Наявність домашніх птахів на птахофабриках АР Крим та коротка характеристика місць мешкання диких птахів, рекомендованих Європейською комісією для дослідження на пташиний грип. Створені нами карти-схеми наявності поголів’я птахів на птахофабриках АР Крим та спеціалізації птахогосподарств України свідчать, що значна кількість поголів’я птахів утримується на промислових птахофабриках. Масові сезонні міграції пернатих сприяють виникненню безпосередніх контактів між дикими та домашніми птахами. Порушення технології вирощування птахів на промислових підприємствах може також зумовити контакти диких та синантропних птахів з промисловими. Дикі та синантропні птахи можуть бути джерелом та резервуаром збудника пташиного грипу для домашніх і промислових птахів. Європейською комісією рекомендований перелік диких та синантропних видів птахів, які можуть бути носіями вірусу грипу. Відповідно до переліку ми проаналізували наявність перелітних видів птахів у АР Крим. Нами наведена стисла характеристика довкілля, біології та місць проживання диких птахів на півдні України. Описані представники 7 родин (25 видів) перелітних та зимуючих диких птахів, зареєстрованих у районі оз. Сиваш (Костин А.В., 1983; Андрущенко А.Н. и соавт., 1999). Із наведених видів птахів найбільш поширені озерна чайка – 80 000 екз., крижень – 62 300 екз., чирок-тріскунок – 51 896 екз., поганка – 50 438 екз., великий баклан – 29 000 екз., червоноголова чернь – 18 018 екз., біла чапля – 15 225 екз., основним кормом яких є рачки, личинки комах, молюски і риби (бички, тарань, карась, сазан). У значно меншій кількості (500–2000 екз.) у Криму зустрічаються такі перелітні та зимуючі птахи: чирок-свистунок, широконоска, чибіс, турухтан, чернь чубатий, лебідь-шипун, звичайний шпак, у кормі яких наявні тваринні та рослинні компоненти. Чисельність інших птахів у оз. Сиваш коливається від 200 до 500 екз. (білий лелека – 201, білолобий гусак – 250, сіра качка – 479, свищ – 360, перепілка – 300, деркач – 300, чорноголовий хохотун – 478, грак – 300).

Наведений перелік птахів свідчить про їх надзвичайне видове різноманіття, сконцентроване на відносно обмеженій території, що забезпечує можливість тісного міжвидового контакту та створює умови для тривалої циркуляції й пасажування різноманітних патогенів, зокрема збудника пташиного грипу. Види диких птахів, що годуються водними мешканцями, слід досліджувати при аналізі зон підвищеного ризику, пов’язаного з неблагополуччям з пташиного грипу.

Ураження птахів різних видів вірусом грипу в регіонах України. Моніторингові дослідження на грип птахів в Україні почали проводити з 2003 року. В 2003 році було досліджено в РЗГА 3700 сироваток крові птахів, із них виявлено серопозитивних (до гемаглютиніну Н₆): всього 3 голови у Херсонській області. В 2004 році було досліджено 20513 птахів різних видів і категорій. При цьому антитіла були виявлені до Н₂ та Н₆ в 107 пробах сироваток крові. В 2005 році було досліджено 91861 голів. Антитіла були виявлені в 148 пробах сироватки крові. При цьому у 18 пробах виявлено антитіла до H₅, а в інших пробах – до H₂ та H₉. В 2006 році було досліджено на грип 307024 проби, в т.ч. диких птахів – 17104, синантропних птахів – 15890, птахів приватного сектору – 168274 та птахів у птахогосподарствах – 105756 проб. У першому півріччі 2007 року досліджено 144967 проб сироватки крові і виявлено 31 серопозитивну пробу до H₂ та H₉ в АР Крим, Полтавській, Харківській, Херсонській, Тернопільській та Черкаській областях.

Серед водоплавних птахів різних видів провідне місце за кількістю та різноманітністю ізольованих вірусів грипу посідають птахи підряду гусеподібних. Але сприйнятливість птахів різних видів одного ряду до вірусів грипу може відрізнятися. В екологічному відношенні серед диких видів птахів, від яких були ізольовані віруси грипу, домінують види, що надають перевагу водним та навколоводним місцям проживання (дикі гуси, дикі качки, лиски, баклани). Птахи виду дрозд роблять гнізда в сухих рівнинних місцях, а вид павичі – в місцях проживання, без обов’язкової наявності великих водойм. Можна припустити, що таксономічна та екологічна гетерогенність диких птахів, які є носієм вірусу грипу на території України, пояснюється наявністю великої кількості водойм, які придатні для гніздування птахів. Очевидно, гетерогенність диких птахів може бути дуже сприятливою умовою для реасортації геномів різних штамів вірусу грипу.

