Антитела ( Ат ) — эффекторные молекулы гуморального иммунитета. Синтез антител запускают Аг, поступающие в организм извне (при инфекциях, вакцинации, действии ксенобиотиков) или образующиеся эндогенно. Как правило, AT специфически взаимодействует с комплементарным Аг. Существуют, однако, антитела, взаимодействующие с Аг-детерминантами, общими для различных Аг. Такие антитела известны как перекрёстнореагирующие, или гетероспецифичные.

Структурная единица AT (Ig) — мономер — молекула цилиндрической формы, состоящая из двух идентичных тяжёлых Н-цепей и двух идентичных лёгких L-цепей. Тяжёлые и лёгкие цепи Ig состоят из аминокислотных остатков и соединены дисульфидными (-S-S-) связями. В цепях различают вариабельную область, или V-область, и константную область, или С-область. V-область у разных AT варьирует. V-области L- и Н-цепей образуют Аг-связывающий центр (активный центр AT, паратоп), или Fab-фрагмент. Константная область молекулы называется Fc-фрагмент. В месте соединения Fab- и Fc-фрагментов расположена шарнирная область, позволяющая Аг-связывающим фрагментам разворачиваться для более тесного контакта с Аг.

Fab-фрагменты антитела взаимодействуют с антигенными детерминантами. Аг-связывающий центр комплементарен эпитопу Аг (принцип ключ-замок). Связывание Аг с AT нековалентно и обратимо.

Аффинность (сродство) Аг к антитела определяется физико-химическими свойствами взаимодействующих молекул и соотношением концентраций связанных и свободных Аг и антител. На сродство влияют пространственное соответствие взаимодействующих участков молекул, электростатические, гидрофобные взаимодействия и силы Ван дер Ваальса.

Авидность — интегральная характеристика силы связи между Аг и AT, учитывающая взаимодействие всех активных центров с эпитопами Аг.

Валентность антитела — число активных (Аг-связывающих) центров антитела. Молекула полного Ig как минимум двухвалентна. Такие антитела известны как полные антитела; мономеры с меньшей валентностью — неполные антитела.

Полные антитела (в частности, IgM, lgG) вызывают агрегацию Аг, видимую невооружённым глазом (например, РА бактерий).

Неполные антитела содержат один Аг-связывающий центр и, поэтому, одновалентны (например, антитела, вырабатываемые при бруцеллёзе). Второй Аг-связывающий центр у подобных Ig экранирован различными структурами либо обладает низкой авидностью. Неполные антитела функционально дефектны, так как не способны агрегировать Аг. Неполные AT могут связывать эпитопы Аг, препятствуя контакту с ними полных антител; поэтому их также называют блокирующими антителами.

Взаимодействие антител с антигеном включает специфическую и неспецифическую фазы.

• Специфическая фаза протекает быстро и представляет специфическое взаимодействие активного центра с Аг.

• Неспецифическая фаза протекает медленнее, зависит от присутствия электролитов и свойств Аг.

Корпускулярные Аг агрегируются в крупнодисперсные конгломераты и выпадают в осадок (феномен агглютинации).

Растворимые Аг образуют мелкодисперсные конгломераты (феномен преципитации), проявляющиеся помутнением раствора или образованием колец преципитации либо зон преципитации в гелях.

21. Монорецепторные агглютинирующие сыворотки. Диагностикумы.

Агглютинирующие сыворотки применяются при идентификации микроба в развернутой реакции агглютинации. Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы.

Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки обладают высоким титром — до 1:12 800 — 1:25 600.

Недостатком таких сывороток является то, что они способны давать групповые реакции агглютинации, так как они содержат антитела к бактериям, имеющим общие антигены в пределах семейства, группы и рода.

Поэтому в настоящее время большинство агглютинирующих сывороток выпускаются адсорбированными, монорецепторными и адсорбированными поливалентными, содержащими только типовые или видовые антитела и соответствующими или определенному типу или виду микроорганизма. Эти сыворотки не подлежат разведению.

Агглютинирующие сыворотки

При идентификации микробов, наряду с определением морфологических, культуральных и биохимических свойств их, широко используются диагностические агглютинирующие сыворотки. Агглютинацией называется склеивание микробов, скучивание их под влиянием специфических антител - агглютининов, содержащихся в иммунной сыворотке.
Реакция агглютинации в настоящее время является наиболее часто применяемой, нередко единственной в смысле определения и выделения различных видов из группы морфологически неотличимых бактерий. Микробная клетка является сложным комплексом антигенов, что является причиной так называемой групповой агглютинации, выражающейся в том, что иммунная сыворотка агглютинирует не только гомологичный микроб, но и другие бактерии из той же группы. Групповая агглютинация затрудняет определение вида выделенного микроба и серологическую диагностику заболевания.

Агглютинирующие сыворотки

Агглютинирующую сыворотку получают иммунизацией кроликов (внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно) взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7—8 дней после последней иммунизации берут кровь и определяют титр антител. Титром агглютинирующей сыворотки называется то максимальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствующим микроорганизмом.

