против каждого из них вырабатываются отдельными клетками иммунной системы. Такие антитела, каждое из которых взаимодействует с данным антигеном, называют поликлональными.

Уже в начале нынешнего века, когда о поли клональности антител ничего не знали, было ясно, что их специфичность можно использован для подавления инфекций. Позже антитела стали применять в качестве диагностического инструмента для выявления токсичных соединений в клинических образцах. К сожалению, эффективность препаратов поликлональных антител варьирует от одной партии к другой, поскольку в одних случаях при проведении иммунизации антителопродуцирующие клетки сильнее стимулируются одними детерминантами данного антигена, а в других иммунная система активнее отвечает на другие эпитопы тоге же антигена. Это может влиять на способность разных препаратов нейтрализовать антигены, поскольку отдельные эпитопы обладают разной эффективностью (стимулирующей способностью). Следовательно, в данной партии поликлональных антител может содержаться мало молекул, направленных против основного эпитопа, и в результате она будет менее эффективной, чем предыдущая.

Следовательно, для практического применения антител в качестве диагностического инструмента или компонентов терапевтических средств необходимо было создать такую линию клеток, которая росла бы в культуре и продуцировала антитела одного типа, обладающие высоким сродством к специфическому антигену-мишени, — моноклональные антитела. Подобная клеточная линия могла бы стать неиссякающим источником идентичных молекул антител. К сожалению, В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы виделось в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы  вырабатывать антитела, а приобретя способность к делению от клетки совместимого типа - расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломными) клетками, приобретая способность к росту в культуре и сохраняя в то же время многие свойства В-клеток. Так клетки миеломы, в первую очередь те, которые не вырабатывают антител, стали кандидатами на слияние с антителопродуцирующими В-клетками. В середине 70-х гг. эти идеи стали реальностью.

Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной линии, продуцирующей антитела одного типа, состоит во введении мышам антигена. После ряда иммунизации, проведенных в течение нескольких недель, проверяют, произошло ли развитие у животных иммунного ответа. Если ответ развился, то животных умерщвляют, извлекают селезенку, промывают ее, измельчают и несильно встряхивают для высвобождения единичных клеток, среди которых находятся и антителопродуцирующие В-клетки. Взвесь клеток селезенки смешивают со взвесью миеломных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе (HGPRT^-). Комбинированную взвесь в течение нескольких минут инкубируют в 35%-ном полиэтиленгликоле, а затем переносят в среду, содержащую гипоксангин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ).

Обработка полиэтиленгликолем облегчает слияние клеток, тем не менее слияние происходит редко и является в достаточной степени случайным событием. В смеси присутствуют клетки миеломы, селезенки, а также слившиеся клетки миеломы—селезенки, миеломы—миеломы, селезенки—селезенки. Однако в среде ГАТ растут только гибридные клетки миеломы—селезенки, все остальные типы клеток не могут в ней пролиферировать. Клетки селезенки и слившиеся клетки селезенки—селезенки вообще не растут в культуре, а миеломные клетки HGPRT^- и слившиеся клетки миеломы—миеломы не могут использовать гипоксантин в качестве предшественника в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых кислот. Но у них есть другой естественный путь синтеза пуринов - при участии дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, ингибирующий активность этого фермента. Таким образом, миеломные клетки HGPRT^- и слившиеся клетки миеломы-миеломы не могут синтезировать пурины в среде ГАТ и погибают.

Слившиеся клетки селезенки—миеломы растут в среде ГАТ, поскольку: 1) клетки селезенки поставляют функциональную HGPRT, которая может утилизировать экзогенный гипоксантин среды несмотря на блокирование синтеза пуринов с участием дигидрофолатредуктазы аминоптерином; 2) клетки миеломы способны активно делиться. Тимидин необходим для устранения блокирования в синтезе пиримидинов, обусловленного ингибированием дигидрофолатредуктазы. На 10—14-е сутки после слияния клеток в среде ГАТ остаются и растут только слившиеся клетки селезенки—миеломы. Их затем вносят в лунки пластиковых микротитровальных плашек и выращивают на полной культуральной среде без ГАТ.

Теперь необходимо идентифицировать гибридные клетки, вырабатывающие антитела к иммунизирующему антигену. Для этого обычно проводят скрининг культуральных сред, содержащих секретируемые антитела. Среду из тех лунок, в которых есть растущие клетки, отбирают и переносят в лунки другой микротитровальной плашки, предварительно покрытые слоем молекул антигена-мишени. Если в культуральной среде находится антитело (первое антитело), распознающее один из эпитопов данного антигена, то оно свяжется с антигеном и останется в лунках после их промывания. Затем в лунки добавляют второе антитело, специфичное к мышиным антителам. Оно будет присоединяться к любому первому антителу, связанному с антигеном.

К используемому в иммунном анализе второму антителу предварительно присоединяют фермент, который превращает неокрашенный субстрат в окрашенное соединение. Изменение цвета содержимого одной из лунок говорит о том, что исходная культуральная среда содержала антитело, специфичное к данному антигену. Если же такое антитело в среде отсутствовало, то второму антителу не с чем будет связываться и оно смоется при втором промывании. Субстрат в таких лунках останется неокрашенным.

Лунки исходной микротитровальной плашки, среда из которых дает положительный иммунный ответ (изменение цвета), могут содержать смесь слившихся клеток. Чтобы получить линии, происходящие от одной клетки (клоны) клеточную суспензию из таких лунок разводят культуральной средой и высевают в другие лунки. После культивирования полученных клонов среды вновь тестируют, определяя, какая из клеточных линий (гибридом) продуцирует моноклональные антитела, распознающие антиген-мишень. В том случае, когда получают более одной специфичной гибридомы, проводят дальнейшие исследования, позволяющие определить, направлены ли антитела, вырабатываемые разными клонами, против одной и той же антигенной детерминанты. Каждый клон, продуцирующий моноклональное антитело, можно поддерживать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жидком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток.

Применение моноклональных антител позволяет существенно повысить специфичность метода ELISA, поскольку они связываются с одним, строго определенным антигенным сайтом. К настоящему времени получен целый ряд моноклональных антител, которые можно использовать для обнаружения различных соединений и патогенных микроорганизмов. Альтернативой получению моноклональных антител из культуры гибридомных клеток может быть отбор и производство моноклональных антител и их частей (Fv-фрагментов), направленных против антигена-мишени, с помощью Е. coli .

Системы ДНК-диагностики

Информация о всем многообразии свойств организма заключена в его генетическом материале. Так, патогенность бактерий определяется наличием у них специфического гена или набора генов, а наследственное генетическое заболевание возникает в результате повреждения определенного гена. Сегмент ДНК, детерминирующий данный биологический признак, имеет строго определенную нуклеотидную последовательность и может служить диагностическим маркером.

В основе многих быстрых и надежных диагностических методов лежит гибридизация нуклеиновых кислот — спаривание двух комплементарных сегментов разных молекул ДНК. Процедура в общих чертах состоит в следующем.

1. Фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре.

2. Нанесение меченой одноцепочечной ДНК-зонда, которая при определенных условиях (температуре и ионной силе) спаривается с ДНК-мишенью.

3. Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшейся меченой ДНК-зонда.

4. Детекция гибридных молекул зонд/мишень.

В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. Система детекции должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной.

Гибридизационные зонды

Чтобы обеспечить адекватность диагностического теста, гибридизационные ДНК- и РНК-зонды должны быть высокоспецифичными. Другими словами, необходимо, чтобы зонд гибридизовался только с искомой нуклеотидной последовательностью. Если есть вероятность получения ложноположительного (наличие гибридизационного сигнала в отсутствие последовательности-мишени) или ложноотрицательного (отсутствие сигнала при наличии последовательности-мишени) результата, то целесообразность применения теста значительно снижается. Специфичность зондов может проявляться на разных уровнях: они могут «различать» два и более вида, отдельные штаммы в пределах одного вида или разные гены. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК или РНК; они могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов), представлять собой продукт химического синтеза, клонированные интактные гены или их фрагменты.

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизуюшиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах.

