Дослідження виконувались з 2003 по 2007 рік у науковій лабораторії кафедри мікробіології, вірусології та епізоотології Державного вищого навчального закладу “Державний агроекологічний університет”, у Центральній державній лабораторії ветеринарної медицини, а також у референтних центрах з вивчення грипу птахів VLA (Вейбрідж, Англія), Федеральній державній установі “Федеральний центр охорони здоров’я тварин” (Володимир, Росія) і Федеральній державній установі “Центральний науково-дослідний інститут епідеміології” (Москва, Росія).

Епізоотологічний моніторинг грипу птахів проводився серед різних видів птахів у різних областях України та АР Крим. У 2003–2006 роках було досліджено на грип птахів 423098 проб. Згідно з рекомендаціями МЕБ діагноз на грип птахів встановлювали комплексно з врахуванням результатів епізоотологічних, клінічних, патолого-анатомічних та лабораторних (РГА, РЗГА, ПЛР та ІФА) методів досліджень. Для досліджень на грип відбирали свіжі трупи та хвору птицю у кількості не менше п’яти голів з кожної групи, підозрілої у захворюванні (Manual of diagnostic tests, 2004). Для вірусологічних досліджень відбирали проби змивів з глотки та клоаки, внутрішні органи (легені, трахею, селезінку, печінку, повітроносні мішки) та головний мозок. Для проведення ретроспективної діагностики відбирали не менше 25 проб сироваток крові від однієї групи птахів.

Проби змивів доставляли до лабораторії для проведення вірусологічних (ізоляція вірусу на курячих ембріонах з наступною ідентифікацією) та молекулярно-генетичних досліджень. Для деконтамінації змивів до середовища 199, в якому їх транспортували, додавали антибіотики (4 %-й розчин гентаміцину сульфату, 1000 мкг/см³). Для транспортування проби (змиви, шматочки внутрішніх органів) спочатку охолоджували до +4 єС, а потім заморожували в морозильнику до –20 єС, після чого в термосах з сухим льодом доставляли до лабораторії. Для ізоляції та типізації вірусу грипу із відібраних проб органів та тканин ураженої птиці готували гомогенати 1:10 на 0,9 %-му розчині NaCl або фосфатному буфері (рН 7,2–7,4) з додаванням пеніциліну та стрептоміцину. Одержані гомогенати звільняли від часток тканин центрифугуванням та використовували для зараження курячих ембріонів (Сюрин В.Н. та ін., 1998).

Зразками вірусовмістимої рідини заражали 10-добових курячих ембріонів, з розрахунку не менше 5 ембріонів на одну пробу. Зараження проводили в алантоїсну порожнину. Інфіковані ембріони інкубували при +41 єС упродовж 3–5 діб. У разі наявності вірусу в пробі, загибель наставала через 48–72 години після зараження. Ембріони, що загинули, розтинали, описували наявні ознаки пошкоджуючої дії патогена та відбирали алантоїсну рідину для подальшого дослідження в РГА. Після закінчення терміну інкубації, навіть за відсутності випадків загибелі, ембріони розтинали, відбирали алантоїсну рідину, гемаглютинуючу активність якої визначали у реакції гемаглютинації з 1%-ю суспензією еритроцитів півня. У разі відсутності позитивної реакції в РГА додатково проводили 3−5 “сліпих” пасажів.

З матеріалу, відібраного в місцях скупчення диких птахів у системіоз. Сиваш, проводили ізоляцію, остаточну ідентифікацію та молекулярно-генетичну оцінку вірусу пташиного грипу. Матеріалом для досліджень були проби (по 5 зразків кожного об’єкта) − пеленгас (Mugil soiuy), креветка (родина Сrangon), личинка комах (родина Chironomida – мотиль) та мул, що відібрані в різних ділянках північно-західної акваторії Азовського моря (оз. Сиваш – Кризамі, Костін Шпиль та Любимівка). Геномну РНК для ПЛР-аналізу виділяли гуанідін тіоціонатним методом (Chomczynski P. and Sacchi N., 1989).

Аналіз проводили за допомогою діагностичної тест-системи “Птах–Грип–ПЛР–РЧ” для виявлення РНК вірусу пташиного грипу А/H₅N₁ методом полімеразної ланцюгової реакції у режимі реального часу, ТУ 24.4–23524007–064–2006, серія 001/AIV/RG–100, згідно з настановою з використання діагностичного набору. Кожен зразок досліджували у двох повторах. Ампліфікацію у реальному часі проводили в реактивній суміші об’ємом
25 мкл. Ампліфікацію кДНК мішені здійснювали на приладі Rotor-Gene 3000, Corbett research (Австралія), з таким температурним профілем: активація урацил-ДНК-глікозидази – 5 хв при +50 °С, активація ДНК-полімерази – 10 хв при +94 °С та наступні 40 циклів ампліфікації, які включали денатурацію – 30 с при +94 °С, відпал праймерів – 30 с при +58 °С, елонгацію – 30 с при +72 °С. Аналіз результатів здійснювали за допомогою програмного забезпечення RG operating software, version 6.0.33.