Вивчення антигенної структури високопатогенного штаму вірусу грипу Н₅N₁, виділеного в період епізоотії хвороби у 2005–2006 роках. На півдні України епізоотичний спалах високопатогенного пташиного грипу (ВППГ) був зареєстрований у листопаді 2005 р. у господарствах приватного сектору серед курей, індиків, качок та гусей. Аналіз патологічного матеріалу показав, що ізолят збудника, виділеного в Криму “А/chiken/Crimea/1/2005(H₅N₁)”, що викликав епізоотію, споріднений вірусу А H₅N₁, який був виділений раніше від хворих птахів у Росії, Китаї та Монголії. За геном гемаглютиніну спорідненість їх становила від 99,2 до 99,8 %, а за геном нейромінідази – від 99,5 до 99,7 %.

Результати досліджень патологічного матеріалу від хворих птахів із Криму в референтних ветеринарних лабораторіях VLA (Вейбрідж, Англія), Федеральної державної установи “Федеральний центр охорони здоров’я тварин” (Володимир, Росія) і Федеральної державної установи “Центральний науково-дослідний інститут епідеміології” (Москва, Росія) підтвердили наявність високопатогенного вірусу пташиного грипу (ВПВПГ) H₅N₁, який зумовив епізоотію у цей період (табл. 1).

Таблиця 1 – Дослідження на високопатогенний грип птахів

Подальші спалахи ВППГ (до 16.07.2006 р.) серед приватних та диких птахів у Одеській, Херсонській, Сумській областях, а також у м. Феодосія, діагноз хвороби яких контролювався референтними лабораторіями, засвідчив про циркуляцію раніше виділеного штаму “А/chiken/Crimea/1/2005 (H₅N₁)”.

Молекулярно-генетичними дослідженнями не було виявлено мутантів цього штаму вірусу, які містили б комплементарні до епітелію людини рецептори, а також тих, що були резистентні до лікувальних препаратів (ремантодину, амантодину та озельтамівіру).

Одержані дані дозволили створити карту-схему поширення високопатогенного грипу птахів територією України за період 2005–2006 рр. (рис. 1).

На карті зазначені епізоотичні вогнища високопатогенного пташиного грипу, які були виявлені в АР Крим, Одеській, Херсонській та Сумській областях.

Молекулярно-генетичний аналіз вірусу пташиного грипу, виділеного із системи оз. Сиваш. У листопаді 2006 – квітні 2007 року нами були здійснені експедиційні виїзди та відбір проб матеріалу (мотиль, мул, креветки, пеленгас) з місць, де спостерігалось захворювання диких птахів у травні 2006 року. Вищезазначені проби досліджували у ПЛР у реальному часі і проби, у яких ПЛР давала позитивний результат, були використані для зараження та проведення трьох пасажів на курячих ембріонах. Результати проведених досліджень матеріалу на наявність високопатогенного вірусу пташиного грипу А H₅N₁ наведені в табл. 2. З неї видно, що спостерігалась загибель курячих ембріонів, які були заражені пробами патологічного матеріалу від мотиля, алантоїсна рідина яких виявилась позитивною в ПЛР (А/H₅N₁). При дослідженні в ПЛР позитивними також виявились проби зразків із пеленгаса та мулу, а проби із креветок дали негативний результат.

Фрагменти ПЛР позитивного зразка від мотиля клонували у плазмідний вектор та визначали їх нуклеотидну послідовність. На підставі трьох сіквенсів ізоляту пташиного грипу був проведений філогенетичний аналіз. У подальшому, використовуючи веб-браузер BLAST-P, проведено пошук по базах даних GenBank, EMBL, BDBI та PDB, найбільш споріднених до визначеного нами фрагмента вірусу пташиного грипу, амінокислотних послідовностей інших ізолятів вірусу.

Таблиця 2 – Дослідження матеріалу із ставів оз. Сиваш на наявність вірусу високопатогенного грипу H ₅ N ₁

Примітки: 1. У цій та наступних таблицях: (+) – позитивний результат дослідження; (–) – негативний результат дослідження;

2. НД – матеріал не досліджували.

На підставі одержаних результатів були побудовані філогенетичні дерева і встановлено наявність нового ізоляту штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H₅N₁)”. З’ясувалось, що цитопатична дія нового штаму (визначали шляхом зараження моношарових культур фібробластів ембріонів курей) проявлялась через 48 годин та завершувалась впродовж 72-х годин. Титр вірусовмістимої рідини штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H₅N₁)” на культурі курячих фібробластів становив 10^5,9ЦПД _50/0,1см³, а на курячих ембріонах − 10^8,45ЕЛД _50/0,1см³.

Зміни гістоструктури курячих ембріонів, заражених вірусом грипу штаму “А(chironomida)Azov/11/2006/(H₅N₁)”. Встановлено, що виділений нами штам “А(chironomida)Asov/11/2006 /(H₅N₁)” у трьох проведених пасажах на курячих ембріонах проявляє цитопатогенну дію і зумовлює загибель ембріонів через 48 годин. Патогенна дія у ембріонів проявляється ураженнями головного та спинного мозку, мозкових оболонок, що формуються, та ендотелію кровоносних судин, які мають запальний характер. Також відмічається розвиток жирової дистрофії гепатоцитів та зернистої дистрофії нефроцитів.