Весьма желательно, чтобы ДНК-диагностику можно было проводить на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образцы. Исследователи с успехом проводят гибридизацию с ДНК-мишенями, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, смывах из зева и в тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательности-мишени в исследуемом образце слишком мала, ее можно амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Диагностика малярии

В качестве примера использования ДНК-зондов для диагностики заболеваний можно привести процедуру обнаружения Plasmodium falciparum . Этот паразит вызывает малярию, заболевание, угрожающее примерно трети всего населения Земли. Он инфицирует эритроциты и разрушай их, что приводит к развитию лихорадки, а в тяжелых случаях — к поражению мозга, почек и других органов. Чтобы выявить источники инфекции, оценить эффективность мер по их ликвидации и обеспечить раннюю диагностику и лечение, необходимы достаточно чувствительные, простые и недорогие методы. В настоящее время малярию диагностируют с помощью микроскопического исследования мазков крови - эффективного, но трудоемкого и занимающем много времени процесса. Иммунологические методы обнаружения Plasmodium , такие как ELISA, достаточно быстрые и их легко автоматизировать, но с их помощью нельзя отличить, текущую инфекцию от прошедшей, поскольку при этом определяется только наличие антел к Plasmodium в крови больных.

Для избирательной ДНК-диагностики текущей инфекции, т. е. для выявления ДНК возбудителя, в качестве основы используются высокоповторяющиеся последовательности ДНК P . falciparum . Сначала с помощью ДНК-зонд, проводится скрининг библиотеки геномной ДНК паразита. Затем отбираются клоны, дающие наиболее интенсивный гибридизационный сигнал, поскольку именно они предположительно содержат высокоповторяющиеся последовательности. ДНК каждого из отобранных клонов проверяют на способность к гибридизации с ДНК видов Plasmodium , не вызывающих малярию. В качестве специфического зонда выбирается последовательность, гибридизующаяся с ДНК P . falciparum , но не с ДНК P . vivax , P . cynomolgi или с ДНК человека. С его помощью можно обнаруживать всего 10 пг очищенной ДНК P . falciparum или 1 нг той же ДНК в крови больного. Получены и охарактеризованы более 100 различных ДНК-зондов, позволяющих обнаруживать патогенные штаммы различных бактерий, вирусов и паразитических простейших. Так, имеются зонды для диагностики бактериальных инфекций человека, вызываемых Legionella рпеи mophila (респираторные заболевания), Salmonella typhi (пищевые отравления), Campylobacter hyoinrestinalis (гастриты), а также для выявления энтеротоксичного штамма Escherichia coll (гастроэнтериты). Однако это лишь «верхушка айсберга»; в принципе с помощью гибридизации можно выявлять практически любые патогенные микроорганизмы.

 

Перспективы

Молекулярная диагностика — это быстро развивающееся направление. Хотя его основные принципы уже сформировались, технические детали отдельных тестов могут различаться. Для получения в достаточном количестве ДНК-мишени сейчас успешно применяют ПЦР. Использование ПЦР и специфических зондов существенно повышает чувствительность тестов и позволяет применять нерадиоактивные хромогенные, хемилюминесцентные и флуоресцентные системы регистрации. Во многих случаях для выявления мутации или экзогенной ДНК инфекционного агента в исследуемом образце достаточно провести ПЦР с последующим электрофоретическим разделением продуктов. Не вызывает сомнения, что с помощью ДНК-диагностики можно будет выявлять большинство, а возможно и все наиболее распространенные генетические и инфекционные заболевания, а также новообразования.

Заключение

Любой эффективный диагностический тест должен быть: 1) высокоспецифичным в отношении молекулы-мишени; 2) достаточно чувствительным для выявления небольших количеств мишени; 3) достаточно простым, позволяющим без труда получать однозначные результаты. Существуют два типа методов молекулярной диагностики: один основан на сродстве антитела к конкретному антигену, другой — на идентификации специфических нуклеотидных последовательностей с помощью гибридизации или ПЦР.

Наиболее распространенным иммунологическим методом является ELISA. Вкратце он состоит в следующем: 1) фиксация образца на твердой подложке; 2) добавление первого антитела, специфичного к антигену-мишени, и его связывание с антигеном-мишенью; 3) добавление конъюгата второе антитело—фермент, который присоединяется к первому антителу; 4) добавление неокрашенного субстрата, который под действием фермента, входящего в состав конъюгата, превращается в окрашенное соединение. Изменение цвета реакционной смеси свидетельствует о присутствии в образце молекулы-мишени.

ELISA применяется для обнаружения различных белков, идентификации вирусов и бактерий, а также определения низкомолекулярных соединений в широком спектре биологических образцов. Чтобы повысить специфичность первых антител, для диагностики часто используют моноклональные антитела. При этом для уменьшения стоимости прибегают к технике клонирования их фрагментов в Е. coli и получают комбинаторную библиотеку, а на ее основе — широкий спектр комбинаций Fv-фрагментов.

Высокочувствительным и специфичным методом обнаружения нуклеотидных последовательностей в биологических образцах является гибридизация. Его использовали при разработке способов идентификации патогенных микроорганизмов в клинических образцах и различных микроорганизмов в окружающей среде.

ДНК-диагностика основывается на обнаружении известных нуклеотидных последовательностей; для этого синтезируют специфические праймеры и амплифицируют последовательность-мишень. Это позволяет использовать нерадиоактивные системы детекции (например, хемилюминесцентный метод) или регистрировать ПЦР-продукты методом гель-электрофореза. Кроме того, ПЦР-продукты можно пометить флуоресцентным красителем, присоединив его к 5'-концу праймера.

В судебной медицине все более широкое применение находит метод геномной дактилоскопии, основанный на том, что ДНК каждого человека образует уникальный набор гибридизационных полос. При этом в качестве зондов обычно используют минисателлитные ДНК человека, которые не кодируют никаких белков и отличаются высокой вариабельностью.

Для характеристики ДНК растений используют набор произвольных олигонуклеотидных праймеров, проводят ПЦР-амплифицикацию случайных фрагментов ДНК, осуществляют электрофорез и получают специфичный для каждого растения набор полос ДНК; данный подход носит название RAPD.

Методы ДНК-диагностики применяют также для обнаружения точковых мутаций в данном гене. Один из подходов заключается в лигировании двух олигонуклеотидных праймеров. При несоответствии всего одного нуклеотида в месте стыковки гибридизовавшихся олигонуклеотидов лигирования не происходит.

 

ЛЕКЦИЯ 6.

Лекарственные препараты

Выделение кДНК интерферонов

 Для выделения генов или кДНК белков человека используют разные подходы. В ряде случаев выделяют нужный белок и определяют аминикислотную последовательность соответствуйшего участка молекулы. Исходя из этого находят кодирующую его нуклеотидную последовательность, синтезируют соответствующий олигонуклеотид и используют его в качестве гибридизационного зонда для выделения нужного гена или кДНК из геномных или кДНК-библиотек. Другой подход состоит в выработке антител к очищенному белку и использовании их для скрининга библиотек, в которых происходит экспрессия определенных генов. Для белков человека, синтезируемых преимущественно в какой-то одной ткани, кДНК-библиотека, полученная на основе мРНК, выделенной из этой ткани, будет обогащена последовательностью ДНК-мишени. Например, основным белком, синтезируемым клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, является инсулин, и 70% мРНК, выделенных из этих клеток, кодируют именно его. Однако принцип обогащения кДНК неприменим для тех белков человека, количество которых очень мало или место синтеза которых неизвестно. В этом случае могут понадобиться другие экспериментальные подходы. Интерфероны (ИФ) человека, включающие a-,b- и g - интерфероны (ИФa, ИФb, ИФg), — это природные белки, каждый из которых может найти свое терапевтическое применение. При выделении их кДНК пришлось разработать новый подход, позволяющий преодолеть трудности, связанные с недостаточным содержанием соответствующих мРНК и белков. Процедура выделения кДНК интерферонов состояла в следуюшем.

 

1. Из лейкоцитов человека выделили мРНК и фракционировали ее по размерам; провели обратную транскрипцию и встроили в сайт PstI плазмиды pBR322.

2. Полученным продуктом трансформировали Escherichia со li . Образовавшиеся 6000 клонов подразделили на 12 групп: по 512 клонов в каждой. Тестирования проводили на группе клонов, что позволило ускорить процесс их идентификации.

3. Каждую группу клонов гибридизовали с неочищенным препаратом ИФ-мРНК.

4. Из образовавшихся гибридов, содержащих клонированную ДНК и мРНК, выделили мРНК и провели ее трансляцию в бесклеточной системе синтеза белка.