Визначення нуклеотидної послідовності продуктів ампліфікації вірусу пташиного грипу проводили на генетичному аналізаторі ABI 3130 (Applied Biosystems) із використанням набору реагентів “BigDye®terminator, v.3,1”, згідно з інструкціями виробника. ПЛР-продукти клонували у бактеріальний вектор pBluescript II SK+(Stratagene) за загальноприйнятими методами генної інженерії (Sambrook J. et al., 1989). Визначення нуклеотидної послідовності продуктів ампліфікації вірусу пташиного грипу проводили на генетичному аналізаторі ABI 3130 (Applied Biosystems) із використанням набору реагентів “BigDye®terminator, v.3.1”, згідно з інструкціями виробника. Комп’ютерний аналіз даних проводили з використанням пакета програм Vector NTA v. 9.1 (Invitrogen) та Інтернет-ресурсів: BLAST, ClustalW, WebPhylip.

У частині дослідів вивчали морфофункціональні зміни у риб при експериментальному заражені ізолятом “A(chironomida) Azov/11/2006(H₅N₁)” вірусу грипу птахів. Зараження однорічок коропа (Carpio carpio) здійснювали через ін’єкцію в черевну порожнину вірусовмістимої алантоїсної рідини курячих ембріонів та матеріалу, одержаного із мотиля з титрами в РЗГА 1:64 та в РГА 1:256. Однорічним коропам двох експериментально заражених груп (в кожній по 15 риб) уводили внутрішньочеревно 0,1 та 0,2 см³ ізоляту “A(chironomida)Azov/11/ 2006(H₅N₁)” вірусу грипу птахів, а одній контрольній групі (15 риб) вводили розчин Рінгера. Риб витримували в окремих 10-літрових акваріумах з постійною аерацією та температурою +20±1 єС. З початку досліду кожні 24 години протягом перших 3 діб відбирали з кожної групи по 3 екземпляри, в яких брали кров із серця. Інших коропів досліджували на 5 та 10 добу. З тулуба коропів готували гомогенати, які зберігали при температурі +8±2 єС. З крові одержували сироватку, в якій визначали вміст білка (Loury et al., 1951), білкові фракції (альбумін, глобулін) турбодемитричним методом та активність лізоциму дифузним методом на агарі (Лабінська А.С., 1978). У коропів дослідних та контрольної груп визначали масу, довжину, коефіцієнт вгодованості за Фультоном, абсолютну (мг) та відносну (індекс ‰) масу імунокомпетентних органів (гепатопанкреас, нирка та селезінка). З імунокомпетентних органів виготовляли екстракти тканин (1:50), в яких визначали вміст водорозчинного білка та активного лізоциму. Проводили підрахунок кількості еритроцитів та лейкоцитів у десяти полях зору мікроскопа (при збільшенні − 60Ч7) з одного мазка крові риб та визначали співвідношення кількості лейкоцитів (Л) до кількості еритроцитів (Е) у полі зору − Е/Л (Кушманова О.Д., Івченко Г.М., 1978; Строев Е.А., Макарова П.П., 1986). Через 10 діб у риб дослідної та контрольної груп визначали лізоцим та бактерицидну активність сироватки крові (БАСК) (Смирнова А.В., Кузьмина Г.А., 1966).

В експерименті з вивчення п’явки як можливого компоненту резервуара збудника використали 30 медичних п’явок (Hirudo medicinalis). Зараження проводили алантоїсною рідиною з інфікованих штамом “A(chironomida) Azov/11/2006(H₅N₁)” 10-добових курячих ембріонів. Було сформовано 8 дослідних та 2 контрольні групи п’явок (по 3 екземпляри в кожній). Восьми дослідним групам п’явок внутрішньоцеломно вводили алантоїсну рідину, що містила вірус пташиного грипу в кількості 10^8,45 ЕЛД_50/0,1см³ , 10^7,45 ЕЛД_50/0,1см³, 10^6,45 ЕЛД_50/0,1см³ і 10^5,45 ЕЛД_50/0,1см³ відповідно. П’явкам контрольної групи вводили стерильний 0,9 %-й розчин NaCl. Доза введення 0,125 см³. П’явок утримували у флаконах з водою об’ємом 400 см³, закритих гумовими пробками з отворами. Через 5 та 45 діб після початку експерименту п’явок заморожували, потім розморожували і готували суспензію на стерильному фізіологічному розчині та досліджували методом ПЛР на наявність РНК вірусу пташиного грипу.

Статистичну обробку результатів проводили за загальноприйнятою методикою (Плохинський М.А., 1980), використовуючи комп’ютерну програму Microsoft Office EXCEL.