Одержані результати прояву патогенної дії підтверджують належність цього штаму до високопатогенного вірусу грипу птахів.

Морфофункціональні зміни в організмі риб, заражених вірусом грипу штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H₅N₁)”. Після введення коропам у черевну порожнину вірусовмістимого матеріалу, відібраного від мотиля, впродовж всього досліду загибелі риб не реєстрували, а також були відсутні клінічні та патолого-анатомічні ознаки захворювання (табл. 3).

Таблиця 3 – Виявлення присутності вірусу та визначення вірусної активності в гомогенатах тіла коропів

Зразками гомогенатів від позитивних у ПЛР риб були заражені 10-добові курячі ембріони. Загибель курячих ембріонів реєструвалась через 3 доби. Після утримання інфікованих риб і подальшому відборі з них через 5−10 діб патологічного матеріалу та його інокуляції не відмічали загибелі ембріонів, і не було встановлено наявність вірусу за допомогою ПЛР. Як видно з табл. 3, в організмі коропа патогенний вірус грипу птахів зберігався протягом 3-х діб.

За період проведення експериментів (10 діб) не спостерігалось достовірного зниження маси, довжини, вгодованості, морфологічних та біохімічних показників крові (еритроцити, лейкоцити, вміст білка та лізоциму в сироватці) в дослідних групах риб порівняно з контрольними особинами. Той факт, що в організмі риб достовірно (Р<0,05) підвищилися бактеріцидна активність сироватки крові та вміст лізоциму у відповідь на інокуляцію вірусу, свідчить про їх стійкість до цього патогену. Очевидно, риби можуть бути резервуаром збудника пташиного грипу та брати участь у формуванні водних природних вогнищ цієї хвороби.

Медична п’явка – можливий резервуар та біотранспортер вірусу грипу птахів. Нами встановлено, що вірус пташиного грипу, інокульований у п’явку, здатний зберігатись у ній впродовж 45 діб та проявляти високу патогенність. Зниження інфекційної активності та виживання вірусу пташиного грипу залежить від його концентрації та часу перебування в організмі п’явки (табл. 4).

Таблиця 4 – Експериментальне зараження медичної п’явки вірусом пташиного грипу та курячих ембріонів

Так, через 5 діб після інокуляції вірусної суспензії в титрах 10^8,45 ЕЛД_50/0,1см³ , та в розведені 1:10 (10^7,45 ЕЛД_50/0,1см³), 1:100 (10^6,45 ЕЛД_50/0,1см³) та 1:1000 (10^5,45 ЕЛД_50/0,1см³) відповідно спостерігали загибель курячих ембріонів на 2–3 добу. В розчині 1:1000 хоч і була виявлена позитивна ПЛР, але не відбувалось загибелі курячих ембріонів. Через 45 діб суспензії п’явок викликали загибель курячих ембріонів на 3-ю добу (нерозведений та розведений 1:10 матеріал відповідно).

Таким чином, виділено новий високопатогенний штам “А(chironomida) Azov/11/2006/(H₅N₁)”, який викликає загибель курячих ембріонів через 48 годин, а також зумовлює ЦПД у культурі курячих фібробластів. Цей штам до 3-х діб зберігається в організмі риб і до 45 діб – в організмі п’явок, не втрачаючи вірулентності, його було депоновано нами в ДНКІ БШМ з метою використання при створенні сучасних засобів діагностики та профілактики високопатогенного грипу птахів.

Розробка інтегральної системи контролю за спалахами пташиного грипу в Україні. Розроблена і впроваджена електронна інтегральна система контролю за спалахами пташиного грипу в Україні. В її основу було покладено результати наших власних досліджень і спостережень, а також результати аналізу відповідних літературних повідомлень щодо проблеми ортоміксовірусної інфекцій в гуманній і ветеринарній медицині. При розробці та організації протиепізоотичних заходів проти грипу птахів слід розрізняти епізоотичний осередок, неблагополучний пункт, зону загрози і зону нагляду. Глибина зони нагляду становить не менше 10 км від меж неблагополучного пункту. Розроблена нами інтегральна електронна система контролю за спалахами пташиного грипу в Україні дозволяє в будь-який час визначити межі епізоотичного вогнища, межі неблагополучного пункту, зону загрози, зону спостереження та проводити в них належні заходи діагностики, профілактики, оздоровлення від грипу птахів. Також електронна інтегральна система передбачає процедуру зняття карантину, обмежувальних заходів та захист персоналу, задіяного в проведенні спеціальних заходів щодо ліквідації захворювання птахів на грип.

Організація своєчасної діагностики грипу птахів та проведення знищення поголів’я птахів (стемпінг-аут) сприяли оздоровленню неблагополучних територій України від цієї небезпечної хвороби.