культивирования и состава среды

На жизнедеятельность дрожжевых клеток оказывают значительное влияние такие факторы внешней среды, как температура, рН, формольное число, аэрация, концентрация осмотических веществ, а также некоторые химические соединения.

Температура. Дрожжи относятся к мезофильным микроорганизмам, температурный оптимум 26–34 °С. В зависимости от расы в диапазоне температур 20–36 °С удельная скорость роста возрастает прямо пропорционально повышению температуры. При температуре выше 36 °С удельная скорость роста сахаромицетов резко падает и практически прекращается при 40 °С. При температуре 45–50 °С дрожжи погибают.

Низкие температуры дрожжи не убивают, но приостанавливают их жизнедеятельность, наступает состояние анабиоза с последующим восстановлением нормальных функций при наступлении благоприятных условий. Дрожжи хорошо переносят минусовые температуры и в замороженном состоянии могут храниться неограниченное время. Оттаивание и повторное замораживание их убивает.

Активная кислотность (рН) и формольное число (ф. ч.). Дрожжи сохраняют жизнеспособность в широких пределах колебания рН — от 2,5 до 6,5. Оптимальная величина рН питательной среды для размножения дрожжей 4,5–5,5.

Формольное число указывает на наличие в среде усвояемого азота, необходимого для формирования белка клетки. Недостаток азота в среде тормозит синтез биомассы; скорость роста дрожжей при этом понижается. Для обеспечения высокой скорости роста дрожжей надо соблюдать оптимальную величину ф. ч. В период интенсивного роста дрожжей ф. ч. составляет: на стадии получения засевных дрожжей 1,0–1,5 см³ 0,1 М NaOH, а товарных 0,7–0,8 см³ 0,1 М NaOH. В случае снижения его в период интенсивного роста до 0,4–0,5 см³ следует срочно вводить в культуральную среду сульфат аммония или аммиачную воду в зависимости от рН среды. В конце процесса ф. ч. понижается до 0,2–0,3 см³, а после дозревания должно составлять 0,1–0,2 см³ 0,1 М NaOH.

Концентрация питательных веществ среды. Скорость роста дрожжей обусловлена осмотическим давлением водорастворимых веществ среды и концентрацией клеточного сока дрожжей. Осмотическое давление внешней среды должно быть ниже, чем осмотическое давление клеточного сока, что способствует усвоению питательных веществ растущей дрожжевой клеткой. Чем больше разница в величине осмотического давления в клетке и в среде, тем быстрее накапливается биомасса клеток. Осмотическое давление клеточного сока повышается при культивировании дрожжей в более концентрированных средах. Осмотическое давление в культуральной среде увеличивается с повышением в ней концентрации сухих веществ.

Концентрацию питательной среды в дрожжевом производстве характеризуют кратностью разбавления, т. е. отношением единицы массы мелассы к количеству массы воды, в которой она растворена. В зависимости от стадии выращивания дрожжей готовят мелассное сусло различной степени разбавления. Так, в начальных стадиях стремятся получить дрожжи физиологически активные, способные к быстрому размножению и сбраживанию углеводов. Поэтому их культивируют в мало разбавленных средах (1:5 ÷ 1:7) при слабой аэрации. В этих условиях часть сахара неизбежно тратится на образование этанола. В конечных стадиях стараются получить возможно больший выход дрожжей и поэтому их выращивают в более разбавленных средах (1:10 ÷ 1:17) при интенсивной аэрации. Содержание сахара в среде должно точно соответствовать скорости размножения дрожжей. С этой целью питательную среду вводят в дрожжерастительный аппарат не единовременно, а притоком, по мере использования ее дрожжами.

Аэрация культуральной среды. Рост дрожжей сопровождается непрерывным потреблением кислорода на дыхание и синтез клеточных веществ. Кислород, растворенный в питательной среде, диффундирует в дрожжевую клетку при разности концентраций его в среде и внутри клетки. Чем быстрее идет потребление кислорода клетками, тем скорее растут дрожжи. Растворимый кислород подавляет спиртовое брожение и активизирует процессы дыхания, при котором дрожжи получают достаточно энергии для биосинтеза. Поэтому в анаэробных условиях культивирования дрожжей преобладает спиртовое брожение с минимальной затратой сахара на биосинтез, а в аэробных условиях, наоборот почти весь сахар тратится на синтез биомассы дрожжей, а спиртовое брожение сводится к минимуму.