5. Определили интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержали клон с кДНК, гибридизовшейся с ИФ-мРНК.

6. Позитивные группы разбили на 8 подгрупп, содержащих по 64 клона, и вновь провели тестирование. Разбиение на подгруппы повторяли до тех пор, пока не идентифицировали клон, содержащий полноразмерную ИФ-кДНК человека.

Если нужно получить большие количества ИФ, соответствующую кДНК можно субклонировать в экспрессирующем Е.со li-векторе, который позволяет достичь высокого уровня экспрессии.

Интерфероны человека, полученные методом генной инженерии

Первый ген интерферона был выделен в начале 80-х гг. С тех пор было обнаружено несколько разных интерферонов. Как мы уже говорили, исходя из химических и биологических свойств всех их можно подразделить на три группы: ИФa, ИФb и ИФg. ИФa и Ифb синтезируются клетками, обработанными препаратами вирусов или вирусной РНК, а ИФg вырабатывается в ответ на действие веществ, стимулирующих рост клеток. ИФa кодируется семейством генов, включающим как минимум 15 неаллельных генов, в то время как ИФb и ИФg кодируются одним геном каждый. Подтипы ИФa проявляют разную специфичность. Например, при проверке эффективности ИФa₁, и ИФa₂ на обработанной вирусом линии клеток быка эти интерфероны проявляют сходную противовирусную активность, в случае же обработанных вирусом клеток человека ИФa₂ оказывается в семь раз активнее, чем Ифa₁. Если противовирусная активность проверяется на клетках мыши, то ИФa₂ оказывается в 30 раз менее эффективным, чем ИФa₁.

Было предпринято несколько попыток создать ИФ с комбинированными свойствами, используя тот факт, что члены семейства ИФa различаются по степени и специфичности своей противовирусной активности. Теоретически этого можно достичь, соединив части последовательностей генов разных ИФa. Это приведет к образованию гибридного белка с другими свойствами, чем у каждого из исходных белков. Сравнение последовательностей кДНК ИФa₁, и ИФa₂ показало, что они содержат одинаковые сайты рестрикции в позициях 60, 92 и 150. После расщепления обеих кДНК в этих сайтах и последующего лигирования фрагментов было получено несколько гибридных генов. Эти гены экспрессировали в Е. coli , синтезированные белки очистили и исследовали их биологические функции. Проверка защитных свойств гибридных ИФ на культуре клеток млекопитающих показала, что некоторые из них проявляют большую активность, чем родительские молекулы. Кроме того, многие гибридные ИФ индуцировали образование 2'—5'-олигоизоаденилатсинтетазы в контрольных клетках. Этот фермент участвует в синтезе 2'—5'-связанных олигонуклеотидов, которые в свою очередь активируют латентную клеточную эндорибонуклеазу, расщепляющую вирусную мРНК. Другие гибридные ИФ проявляли большую, чем родительские молекулы, антипролиферативную активность в культурах различных раковых клеток человека.

Гормон роста человека, полученный методом генной инженерии

Стратегию конструирования новых белков путем замены функциональных доменов или с помощью направленного мутагенеза можно использовать для усиления или ослабления биологического действия белка. Например, нативный гормон роста человека (ГРЧ) связывается в разных типах клеток как с рецептором гормона роста, так и с пролактиновым рецептором.

Чтобы избежать нежелательных побочных эффектов в процессе лечения, нужно исключить присоединение ГРЧ к пролактиновому рецептору. Поскольку участок молекулы гормона роста, связывающийся с этим рецептором, по своей аминокислотной последовательности лишь частично совпадает с участком молекулы, который взаимодействует с пролактиновым рецептором, удалось избирательно снизить связывание гормона с последним. Для этого использовали сайт-специфический мутагенез, в результате которого произошли определенные изменения в боковых группах некоторых аминокислот (His-18, His-21 и Glu-174) — лигандов для ионов Zn²⁺, необходимых для высокоаффинного связывания ГРЧ с пролактиновым рецептором. Модифицированный гормон роста связывается только со «своим» рецептором. Полученные результаты представляют несомненный интерес, но смогут ли модифицированные ГРЧ найти применение в клинике, пока неясно.

Оптимизация генной экспрессии

Недостаточно создать новый белок, важно оптимизировать экспрессию его гена. Для начала исследователи определяют возможность синтеза достаточных количеств аутентичного белка и прокариотической или эукариотической системах экспрессии. Прокариотическим системам отдается предпочтение, поскольку работа с ними обходится дешевле, а производительность выше. К сожалению, не все микроорганизмы синтезируют функциональные формы гетерологичных белков с одинаковой эффективностью, поэтому необходимо проводить сравнительные количественные оценки.

При изучении экспрессии гена интерлейкина-3 человека в различных клетках-хозяевах «наилучшим» хозяином оказалась Bacillus licheniformis. Хотя в одной из систем Е. coli был достигнут несколько более высокий уровень экспрессии, полученный белок мол. массой 20 кДа представлял собой продукт слияния интерлейкина-3 с участком b-галактозидазы Е. coli , а не зрелый аутентичный белок мол. массой 15 кДа. Как правило, подобный химерный белок нельзя использовать в качестве лекарственного средства. Клетки дрожжей Kluyveromyces lactis и Saccharomyces cerevisiae , а также клетки человека были способны гликозилировать интерлейкин-3, однако уровень экспрессии в них был относительно низок. Гликозилирование не оказывает заметного влияния на активность интерлейкина-3, но ведет к ощутимой разнице в размерах молекулы.

 

 

Ферменты

ДНКаза I

Наиболее частым летальным наследственным заболеванием среди европеоидов является муковисцидоз. В США выявлено 30 000 случаев этого заболевания, в Канаде и странах Европы - 23 000. Пациенты с муковисцидозом часто страдают инфекционными заболеваниями, поражающими легкие. Лечение рецидивирующих инфекций антибиотиками в конце концов приводит к появлению резистентных штаммов патогенных бактерий. Бактерии и продукты их лизиса вызывают накопление в легких вязкой слизи, затрудняющей дыхание. Одним из компонентов слизи является высокомолекулярная ДНК, которая высвобождается из бактериальных клеток при лизисе. Ученые из биотехнологической компании Genentech (США) выделили и экспрессировали ген ДНКазы - фермента, который расщепляет высокомолекулярную ДНК на более короткие фрагменты. Очищенный фермент вводят в составе аэрозоля в легкие больных муковисцидозом, он расщепляет ДНК, вязкость слизи снижается, что облегчает дыхание. Хотя эти меры и не излечивают муковисцидоз, они облегчают состояние больного. Применение данного фермента было недавно одобрено Департаментом по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США), и объем его продаж составил в 2000 г. примерно 100 млн. долларов.

Альгинат-лиаза

Альгинат — это полисахарид, синтезируемый целым рядом морских водорослей, а также починными и морскими бактериями. Его мономерными единицами являются два сахарида —b-D-маннуронат и a-L-гулуронат, относительное содержание и распределение которых и определяют свойства конкретного альгината. Так, остатки a-L-гулуроната образуют межцепочечные и внутрицепочечные сшивки путем связывания ионов кальция; остатки b-D-маннуроната связывают ионы других металлов. Альгинат, содержащий такие сшивки, образует эластичный гель, вязкость которого прямо пропорциональна размеру полисахаридных молекул.

Выделение альгината слизистыми штаммами Pseudomonas aeruginosa существенно повышает вязкость слизи у больных муковисцидозом. Чтобы очистить дыхательные пути и облегчить состояние больных, в дополнение к обработке ДНКазой I следует провести деполимеризацию альгината с помощью альгинат-лиазы.

