(ПО СТАНДАРТНЫМ СЫВОРОТКАМ И СТАНДАРТНЫМ ЭРИТРОЦИТАМ) (перекрестный способ)

Суть метода – с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток определяется наличие или отсутствие в исследуемой крови групповых антигенов А и В, а с помощью стандартных эритроцитов наличие или отсутствие в плазме групповых антител α и β. Стандартные эритроциты представляют собой 10-20 % взвесь эритроцитов 0(I), A(II) и B(III) групп в цитратно-физиологическом растворе. Их готовят из крови доноров с заранее известной группой крови, хранят при +4-8°С. Срок годности 2-3 дня.

Материальное оснащение: стандартные сыворотки 0(I), А(II), В(III), групп двух серий, стандартные эритроциты 0(I), А(II), В(III) групп, изотонический раствор хлорида натрия, иглы, тарелки, стеклянные палочки или предметные стекла, пипетки, песочные часы, резиновые перчатки, маска, очки, клеенчатый передник.

Методика выполнения:

Надеть маску и передник, обработать руки антисептиком для обработки рук, надеть перчатки и защитные очки.

Взять 3-5 мл исследуемой крови в пробирку без стабилизатора. Кровь должна отстояться, или ее центрифугируют для получения сыворотки.

На планшет нанести по две капли стандартных сывороток группы 0(I), А(II), В(III), двух серий.

Соответственно каждой группе сывороток расположить по одной капле стандартных эритроцитов группы 0(I), А(II), В(III), .

В стандартные сыворотки добавить по одной капле испытуемой крови, а в стандартные эритроциты - по две капли испытуемой сыворотки.

Капли перемешать углом предметного стекла, всякий раз изменяя угол так, чтобы не произошло смешивание разных сывороток и разных эритроцитов.

Покачивая планшет в руках в течение 5 минут, следят за наступлением агглютинации.

Оценка результатов:

При трактовке результатов оценивают данные, полученные при обеих реакциях (со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами)

1. Эритроциты группы О (I) являются контрольными, агглютинация с ними не происходит.

2. Агглютинация со стандартными эритроцитами А и В и нет агглютинации в трех стандартных сыворотках двух серий - в исследуемой сыворотке присутствуют оба агглютинина a и b, а в испытуемых эритроцитах нет агглютиногенов, т. е. кровь относится к группе O(I).

3. Агглютинация со стандартными эритроцитами группы B(III) и со стандартной сывороткой группы O(I), B(III) - в исследуемых эритроцитах имеется агглютиноген А, а в сыворотке исследуемой крови - агглютинин b. Следовательно, кровь относится к группе A(II).

4. Агглютинация со стандартными эритроцитами группы A(II) и со стандартной сывороткой группы A(II), O(I) – в исследуемых эритроцитах имеется агглютиноген В, а в исследуемой сыворотке - агглютинин a. Следовательно, кровь относится к группе B(III).

5. Нет агглютинации со стандартными эритроцитами и есть агглютинация со стандартными сыворотками - в исследуемых эритроцитах имеются оба агглютиногена А и В, а в сыворотке исследуемой крови отсутствуют оба агглютинина, кровь относится к группе AB(IV).

Примечание. Результат перекрестного способа считается достоверным только в случае совпадения ответов о группе исследуемой крови и со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и со стандартными эритроцитами. При несовпадении результатов обе реакции необходимо переделать.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ

Определение группы крови можно произвести с помощью моноклональных антител (МКА). Для определения агглютиногенов эритроцитов используют стандартные реагенты цоликлоны анти-А и анти-В. Получают моноклональные антитела с применением гибридомной битехнологии. Гибридома – это клеточный гибрид, возникший в результате слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих “родителей”: способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту. Цоликлоны анти-А и анти-В продуцируются двумя различными гибридомами. Они предназначены для определения группы крови системы АВО человека взамен стандартных изогемагглютинирующих сывороток. Цоликлоны анти-А (красного цвета) и анти-В (синего цвета) выпускаются как в нативной, так и в лиофилизированной форме в ампулах по 20,50,100,200 доз с растворителем, приложенным к каждой ампуле по 2,5, 10,20 мл соответственно. Лиофилизированный порошок разводят изотоническим раствором хлористого натрия непосредственно перед исследованием. Для каждого определения группы крови применяют по одной серии реагента анти-А и анти-В.