На полноценной питательной среде дрожжи выращивают при полном их обеспечении кислородом с аэрацией 100–175 м³/ч воздуха на 1 м³ сусла. Аэрация среды должна быть непрерывной.

Химические вещества. По своему действию на дрожжевые клетки химические вещества можно разделить на две группы: ингибирующие и стимулирующие рост и размножение дрожжевых клеток. К наиболее часто встречающимся в дрожжевом производстве веществам, тормозящим скорость роста, можно отнести сульфиды и сульфиты, фтор, мышьяк, сернистый ангидрид, летучие кислоты и нитриты. На скорость роста дрожжей также отрицательно влияют дезинфицирующие вещества, применяемые в дрожжевом производстве (формалин и др.).

К веществам, активирующим рост и размножение дрожжей и повышающим скорость их роста, относятся кукурузный экстракт, карбоксилин и др.

Требования к составу питательной среды. При выращивании хлебопекарных дрожжей подготавливают питательную среду, обеспечивающую растущие клетки как всеми компонентами, входящими в состав дрожжевой клетки, так и теми веществами, которые способствуют быстрому их росту и размножению.

Для питания микроорганизмов необходимы углерод, азот, фосфор, калий, магний, микроэлементы и ростовые вещества.

Источниками углерода для дрожжей являются различные усвояемые углеводы, моно- и дисахара, а также спирты, альдегиды и органические кислоты.

Азотистым питанием могут быть растворимые соединения азота (органические и неорганические). Сложные высокомолекулярные углеводы и протеины дрожжами не усваиваются, так как в них не содержатся ферменты, гидролизующие эти вещества. Дрожжи усваивают продукты распада белков — аминокислоты, амиды и аммонийные соединения.

Большую роль в жизнедеятельности дрожжей играют макроэлементы (K, Na, P, Mg, Ca) и микроэлементы (Fe, Cu, Mn, Zn, Al и др.), поэтому присутствие их в питательной среде обязательно.

Дрожжам необходимы также ростовые вещества и витамины, особенно биотин.

В дрожжевом производстве питательной средой является осветленный раствор мелассы, растворы питательных солей и ростовых веществ. Соли, содержащие фосфор и азот, добавляют, исходя из того, что готовая продукция должна содержать 6–7 % азота и 3,6–4,4 % Р₂О₅ в пересчете на сухие вещества дрожжей. В качестве источника стимуляторов роста чаще всего используется кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат и дестиобиотин. Кукурузный экстракт добавляют из расчета 6 % к массе мелассы, дестиобиотин — 400 мг на 1 т мелассы. При переработке мелассы с содержанием золы ниже 7 % в среду добавляются калийные и магниевые соли.

На формирование дрожжевых клеток значительно влияет не только общая обеспеченность процесса необходимыми для роста веществами, но и распределение их во время культивирования.

Для получения высоких скоростей роста рекомендовано соли, содержащие калий, магний и микроэлементы, а также ростовые вещества вносить при загрузке дрожжерастительного аппарата, а углеводное, азотное и фосфорное питание вводить постепенно (притоком). Причем необходимо соблюдать равновесие между размножением дрожжей (их приростом) и подачей углеводного, азотного и фосфорного питания, а также аэрацией культуральной среды. Отсутствие сбалансированного питания нарушает формирование ферментных систем клетки, что снижает скорость роста дрожжей и их качество.

Способы выращивания дрожжей

При выращивании дрожжей применяют бесприточный, воздушно-приточный и воздушно-проточный способы, различающиеся режимом подачи питательных веществ, воды, воздуха и продолжительностью процесса.

Бесприточный способ выращивания дрожжей

Этот способ предусматривает подачу всех питательных веществ и воды при загрузке дрожжерастительного аппарата. Культуральную среду либо аэрируют, либо воздух подают периодически в небольшом количестве на протяжении всего периода выращивания дрожжей. По этому способу получают дрожжи чистой культуры (ЧК) в начальных стадиях и первую стадию дрожжей естественно-чистой культуры (ЕЧК).