Диагностикумы — взвеси убитых микробов, которые служат в качестве антигенов при серологических исследованиях и аллергенов для аллергических диагностических проб.
Диагностикумы нашли широкое применение при диагностике брюшного тифа,паратифов, дизентерии, бруцеллеза, туляремии, риккетсиозов, лептоспирозов. Они используются также для постановки РСК (реакции связывания комплемента) при серологической диагностике лептоспирозов. Для диагностики брюшного тифа применяют так называемый О-диагностикум (для обнаружения групповых, О-антител) и Н-диагностикум (для обнаружения видовых, Н-антител). Для постановки реакции агглютинации большинство диагностикумов консервируются 0,1—0,2% раствором формалина. Диагностикумы из риккетсий и лептоспир консервируют фенолом. При постановке опсоцо-фаго-цитарной реакции используются диагностикумы из микробов, убитых нагреванием.
В вирусологии в качестве диагностикумов используют антигены для РСК и антигены для РТГ (реакции торможения гемагглютинации).
Вирусные диагностикумы подвергают обработке с целью снижения антикомплементарных свойств — обработка физическими (повторное замораживание и оттаивание) и химическими (воздействие эфира и хлороформа) методами.

22. Реакция агглютинации и ее варианты (бактериальная РА, РНГА, коагглютинация, ла-текс-агглютинация).

Реакция агглютинации (РА)

Благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности, реакция агглютинации получила широкое распространение в микробиологической практике для диагностики многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция Вейгля) и др.

Реакция агглютинации основана на специфичности взаимодействия антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками (агглютиногенами). В результате такого взаимодействия образуются частицы – агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

В реакции агглютинации могут участвовать как живые, так и убитые бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, риккетсии, а также эритроциты и другие клетки.

Реакция протекает в две фазы: первая (невидимая) – специфическая, соединение антигена и антител, вторая (видимая) – неспецифическая, склеивание антигенов, т.е. образование агглютината.

Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой антигена.

Реакция агглютинации, как и любая серологическая реакция, протекает в присутствии электролитов.

Внешне проявление положительной реакции агглютинации имеет двоякий характер. У безжгутиковых микробов, имеющих только соматический О- антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток. Такая агглютинация называется мелкозернистой. Он происходит в течение 18 – 22 часов.

У жгутиковых микробов имеются два антигена – соматический О- антиген и жгутиковый Н- антиген. Если клетки склеиваются жгутиками, образуются крупные рыхлые хлопья и такая реакция агглютинации называется крупнозернистой. Она наступает в течение 2 – 4 часов.

Реакцию агглютинации можно ставить как с целью качественного и количественного определения специфических антител в сыворотке крови больного, так и с целью определения видовой принадлежности выделенного возбудителя.

Реакцию агглютинации можно ставить как в развернутом варианте, позволяющем работать с сывороткой разведенной до диагностического титра, так и в варианте постановки ориентировочной реакции, позволяющем в принципе обнаружить специфические антитела или определить видовую принадлежность возбудителя.

При постановке развернутой реакции агглютинации, с целью выявления в сыворотке крови обследуемого специфических антител, исследуемую сыворотку берут в разведении 1:50 или 1:100. Это обусловлено тем, что в цельной или мало разведенной сыворотке могут находиться нормальные антитела в очень высокой концентрации, и тогда результаты реакции могут быть неточными. Исследуемым материалом при этом варианте постановки реакции является кровь больного. Кровь берут натощак или не ранее чем через 6 часов после еды (в противном случае в сыворотке крови могут быть капельки жира, делающие ее мутной и непригодной для исследования). Сыворотку крови больного обычно получают на второй неделе заболевания, набирая стерильно из локтевой вены 3 – 4 мл крови (к этому времени концентрируется максимальное количество специфических антител). В качестве известного антигена используется диагностикум, приготовленный из убитых, но не разрушенных микробных клеток конкретного вида с конкретной антигенной структурой.

При постановке развернутой реакции агглютинации с целью определения видовой, типовой принадлежности возбудителя, антигеном является живой возбудитель, выделенный из исследуемого материала. Известными являются антитела, содержащиеся в иммунной диагностической сыворотке.

Иммунную диагностическую сыворотку получают из крови вакцинированного кролика. Определив титр (максимальное разведение, в котором обнаруживаются антитела), диагностическую сыворотку разливают по ампулам с добавлением консерванта. Эту сыворотку и используют для идентификации по антигенной структуре выделенного возбудителя.

При постановке ориентировочной реакции агглютинации на предметном стекле используют сыворотки с большей концентрацией антител (в разведениях не более чем 1:10 или 1:20).

Пастеровской пипеткой наносят на стекло по одной капле физиологического раствора и сыворотки. Затем к каждой капле добавляют петлей небольшое количество микробов и тщательно размешивают до получения гомогенной взвеси. Через несколько минут при положительной реакции в капле с сывороткой появляется заметное скучиванье микробов (зернистость), в контрольной капле остается равномерное помутнение.

Ориентировочной реакцией агглютинации чаще всего пользуются для определения видовой принадлежности микробов, выделенных из исследуемого материал. Полученный результат позволяет ориентировочно ускорить постановку диагноза заболевания. Если реакция плохо видна невооруженным глазом, ее можно наблюдать под микроскопом. В этом случае ее называют микроагглютинацией.

Ориентировочная реакция агглютинации, которая ставится с каплей крови больного и известным антигеном, называется кроваво – капельной.

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА)

Эта реакция по чувствительности превосходит реакцию агглютинации и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими и другими микроорганизмами.

РНГА позволяет обнаружить небольшую концентрацию антител.

В этой реакции участвуют таннизированные бараньи эритроциты или эритроциты человека с кровью I группы, сенсибилизированные антигенами или антителами.

Если в исследуемой сыворотке определяются антитела, то используются эритроциты, сенсибилизированные антигенами (эритроцитарный диагностикум).

В некоторых случаях, при необходимости определения различных антигенов в исследуемом материале, используют эритроциты, сенсибилизированные иммунными глобулинами.

Результаты РНГА учитывают по характеру осадка эритроцитов.

Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки (перевернутый зонтик).

При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска (пуговка) располагаются в центре дна пробирки.