Материальное оснащение: цоликлоны анти-А и анти-В, изотонический раствор хлорида натрия, иглы, тарелки, стеклянные палочки или предметные стекла, пипетки, песочные часы, резиновые перчатки, маска, очки, клеенчатый передник.

Методика выполнения:

Надеть маску и передник, обработать руки антисептиком для обработки рук, надеть перчатки и защитные очки.

Убедиться в пригодности цоликлонов, донорской крови.

На тарелке написать Ф. И. О. донора и реципиента.

Вскрыть ампулы с цоликлонами, растворителями, смешать все с помощью отдельных шприцев, разлить цоликлоны во флаконы с пипеткой (анти-А – красный, анти-В – синий).

Взять кровь реципиента и донора.

В две лунки под соответствующими надписями: анти-А или анти-В нанести по 1 капле (0,1мл) цоликлонов: в первую – цоликлон анти-А, во вторую – цоликлон анти-В.

Отдельным концом стеклянной палочки или отдельной пипеткой для каждой лунки перенести каплю крови в 10 раз меньше капли цоликлона с предметного стекла в лунку и смешать с каплей цоликлона до гомогенного пятна.

Блюдце осторожно покачивать в течение 2,5 мин.

Оценить результат пробы без добавления изотонического раствора натрия хлорида.

Оценка результатов:

При отсутствии агглютинации с двумя цоликлонаи группа крови 0(I) – первая.

При наличии агглютинации с цоликлоном анти-А группа крови А(II) – вторая.

При наличии агглютинации с цоликлоном анти-В группа крови В(III) – третья.

При наличии агглютинации с двумя цоликлонами группа крови АВ(IV) – четвертая.

ОШИБКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГРУППОВОЙ

ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ

Ошибки при определении групповой принадлежности крови могут быть обусловлены тремя видами причин:

техническими;

неполноценностью стандартных сывороток и стандартных эритроцитов;

особенностями испытуемой крови.

Технические причины:

нарушение порядка расположения сывороток на планшете;

нарушение соотношения сыворотки и эритроцитов;

несоблюдение внешних условий (плохая освещенность, изменение температуры окружающей среды)

несоблюдение положенного для реакции агглютинации времени

применение загрязненных кровью планшетов, пипеток, предметных стекол;

неправильная запись исследуемой крови;

Применение неполноценных стандартных сывороток и

стандартных эритроцитов:

слабые стандартные сыворотки с титром ниже 1:32 или истекшим сроком годности могут вызывать позднюю и слабую агглютинацию;

применение негодных стандартных сывороток или эритроцитов, нестерильно приготовленных и недостаточно законсервированных, ведет к возникновению неспецифической, «бактериальной» агглютинации.

Особенности испытуемой крови

наличие в крови слабого агглютиногена А_2,.

кровь обладает свойством «панагглютинации» или «аутоагглютинации», т. е. дает неспецифическую агглютинацию со всеми сыворотками и даже со своей собственной сывороткой. Для устранения панагглютинации планшет помещают в термостат при температуре 37° на 5 минут, после чего панагглютинация исчезает, а истинная остается.

ТАКТИКА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГРУППЫ КРОВИ

Непосредственно в отделении группа крови определяется врачом по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам или с помощью цоликлонов, после этого в серологической лаборатории производится проверка перекрестным методом. Если результаты совпадают, то группа крови считается определенной. В случае расхождения результатов, производятся повторные исследования.

В экстренных ситуациях можно ограничится реакцией с изогемагглютинирующими сыворотками или цоликлонами, но при возможности следует использовать перекрестный метод.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ФАКТОРА

Для определения резус-фактора применяют несколько методик. При этом используют специальные сыворотки, содержащие антирезус-антитела, которые получают из крови резус-отрицательных людей, иммунизированных резус-фактором. Сыворотка антирезус должна принадлежать к той же группе крови по системе АВО, какая имеется у больного.