Воздушно-приточный способ выращивания дрожжей

Данный способ предусматривает выращивание дрожжей в одном дрожжерастительном аппарате с постепенным притоком питательных веществ (мелассы, азот- и фосфорсодержащих солей) и постоянной аэрацией культуральной среды. Такой режим называется периодическим, так как он ограничен во времени. Продолжительность процесса в основном составляет 8–17 ч. Этот способ используют при получении дрожжей ЕЧК и ЧК, а также при выращивании товарных дрожжей.

Объем культуральной среды в аппарате и концентрация дрожжей на протяжении всего процесса не постоянны. В культуральной среде, несмотря на постоянный приток свежей питательной среды, к концу процесса накапливаются продуты жизнедеятельности клеток, тормозящие их рост, что отрицательно влияет на состояние клеток. Скорость роста дрожжей к концу процесса понижается. Периодические процессы, как правило, малопроизводительны.

Воздушно-проточный способ выращивания дрожжей

При этом способе дрожжи выращивают с постоянной аэрацией культуральной среды, постепенным притоком питательных веществ в дрожжерастительный аппарат и одновременным оттоком культуральной среды в отборочный аппарат, т. е. дрожжи выращивают в проточной среде с постоянной концентрацией биомассы в дрожжерастительном аппарате. Этот процесс называют непрерывным. Он протекает в двух дрожжерастительных аппаратах (основном и отборном) и включает в себя два периода: накопительный и проточный (отточный).

Накопительный период протекает в основном в дрожжерастительном аппарате при постоянной подаче питательных веществ, воды и воздуха. Дрожжи растут по закону периодического способа. В своем развитии они проходят лагфазу и фазу логарифмического роста. В дрожжерастительном аппарате к концу периода накапливается рабочая биомасса, количество которой зависит от массообменных характеристик дрожжерастительного аппарата (его конструкции). Затем начинается второй период — период непрерывного роста клеток (проток), во время которого рабочая биомасса непрерывно дает прирост дрожжей, который выводится вместе с культуральной средой из основного дрожжерастительного аппарата в отборочный. Количество среды, отбираемое ежечасно, соответствует (по объему) количеству питательной среды и воды, поступающей в основной дрожжерастительный аппарат, поэтому уровень среды в нем остается постоянным.

В период оттока дрожжи находятся в стадии логарифмического роста. Для достижения высокой продуктивности процесса проток начинают при высокой скорости роста дрожжей, не допуская перехода клеток в стационарную фазу их развития.

При правильно организованном процессе прирост биомассы постоянен, неизменно также и качество продукта, так как процесс стабилизируется. Устанавливается постоянное соотношение клеток по величине и ферментативной активности. Отборочный период не ограничивается во времени при соблюдении следующих условий:

– скорость роста клеток равна скорости разбавления среды;

– дрожжевые клетки обеспечены всеми необходимыми для их жизнедеятельности питательными и ростовыми веществами, а также кислородом;

– непрерывный вывод из основного дрожжерастительного аппарата прирастающей биомассы;

– соблюдение параметров процесса, обеспечивающих оптимальные условия жизнедеятельности клеток.

Стационарная фаза развития дрожжевых клеток в непрерывном процессе наступает только в отборочном аппарате, в который питательные вещества не поступают. Клетки для поддержания жизнедеятельности используют оставшиеся в культурной среде вещества, масса их увеличивается, т. е. проходит процесс дозревания дрожжей.

Трудность в ведении непрерывного процесса на предприятиях состоит в инфицированности культуральной среды вследствие использования нестерильного воздуха, воды, а иногда и питательной среды, что понижает качество готового продукта. В связи с этим продолжительность периода оттоков культуральной среды на предприятиях в настоящее время в основном составляет 12–20 ч.

Непрерывный процесс обеспечивает более высокую скорость роста по сравнению с периодическими процессами. Дегенерации клеток не наблюдается, если дрожжи выращиваются на полноценной питательной среде при полном обеспечении клеток кислородом.

Таким образом, от правильности ведения накопительного периода зависит продуктивность процесса, так как он характеризуется активностью ферментных систем, а от правильности ведения отточного периода — качество готового продукта.