Ген альгинат-лиазы был выделен из Flavobacterium sp., грамотрицательной почвенной бактерии, ативно вырабатывающей этот фермент. На основе Е. coli был создан банк клонов Flavobacterium и проведен скрининг тех из них, которые синтезируют альгинат-лиазу, путем высевания всех клонов на твердую среду, содержащую альгинат, с добавлением ионов кальция. В таких условиях весь альгинат, находящийся в среде, за исключением того, который окружает продуцирующие альгинат-лиазу колонии, образует сшивки и становится мутным. Гидролизованный альгинат теряет способность к формированию сшивок, поэтому среда вокруг синтезирующих альгинат-лиазу колоний остается прозрачной. Анализ клонированного фрагмента ДНК, присутствующего в одной из положительных колоний, показал наличие открытой рамки считывания, кодирующей полипептид мол. массой около 69 000. Более детальные биохимические и генетические исследования показали, что этот полипептид, по-видимому, является предшественником трех альгинат-лиаз, вырабатываемых Flavobacterium sp. Сначала какой-то протеолитический фермент отрезает от него N-концевой пептид массой около 6000. Оставшийся белок мол. массой 63 000 способен деполимеризовать альгинат, вырабатываемый как бактериями, так и морскими водорослями. При его последующем разрезании образуется продукт мол. массой 23 000, деполимеризующий альгинат морских водорослей, и фермент мол. массой 40 000, разрушающий альгинат бактерий. Для получения больших количеств фермента мол. массой 40 000 кодирующую его ДНК амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), а затем встраивали в выделенный из В. subtilis плазмидный вектор, несущий ген, кодирующий сигнальный пептид a-амилазы В. subtilis . Транскрипцию контролировали при помощи системы экспрессии гена пенициллиназы. При трансформации клеток В. subtilis полученной плазмидой и высевании их на содержащую альгинат твердую среду с добавлением ионов кальция образовались колонии с большим ореолом. Когда такие колонии выращивали в жидкой среде, рекомбинантная альгинат-лиаза выделялась в культуральную среду. Последующие тесты показали, что этот фермент способен эффективно разжижать альгинаты, синтезируемые слизистыми штаммами P . aeruginosa , которые были выделены из легких больных муковисцидозом. Для того чтобы определить, целесообразно ли проводить клиническое тестирование рекомбинантной альгинат-лиазы, нужны дополнительные исследования.

 

Заключение

С помощью клонирования специфических генов и последующей их экспрессии в бактериях получен целый ряд белков, которые можно будет использовать в качестве лекарственных препаратов. Большинство этих белков имеют эукариотическое происхождение, так что для выделения нужного гена сначала получают препарат мРНК, обогащенный интересующими исследователя фракциями, затем создают кДНК-библиотеку и встраивают соответствующую ДНК в подходящий вектор для экспрессии. Произведя обмен участков родственных генов, кодирующих аналогичные белковые домены, или прямо заменяя сегменты клонированного гена, кодирующие функциональные части белка, можно создавать новые модификации таких белков. В качестве лекарственных средств можно использовать и некоторые ферменты. Например, для снижения вязкости слизи, которая накапливается в легких больных муковисцидозом, применяют в виде аэрозоля рекомбинантную ДНКазу I и альгинатлиазу.

С развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой способов получения моноклональных антител, а также с установлением структуры и функций иммуноглобулинов появился интерес к использованию специфических антител для лечения различных заболеваний. Работа с генами антител облегчается тем, что отдельные домены молекулы антитела выполняют разные функции.

Лекарственные вещества или ферменты можно присоединять к моноклональным антителам или их Fv-фрагментам, специфичным в отношении поверхностных белков определенных клеток, например опухолевых. При этом лекарственное вещество может находиться в инертной форме. Если предполагаются многократные введения таких комплексов, то их иммуноглобулиновый компонент должен представлять собой антитело или фрагмент антитела человека; это позволяет предотвратить равитие перекрестной иммунной реакции и сенсибилизацию больного. Если же предполагается использовать в этих целях моноклональные антитела грызунов, их структуру следует максимально приблизить к структуре антител человека. Для этого в последних достаточно заменим, CDR-участки на аналогичные фрагменты антител грызунов. Недавно удалось провести отбор и синтез моноклональных антител человека с помощью Е. coli .

Генноинженерные методы позволяют получать уникальные лекарственные средства, которые представляют собой комплекс белка, связывающегося со специфическими клетками, например ВИЧ-инфицированными, и токсина. Этот подход пока только разрабатывается, но его перспективы обнадеживают.

ЛЕКЦИЯ 7.

Эндонуклеазы рестрикции

Развитие технологии рекомбинантных ДНК было бы невозможно, если бы в распоряжении исследователей не было нужных эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). В настоящее время в продаже имеется более 300 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируются самыми разными микроорганизмами: аэробными, анаэробами, фотосинтезирующими, диазотрофными, мезотрофными, термофильными, психрофильными, медленно- и быстрорастущими. Для культивирования каждого из них необходимо подобрать оптимальные условия ферментации — температуру, рН, состав среды, концентрацию кислорода — с тем чтобы максимизировать выход необходимого фермента. Чтобы не пришлось выращивать большое число разных микроорганизмов, готовить многокомпонентные среды, разрабатывать разные ферментеры и тратить время на подбор оптимальных условий роста для многочисленных организмов, часто клонируют гены эндонуклеаз рестрикции в Escherichia coli . Это позволяет стандартизовать условия получения необходимых продуктов. Кроме того, культура клеток Е. coli быстро достигает высокой плотности и может быть приспособлена для сверхпродукции необходимого фермента.

Технология выделения и экспрессии чужеродных генов в Е. coli и в некоторых других микроорганизмах достаточно хорошо отработана, однако не стоит забывать, что синтез гетерологичного белка в организме-хозяине может оказывать на него негативное влияние. Например, сверхпродукция такого белка может привести к истощению метаболических ресурсов хозяйского организма и отрицательно повлиять на его рост. Присутствие гетерологичного белка может оказаться даже губительным для клетки-хозяина. Так, сайты рестрикции имеются во всех молекулах ДНК, и если продуктом клонированного гена является эндонуклеаза рестрикции, то в отсутствие специальных защитных механизмов хозяйская ДНК будет расщепляться ею.

Микроорганизмы, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, выработали систему самозащиты: они метилируют одно или несколько оснований рестриктазного сайта, и расщепление ДНК в этом сайте гомологичной эндонуклеазой рестрикции блокируется. Грамотрицательные микроорганизмы имеют еще один механизм защиты: эндонуклеазы рестрикции у них локализованы в периплазматическом пространстве. Благодаря такой компартментализации происходит физическое разделение рестриктаз и ДНК и при этом обеспечивается свободный доступ метилирующего (модифицирующего) фермента к хромосомной ДНК. Кроме того, это защищает клетку от проникновения в нее любой чужеродной ДНК, например вирусной.

Один из подходов к решению проблемы деградации хозяйской ДНК гетерологичными эндонуклеазами рестрикции состоит в клонировании и экспрессии в реципиентном организме как гена фермента рестрикции, так и гена соответствующего модифицирующего фермента. Однако клонирование обоих этих генов в одном микроорганизме технически затруднено, если они расположены на хромосоме донорного организма далеко друг от друга. Кроме того, чтобы не допустить расщепления хозяйской ДНК эндонуклеазами рестрикции, метилирующий фермент после трансформации должен синтезироваться еще до начала синтеза рестриктазы.

1. ДНК P . stuartii расщепляют с помощью Hindlll и встраивают фрагменты в Hindlll-сайт плазмиды pBR322.

2. Рекомбинантными плазмидами трансформируют клетки Е. coli HB101 и выращивают их в жидкой среде, а затем инфицируют бактериофагом l. Если в хозяйской клетке экспрессируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа l, ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой.

3. Трансформированные клетки, устойчивые к фагу l, подвергают осмотическому шоку, чтобы высвободить периплазматические белки. Определяют активность рестриктазы PstI в белковом экстракте.

4. Положительные клоны тестируют на наличие PstI -метилирующей активности.

Один положительный клон, выявленный в этом эксперименте, содержал встроенный фрагмент ДНК длиной 4 т. п. н. с интактным опероном рестриктазы и метилазы Pstl и промотором P . stuartii . В клоне, несущем эту генетическую конструкцию, соблюдался естественный временной порядок синтеза: вначале синтезировался метилирующий фермент, затем эндонуклеаза рестрикции. Уровень экспрессии гена рестриктазы Pstl в Е. coli был примерно в 10 раз выше, чем в P . stuartii . Как и предполагалось, рестриктаза находилась в периплазматическом пространстве, а метилаза — в цитоплазме. Метод получения PstI клонированием соответствующего гена в E . со li гораздо более эффективен, чем выделение этого фермента из P . stuartii .

Для выделения генов, кодирующих ферменты рестрикции и модификации (метилирования), можно использовать также другой подход, который состоит в следующем.

1. Создают банк клонов ДНК организма-донора, продуцирующего известную эндонуклеазу рестрикции. Используемый при этом плазмидный вектор должен содержать по крайней мере один сайт узнавания для этом рестриктазы.

2. Трансформируют Е. coli гибридными плазмидами.

3. Из трансформированных клеток, выросших в жидкой селективной среде (т. е. из клеток. содержащих плазмиду), выделяют плазмидную ДНК.

4. Обрабатывают ее интересующей исследователя эндонуклеазой рестрикции.

5. Трансформируют Е. coli плазмидными ДНК, обработанными эндонуклеазой рестрикции.

Ключевым моментом этого метода являете то, что плазмидная ДНК клонов, несущих и экспрессирующих ген фермента модификации, оказывается устойчивой к расщеплению соответствующей эндонуклеазой рестрикции, поскольку сайты узнавания в ней метилированы.

Рассмотрим следующий пример. В плазмиду pBR322 встраивали Hind III-фрагменты ДНК Desulfovibrio desulfuricans и трансформировали ею клетки Е. coli . Выделенную из трансформированных клеток плазмидную ДНК обрабатывали рестриктазой Ddel. Плазмиды, несущие и экспрессирующие ген метилирующего фермента, не расщеплялись, поскольку все восемь сайтов узнавания Ddel в pBR322 были метилированы. Смесь плазмид, обработанных Ddel, использовали для трансформации Е. coli . Образование трансформантов, несущих ген функционального модифицирующего фермента Ddel, обеспечивали только целые кольцевые молекулы плазмидных ДНК. Остальные плазмиды были расщеплены эндонуклеазой рестрикции. Для того чтобы определить, какие клоны содержат и ген фермента модификации, и ген эндонуклеазы рестрикции, трансформанты тестировали на наличие в них активной рестриктазы Ddel. Описанный подход можно с успехом использовать для выделения гена любой рестриктазы, лишь бы он находился достаточно близко к гену соответствующего модифицирующего фермента и был встроен в плазмидный вектор, имеющий по меньшей мере один сайт узнавания для данного фермента.

Антибиотики

Со времени открытия пенициллина в конце 1920-х годов из различных микроорганизмов были выделены более 6000 антибиотиков, обладающих разной специфичностью и разным механизмом действия. Их широкое применение для лечения инфекционных заболеваний помогло сохранить миллионы жизней. Подавляющее большинство основных антибиотиков было выделено из грамположительной почвенной бактерии Streptomyces , хотя их продуцируют также грибы и другие грамположительные и грамотрицательные бактерии. Ежегодно во всем мире производится 100 000 т антибиотиков на сумму примерно 5 млрд. долларов, в том числе более 100 млн. долларов приходится на долю антибиотиков, добавляемых в корм скоту в качестве добавок или ускорителей роста.

По оценкам, каждый год ученые обнаруживают от 100 до 200 новых антибиотиков, прежде всего в рамках обширных исследовательских программ по поиску среди тысяч различных микроорганизмов таких, которые синтезировали бы уникальные антибиотики. Получение и клинические испытания новых препаратов обходятся очень дорого, и в продажу поступают только те из них, которые имеют большую терапевтическую ценность и представляют экономический интерес. На их долю приходится 1—2% всех обнаруживаемых антибиотиков. Большой эффект здесь может дать технология рекомбинантных ДНК. Во-первых, с ее помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное воздействие на определенные микроорганизмы и обладающие минимальными побочными эффектами. Во-вторых, генноинженерные подходы могут использоваться для увеличения выхода антибиотиков и соответственно для снижения стоимости их производства.

При создании рекомбинантных штаммов Streptomyces — основного микроорганизма, используемого для получения антибиотиков, — важно помнить, что трансформация и отбор трансформированных клеток не должны быть слишком сложными. Однако в отличие от Е. coli Streptomyces существуют не в виде изолированных клеток, а в виде протяженных мицелл, поэтому перед трансформацией необходимо разрушить клеточную стенку и высвободить отдельные протопласты. Без этого будет невозможно отличить трансформированные клетки от нетрансформированных, поскольку видимые колонии на твердой среде будут образовываться из группы клеток, а не из индивидуальной клетки; соответственно колонии, растущие в присутствии селективного антибиотика, будут представлять собой смесь трансформированных и нетрансформированных клеток. Проникновение плазмидной ДНК в протопласты Streptomyces облегчается в присутствии полиэтиленгликоля. После трансформации протопласты сначала высевают на твердую среду, чтобы образовалась клеточная стенка, а затем для отбора трансформированных клеток переносят на селективную среду, обычно содержащую либо неомицин, либо тиострептон.

 

Клонирование генов биосинтеза антибиотиков

Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из 10—30 ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза — задача не из легких. Один из подходов к выделению полного набора таких генов основан на трансформации одного или нескольких мутантных штаммов, не способных синтезировать данный антибиотик, банком клонов, созданным из хромосомной ДНК штамма дикого типа. После введения банка клонов в мутантные клетки проводят отбор трансформантов, способных синтезировать антибиотик. Затем выделяют плазмидную ДНК клона, содержащего функциональный экспрессирующийся ген антибиотика [т.е. ген, восстанавливающий (комплементирующий) утраченную мутантным штаммом функцию], и используют ее в качестве зонда для скрининга другого банка клонов хромосомной ДНК штамма дикого типа, из которого отбирают клоны, содержащие нуклеотидные последовательности, которые перекрываются с последовательностью зонда. Таким образом, идентифицируют, а затем клонируют элементы ДНК, примыкающие к комплементирующей последовательности, и воссоздают полный кластер генов биосинтеза антибиотика. Описанная процедура относится к случаю, когда эти гены сгруппированы в одном сайте хромосомной ДНК. Если же гены биосинтеза разбросаны в виде небольших кластеров по разным сайтам, то нужно иметь по крайней мере по одному мутанту на кластер, чтобы получить клоны ДНК, с помощью которых можно идентифицировать остальные гены кластеров.

Этот подход с успехом использовался для идентификации некоторых генов биосинтеза ундецилпродигиозина из Streptomyces coelicolor A3. В этом случае комплементационный анализ основывается на сравнении цвета колоний: колонии микроорганизмов дикого типа имеют красный цвет, а колонии мутантных микроорганизмов - кремовый. Таким образом, в результате комплементации образуется красная колония.

Помимо комплементации, для идентификации генов биосинтеза антибиотиков могут использоваться и более прямые подходы. Так, с помощью генетических или биохимических экспериментов можно идентифицировать, а затем выделить один или несколько ключевых ферментов биосинтеза, определить их N-концевые аминокислотные последовательности и, исходя из этих данных, синтезировать олигонуклеотидные зонды. Этот подход использовался для выделения из Penicillium chrysogenum гена синтетазы изопенициллина N. Этот фермент катализирует окислительную конденсацию d-(L-a-аминоадипил)-L-цистеинил-D-валина в изопенициллин N, ключевое промежуточное звено в биосинтезе пенициллинов, цефалоспоринов и цефамицинов.

Синтез новых антибиотиков

Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить, проводя генноинженерные манипуляции с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков. Один из первых экспериментов, в ходе которого был получен новый антибиотик, состоял в объединении в одном микроорганизме двух немного различающихся путей биосинтеза антибиотика.

Одна из плазмид Streptomyces , рIJ2303, несущая фрагмент хромосомной ДНК S . coelicolor длиной 32,5 т.п.н., содержит все гены ферментов, ответственных за биосинтез из ацетата антибиотика актинородина, представителя семейства изохроманхиноновых антибиотиков. Целую плазмиду и различные субклоны, несущие части 32,5 т.п.н.-фрагмента (например, рIJ2315), вводили либо в штамм АМ-7161 Streptomyces sp., синтезирующий родственный антибиотик медермицин, либо в штамм В1140 или Tii22 S . violaceoruber , синтезирующие родственные антибиотики гранатицин и дигидрогранатицин.

Все указанные антибиотики являются кислотно-щелочными индикаторами, которые придают растущей культуре характерный цвет, зависящий от рН среды. В свою очередь рН (и цвет) среды зависят от того, какое соединение синтезируется. Мутанты родительского штамма S . coelicolor , не способные синтезировать актинородин, бесцветные. Появление окраски после трансформации штамма АМ-7161 Streptomyces sp. либо штаммов В1140 или Тu22 S . violaceoruber плазмидой, несущей все или несколько генов, кодирующих ферменты биосинтеза актинородина, свидетельствует о синтезе нового антибиотика. Трансформанты штамма АМ-7161 Streptomyces sp. и штамма В1140 S . violaceoruber , содержащие плазмиду рIJ2303, синтезируют антибиотики, кодируемые и плазмидой, и хромосомной ДНК. Однако при трансформации штамма Tu22 S . violaceoruber плазмидой рIJ2303 наряду с актинородином синтезируется новый антибиотик — дигидрогранатиродин, а при трансформации штамма АМ-7161 Streptomuces sp. плазмbдой pIJ2315 синтезируется еще один новый антибиотик — медерродин А.

В структурном отношении эти новые антибиотики мало отличаются от актинородина, медермицина, гранатицина и гидрогранатицина и, вероятно, образуются в том случае, когда промежуточный продукт одного пути биосинтеза служит субстратом для фермента другого пути. Когда будут детально изучены биохимические свойства различных путей биосинтеза антибиотиков появится возможность создавать новые уникальные высокоспецифичные антибиотики, манипулируя генами, которые кодируют соответствующие ферменты.

Разработка новых методов получения поликетидных антибиотиков

Термин «поликетидные» относится к классу антибиотиков, которые образуются в результате последовательной ферментативной конденсации карбоновых кислот типа ацетата, пропионата и бутирата. Некоторые поликетидные антибиотики синтезируются растениями и грибами, но большая их часть образуется актиномицетами в виде вторичных метаболитов. Прежде чем проводить манипуляции с генами, кодирующими ферменты биосинтеза поликетидных антибиотиков, необходимо выяснить механизм действия этих ферментов.

Поликетидные антибиотики синтезируются по тому же пути, что и длинноцепочечные жирные кислоты. В результате каждого цикла конденсации к растущей углеродной цепи добавляется b-кетогруппа. Процесс состоит из ряда повторяющихся стадий, включающих восстановление кетогруппы, дегидратацию и восстановление b-еноильных групп в растущей поликетидной цепи. Существуют два класса поликетидсинтаз — ферментных комплексов, ответственных за синтез поликетидных антибиотиков. Первый класс составляют синтазы, катализирующие реакции биосинтеза ароматических подикетидов; каждая синтаза представляет собой один полипептид с одним активным центром, который последовательно катализирует биосинтетические реакции. Второй класс включает синтазы, образованные несколькими полипептидами (А-Е); каждый из них имеет свой активный центр и обладает специфической ферментативной активностью, катализирующей определенную реакцию биосинтеза.

Если каждый домен субъединицы многофункциональной поликетидсинтазы, обладающий ферментативной активностью, катализирует определенную реакцию, то утрата любой из активностей затронет только одну реакцию биосинтеза, а изменение домена с известной функцией приведет к предсказуемым изменениям структуры синтезируемого антибиотика. Так, детально изучив генетические и биохимические составляющие биосинтеза эритромицина в клетках Saccharopolyspora erythraea , удалось внести специфические изменения в гены, ассоциированные с биосинтезом этого антибиотика, и синтезировать производные эритромицина с другими свойствами. Вначале была определена первичная структура фрагмента ДНК S . erythraea длиной 56 т. п. н., содержащего кластер генов е r у, затем двумя разными способами модифицирована эритромицинполикетидсинтаза. Для этого 1) удаляли участок ДНК, кодирующий b-кеторедуктазу, либо 2) вносили изменение в участок ДНК, кодирующий еноилредуктазу. Делеция b-кеторедуктазного гена приводила к накоплению промежуточного продукта, у которого к С-5-атому кольца была присоединена карбонильная группа, а не гидроксильная, а мутация в гене еноилредуктазы - к образованию двойной связи между атомами С-6 и С-7. Из этих экспериментов следует, что если идентифицировать и охарактеризовать кластер генов, кодирующих ферменты биосинтеза определенного поликетидного антибиотика, то, внося в них специфические изменения, можно будет направленно изменять структуру антибиотика. Кроме того, вырезая и соединяя те или иные участки ДНК, можно перемещать домены поликетидсинтазы и получать новые поликетидные антибиотики.

Все кластеры генов ароматических поликетидов содержат три гена, кодирующих так называемую минимальную поликетидсинтазу. Этот ферментный комплекс включает кетосинтазe (с ацилтрансферазным доменом), фактор, определяющий длину цепи, и ацилпереносящий белок. Минимальная поликетидсинтаза отвечает за синтез ароматического поликетидного остова, а его модификации осуществляются другими ферментами, действующими соглаванно с ней. Гены, кодирующие все эти ферменты, обычно организованы в один кластер. Каждый кластер генов кодирует синтез определенного антибиотика. С помощью обмена генами между кластерами были синтезированы два новых ароматических поликетидных антибиотика, что еще раз иллюстрирует возможности генной инженерии.

Усовершенствование производства антибиотиков

С помощью генной инженерии можно не только создавать новые антибиотики, но и увеличивать эффективность синтеза уже известных. Лимитирующим фактором в промышленном производстве антибиотиков с помощью Streptomyces spp. часто является количество доступного клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости кислорода в воде и высокой плотности культуры Streptomyces его часто оказывается недостаточно, рост клеток замедляется и выход антибиотика снижается. Чтобы решить эту проблему, можно, во-первых, изменить конструкцию биореакторов, в которых выращивается культура Streptomyces , а во-вторых, используя методы генной инженерии, создать штаммы Streptomyces , более эффективно использующие имеющийся кислород. Эти два подхода не исключают друг друга.

Одна из стратегий, используемых некоторыми аэробными микроорганизмами для выживания в условиях недостатка кислорода, состоит в синтезе гемоглобинподобного продукта, способного аккумулировать кислород и доставлять его в клетки. Например, аэробная бактерия Vitreoscilla sp. синтезирует гомодимерный гемсодержащий белок, функционально подобный эукариотическому гемоглобину. Ген «гемоглобина» Vitreoscilla был выделен, встроен в плазмидный вектор Streptomyces и введен в клетки этого микроорганизма. После его экспрессии на долю гемоглобина Vitreoscilla приходилось примерно 0,1% всех  клеточных белков S . coelicolor даже в том случае, когда экспрессия осуществлялась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Vitreoscilla , а не промотора Streptomyces . Tpaнсформированные клетки S . coelicolor , растущие при низком содержании растворенного кислорода (примерно 5% от насыщающей концентрации), синтезировали в 10 раз больше актиноролина на 1 г сухой клеточной массы и имели большую скорость роста, чем нетрансформированные. Этот подход можно использовать и для обеспечения кислородом других микроорганизмов, растущих в условиях недостатка кислорода. Исходным материалом при химическом синтезе некоторых цефалоспоринов — антибиотиков, обладающих незначительным побочным эффектом и активных в отношении множества бактерий, — является 7-аминоцефалоспорановая кислота (7АСА), которая в свою очередь синтезируется из антибиотика цефалоспорина С. К сожалению, природных микроорганизмов, способных синтезировать 7АСА, до сих пор не выявлено. Новый путь биосинтеза 7АСА был сконструирован включением специфических генов в плазмиду гриба Acremonium chrysogenum , который обычно синтеризует только цефалоспорин С. Один из этих генов был представлен кДНК гриба Fusarium solani . кодирующей оксидазу D-аминокислот, а другой происходил из геномной ДНК Pseudomonas diminuta и кодировал цефалоспоринацилазу. В плазмиде гены находились под контролем промотора A . chrysogenum . На первом этапе нового биосинтетического пути цефатоспорин С превращается в 7-b-(5-карбокси-5-оксопентанамид) цефалоспорановую кислоту (кето-АD-7АСА) при помощи оксидазы D-аминокислот. Часть этого продукта, вступая в реакцию с пероксидом водорода, одним из побочных продуктов, превращается в 7-b-(4-карбоксибутанамид) цефалоспорановую кислоту (GL-7ACA). И цефалоспорин С, и кето-АD-7АСА, и GL-7ACA могут подвергаться гидролизу цефалоспоринацилазой с образованием 7АСА, однако только 5% цефалоспорина С напрямую гидролизуется до 7АСА. Следовательно, для образования 7АСА с высоким выходом необходимы оба фермента.

 

Биополимеры

Биополимеры — это высокомолекулярные соединения, синтезируемые живыми организмами. Некоторые из них обладают ценными физическими и химическими свойствами и могут использоваться в пищевой, перерабатывающей и фармацевтической промышленности. С возникновением технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность создавать новые биополимеры, заменять синтетические продукты их биологическими аналогами, модифицировать уже существующие биополимеры с целью улучшения их физических и структурных характеристик, повышать эффективность соответствующих промышленных процессов, уменьшать их стоимость.

Создание рекомбинантной бактерии Xanthomonas campestris с целью получения ксантановой слизи

Xanthomonas campestris — грамотрицательная облигатно аэробная почвенная бактерия, синтезирующая ценный коммерческий биополимер ксантановую слизь, высокомолекулярный экзополисахарид. Его структурный каркас составляет линейная полимерная цепь из молекул глюкозы. К каждому второму глюкозному остатку присоединена трисахаридная боковая цепь, состоящая из одного остатка глюкуроновой кислоты и двух остатков маннозы. Ксантановая слизь имеет высокую вязкость, не разрушается в агрессивных физических и химических средах и по физическим и химическим свойствам напоминает пластик. В частности, ее можно использовать как стабилизирующий, эмульгирующий, загущающий или суспендирующий агент. Для успешного коммерческого производства ксантановой слизи необходимо выращивать X . campestris на недорогом и доступном источнике углерода. X . campestris дикого типа эффективно утилизирует глюкозу, сахарозу и крахмал, но не лактозу. При производстве сыра в большом количестве образуется такой побочный продукт, как сыворотка. Она состоит из воды (94—95%), лактозы (3,5—4%) и небольших количеств белка, минеральных веществ и низкомолекулярных органических соединений. Огромные количества сыворотки дает молочная промышленность, и ее утилизация — это большая проблема. Часто сыворотку сливают в реки и озера, что приводит к уменьшению в них количества доступного кислорода и гибели многих водных организмов. Транспортировка сыворотки к местам захоронения мусора обходится очень дорого, к тому же серьезную проблему создает риск загрязнения ею грунтовых вод. Наконец, большие средства уходят на удаление твердых компонентов сыворотки. Все это заставило попытаться найти способы выгодной переработки сыворотки.

Сыворотку можно использовать как источник углерода при выращивании ценных промышленных микроорганизмов. Чтобы X . campestris приобрела способность расти на сыворотке, было проделано следующее. Гены lacZY E . coli , кодирующие ферменты b-галактозидазу и лактозопермеазу, встроили в плазмиду с широким кругом хозяев так, чтобы они находились под транскрипционным контролем промотора одного из бактериофагов X . campestris . Эту конструкцию ввели в E . coli , а затем перенесли из E . coli в X . campestris тройным скрещиванием. Трансформанты, содержащие плазмиду, синтезировали b-галактозидазу и лактозопермеазу, используя лактозу как единственный источник углерода, а также продуцировали в больших количествах ксантановую слизь, используя в качестве источников углерода глюкозу, лактозу и сыворотку. Подчеркнем еще раз, что X . campestris дикого типа синтезирует много ксантановой слизи, только когда растет на глюкозе.

Выделение генов биосинтеза меланина

Меланины образуют многочисленное семейство различных поглощающих свет биополимеров; их синтеризуют животные, растения, бактерии и грибы. Эти пигменты можно было бы использовать при изготовлении солнцезащитных экранов и покрытий, в качестве добавки к косметическим средствам. В настоящее время меланины получают в небольших количествах либо экстракцией из природных источников, либо путем химического синтеза. С помощью технологии рекомбинантных ДНК, возможно, удастся создать недорогое крупномасштабное производство меланинов с различными физическими свойствами.

Меланины — это нерегулярные полимеры, состоящие из остатков индола, бензотиазола и аминокислот. Первый этап их биосинтеза катализируется медьсодержащим ферментом монооксигеназой тирозиназы и представляет собой окисление тирозина до дигидроксифенилаланинхинона. Последние этапы полимеризации не являются каталитическими реакциями и в зависимости от химической природы нехинонных соединений, включающихся в полимерную структуру, дают конечные продукты разных цветов: черного, коричневого, желтого, красного или фиолетового.

Выделены и охарактеризованы гены биосинтеза меланина в бактериальных клетках Streptomyces antibioticus . Они содержат две открытые рамки считывания (ORF), одна из которых кодирует тирозиназу (мол. масса 30 600), а вторая (ORF438) - белок (мол. масса примерно 14 800) с неизвестными функциями. Чтобы проверить, нужны ли оба этих гена для синтеза меланина, гены сначала переклонировали в экспрессирующий вектор Е. соli, при этом одна конструкция содержала только ген тирозиназы, а другая — и ген тирозиназы, и ORF438. Вектор, несущий ген тирозиназы, обеспечивал синтез больших количеств тирозиназы, чем вектор, содержащий оба указанных гена. Однако оказалось, что уровень тирозиназы не имеет особого значения, а для биосинтеза меланина необходимы продукты обоих генов. Возможно, белок, кодируемый ORF438, поставляет ионы меди неактивному предшественнику тирозиназы апотирозиназе, которая активируется в их присутствии. В естественных условиях после образования дигидроксифенилаланинхинона при участии тирозиназы в полимер включаются различные низкомолекулярные соединения (нехиноны). С учетом этого можно изменять химические и физические свойства меланина, синтезируемого в клетках Е. coli с введенными в них ключевыми генами биосинтеза этого полимера, если добавлять в среду определенные низкомолекулярные соединения в разных количествах.

Микробиологический синтез животного биополимера с адгезивными свойствами

Весьма перспективной представляется также разработка недорогого способа получения белка с адгезивными свойствами, впервые выделенного из мидий Mytilus edulis . Этот водостойкий белок образует очень прочные нити, с помощью которых моллюски прикрепляются к разнообразным поверхностям. Сразу после секреции биополимера так называемой биссаловой железой между полимерными цепями образуются многочисленные поперечные сшивки, что затрудняет определение их аминокислотной последовательности. Это в свою очередь не позволяет установить нуклеотидную последовательность кодирующих их генов и синтезировать гибридизационные зонды. К счастью, удалось выделить внутриклеточный предшественник адгезивного белка (130 кДа-предшественник). Как показали биохимические исследования, он богат серином, треонином, лизином, пролином и тирозином. От 60 до 70% этих аминокислот содержат гидроксильную группу, при этом большинство остатков пролина и тирозина гидроксилированы до 3- или 4-гидроксипролина (Hyp) и 3,4-дигидроксифенилаланина (DOPA) соответственно. Кроме того, после определения аминокислотной последовательности выяснилось, что предшественник состоит в основном из повторяющихся декапептидов Ala-Lys-(Pro или Hyp)-Ser-(Tyr или DOPA)-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys.

Из библиотеки кДНК, которая была получена на основе мРНК, выделенной из биссаловой железы, была изолирована кДНК 130 кДа-предшественника адгезивного белка. И адгезивный белок, и его кДНК обладают весьма необычными свойствами, затрудняющими клонирование и экспрессию соответствующих генов и получение функционального адгезивного белка. Во-первых, кДНК содержит большое число повторов, что повышает частоту гомологичной рекомбинации и вероятность утраты части клонированной последовательности. Во-вторых, поскольку примерно 70% всех аминокислот белка приходится на долю пролина, лизина и тирозина, вряд ли его удастся получить в большом количестве вследствие ограниченности внутриклеточного пула аминоацил-тРНК.

Чтобы преодолеть все эти трудности, полноразмерную кДНК адгезивного белка или ее фрагменты встроили в дрожжевые экспрессирующие векторы и ввели эти векторы в дрожжевые клетки. После экспрессии были получены новые активные формы адгезивного белка мол. массой от 20 до 100 кДа, причем на их долю приходилось от 2 до 5% суммарного количества клеточных белков. Значительно более высокого уровня экспрессии удалось достичь после того, как был химически синтезирован ген адгезивного белка. Используя повторы ДНК, кодирующие декапептид адгезивного белка, создали синтетический ген длиной 600 п. н., который кодировал белок мол. массой примерно 25 кДа. Его основная повторяющаяся единица длиной 30 п. н. состояла из кодонов, оптимальных для экспрессии в Е. coli , а эффективная экспрессия происходила, когда он находился под контролем промотора фага Т7. Большинство микроорганизмов обладают лишь ограниченной способностью осуществлять посттрансляционное гидроксилирование аминокислот, так что образующийся белок бывает не до конца гидроксилирован. Так, некоторые из его тирозиновых остатков не превращаются в DOPA, что снижает число образующихся поперечных сшивок. Чтобы решить эту проблему, была создана система гидроксилирования in vitro, в которой бактериальная тирозиназа в присутствии аскорбиновой кислоты гидроксилировала остатки тирозина. Аскорбиновую кислоту добавляли в реакционную смесь для того, чтобы предотвратить окисление остатков DOPA в о-хинон. Этот процесс должен строго контролироваться, поскольку он приводит к сшиванию субъединиц адгезивного белка. Как и многие другие клеи или адгезивы, адгезивный белок необходимо активировать непосредственно перед использованием.

При окислении предшественника адгезивного белка и образовании сшивок белок может связываться с разнообразными поверхностями — из стекла, полистирола, коллагена и т. д. Прочность и специфичность связывания можно изменять добавлением к смеси адгезивных белков до окисления и образования сшивок других белков. Это позволяет создавать клеи с уникальными свойствами, в том числе и такие, которые можно будет использовать в медицине, в частности в стоматологии.

Микробиологический синтез каучука

Натуральный каучук, цис-1,4-полиизопрен, -это широко используемый биополимер, который получают из различных растений. Его биосинтез начинается с превращения простых сахаров и включает 17 ферментативных реакций. В ходе последней из них происходит полимеризация изопентенилпирофосфата с образованием аллилпирофосфата.

Ввиду большой коммерческой ценности каучука были проведены исследования, направленные на то, чтобы выяснить, можно ли использовать для его получения рекомбинантные микроорганизмы. Прежде всего с помощью мРНК из растения Hevea brasiliensis , синтезирующего каучук, была создана соответствующая кДНК-библиотека. Затем проведена гибридизация с коротким ДНК-зондом, синтезированным исходя из данных об аминокислотной последовательности одного из участков молекулы полимеразы каучука. Для того чтобы доказать, что клонированная кДНК действительно кодирует этот фермент, использовали антитела к очищенному ферменту. Теперь, используя этот клон кДНК, а также, возможно, другие гены биосинтеза каучука, можно попытаться синтезировать натуральный каучук микробиологическими методами. С другой стороны, с помощью этой кДНК можно также получить полимеразу каучука и создать каталитическую систему in vitro. В любом случае исследования, которые могли бы привести к разработке нового пути биосинтеза каучука имеет смысл продолжить.

Микробиологический синтез полигидроксиалканоатов

Полигидроксиалканоаты — это биодеградируемые полимеры, синтезируемые множеством микроорганизмов (прежде всего Alcaligenes eutphus ) и использующиеся ими как внутриклеточный источник углерода и энергии. Они обладают разными свойствами в зависимости от состава и могут применяться для получения биодеградируемых пластмасс, используемых, например, для изготовления упаковочного материала. По оценкам, годовой объем продаж биодеградируемых пластмасс составляет примерно 1,3 млрд. долларов.

Из всех полигидроксиалканоатов наиболее полно изучена и охарактеризована поли(3-гидроксимасляная кислота). Это относится как к самому полимеру, так и к кодирующим его синтез генам A . eutrophus . Поли(3-гидроксимасляную кислоту), ее сополимер поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) и другой полиоксиалканоат, поли(3-гидроксивалериановую кислоту), получают в Великобритании в промышленном масштабе ферментацией при участии A . eutrophus .

Однако этот микроорганизм растет относительно медленно и использует лишь ограниченное число источников углерода, что делает производство довольно дорогим. Можно использовать другой путь: при перенесении генов биосинтеза этого полимера в Е. coli получаются быстрорастущие трансформанты, накапливающие в большом количестве (до 95% сухой массы клетки) поли(3-гидроксимасляную кислоту). Поли(3-гидроксимасляная кислота) синтезируется из ацетил-СоА в три стадии, катализируемые тремя разными ферментами. Оперон, содержащий эти гены, был встроен в плазмиду в составе фрагмента длиной 5,2 т.п.н., однако в отсутствие селективного давления, например при росте в отсутствие антибиотиков, примерно половина клеток Е. coli теряла данную плазмиду уже после 50 генераций. Это не очень существенно, когда  масштабы культивирования малы, но становится серьезной проблемой при крупномасштабной или непрерывной ферментации. Чтобы обойти эту трудность, в плазмиду, несущую оперон поли (3-гидроксимасляной кислоты), встроили локус ра r В из другой плазмиды, который обеспечивал стабилизацию плазмид, обусловливая гибель клеток, не содержащих плазмиды после сегрегации. Модифицированные плазмиды оставались стабильными даже при конститутивном синтезе поли (3-гидрокси-масляной кислоты). Трансформанты Е. coli , синтезирующие данный продукт, образовывали лишь очень небольшое количество ацетата, гибельного для клеток, по-видимому, вследствие того, что весь избыточный ацетил-СоА превращался в поли(3-гидроксимасляную кислоту), а не в ацетат. Еще одно преимущество синтеза поли(3-гидроксимасляной кислоты) в Е. coli состоит в том, что когда ее экстрагируют щелочным раствором хлорноватистокислого натрия (калия), то она разлагается в меньшей степени, чем при экстракции из A . eutrophus . По-видимому, это связано с тем, что большая часть полимера, синтезируемого в Е. coli , находится в кристаллическом виде, в то время как в A . eutrophus — в аморфном. При этом полимеры, получаемые этими двумя способами, идентичны.

Поли (3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) аналогичен по своим свойствам широко использующемуся полипропилену, так что получение его микробиологическими методами может представлять коммерческий интерес. Однако штаммы Е. соli, в которых экспрессируются гены биосинтеза полимера, синтезируют только поли(3-гидроксимасляную кислоту), а не сополимер. Эту проблему можно решить, используя для экспрессии клетки Е. coli , несущие мутации в fadR и atoC . fadR ответствен за негативную регуляцию биосинтеза жирных кислот, a atoC — за позитивную регуляцию их поглощения. Роль локуса fadR в индукции биосинтеза сополимера неясна, но продукт гена а t оС влияет на синтез белков, кодируемых генами atoA и atoD и облегчающих поглощение бактериями пропионата из культуральной среды. Последний превращается в пропионил-СоА и затем реагирует с ацетил-СоА с образованием 3- кетовалерил-СоА, который в свою очередь может превращаться в 3-гидроксивалерил-СоА, включаемый в сополимер.

 

Заключение

Бактерии можно не только использовать как «фабрики» для синтеза белков типа рестриктаз, но и получать с их помощью новые продукты, изменяя метаболизм бактериальных клеток введением в них чужеродных генов или модификацией уже существующих. Можно создавать рекомбинантные микроорганизмы, способные синтезировать самые разные низкомолекулярные соединения: L-аскорбиновую кислоту, краситель индиго, аминокислоты, антибиотики, мономерные единицы различных биополимеров. Общая стратегия при этом состоит во введении в организм хозяина-специфических генов, клонированных в подходящем векторе, которые кодируют один или несколько ферментов, катализирующих не свойственные микроорганизму метаболические реакции или влияющих на осуществляемый им в норме биосинтез определенных соединений. По имеющимся данным, создание новых метаболических путей не является технически неосуществимым. Этот подход поможет создать необычные, более эффективные пути синтеза самых разных соединений.

 

УЛЬЯНОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

 

 

ЛЕКЦИИ ПО КУРСУ: БИОТЕХНОЛОГИЯ

ДЛЯ СТУДЕНТОВ ФАКУЛЬТЕТОВ: ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ, БИОТЕХНОЛОГИИ 

 

 

Подготовлен для печати:

д.б.н. Васильевым Д.А.

 к.в.н. Золотухиным С.Н.

д.б.н. Щербаковым А.А.

         к.б.н. Молофеевой Н.И.

 

                                                        

 

                                                     

 

УЛЬЯНОВСК 2005

 

УДК 619 : 616

 

 Д.А. ВАСИЛЬЕВ, С.Н.ЗОЛОТУХИН, А.А.ЩЕРБАКОВ, Н.И. МОЛОФЕЕВА

 

УЧЕБНО – МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ  ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ БИОТЕХНОЛОГИИ

                  

                                    

 

Данное учебное пособие подготовлено: д.б.н. Васильевым Д.А.,