Особенность строения вирусного генома заключается в том, что наследственная ин­формация может быть записана как на ДНК, так и на РНК, в зависимости от типа вируса.

Мутации у вирусов могут возникать спон­танно, в процессе репликации нуклеиновой кислоты вируса, а также под влиянием тех же внешних факторов и мутагенов, что и у бактерий.

Фенотипически мутации вирусного гено­ма проявляются изменениями в антиген­ной структуре, неспособностью вызывать продуктивную инфекцию в чувствительной клетке, чувствительностью продуктивного цикла к температуре, а также изменением формы и размера бляшек, которые образуют вирусы в культуре клеток под агаровым пок­рытием (гл. 3.3).

Свойства вирусов могут изменяться при одновременном заражении несколькими ви-

русами чувствительной клетки. Причем из­менения свойств при таких условиях могут происходить как в результате обмена между материалами нуклеиновых кислот, принадле­жащих разным вирусам(генетическая реком­бинация и генетическая реактивация), так и в результате процессов, не сопровождающихся обменом генетического материала (компле­ментация и фенотипическое смешивание).

Генетическая рекомбинация встречается ча­ще у ДНК-содержащих вирусов. Среди РНК-содержащих вирусов она наблюдается у тех из них, которые обладают фрагментированным геномом, например у вируса гриппа. При рекомбинации происходит обмен между го­мологичными участками генома.

Генетическая реактивация наблюдается между геномами родственных вирусов, име­ющих мутации в разных генах. В результате перераспределения генетического материала формируется полноценный дочерний геном.

Комплементация встречается в том случае, когда один из двух вирусов, инфицирующих клетку, в результате мутации синтезирует не­функциональный белок. Немутантный вирус, синтезируя полноценный белок, восполняет его отсутствие у мутантного вируса.

Фенотипическое смешивание наблюдается в том случае, если при смешанном заражении чувствительной клетки двумя вирусами часть потомства приобретает фенотипические при­знаки, присущие двум вирусам, при сохране­нии неизменности генотипа.

5.6. Применение генетических методов в диагностике инфекционных болезней

5.6.1. Рестрикционный анализ

Данный метод основан на применении фер­ментов, носящих название рестриктаз.

Рестриктазы представляют собой эндонук-леазы, которые расщепляют молекулы ДНК. разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовательностях нуклеотидов. Особое значение для методов мо­лекулярной генетики имеют рестриктазы, кото­рые узнают последовательности, обладающие центральной симметрией и считывающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии.

Точка разрыва ДНК может или совпадать с осью симметрии, или быть сдвинута относи­тельно нее.

В настоящее время из различных бактерий выделено и очищено более 175 различных рес-триктаз, для которых известны сайты (участки) узнавания (рестрикции). Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых может про­исходить разрыв двойной спирали ДНК.

В геноме конкретной таксономической еди­ницы находится строго определенное (генети­чески задетерминированное) число участков узнавания для определенной рестриктазы.

Если выделенную из конкретного микроба ДНК обработать определенной рестриктазой, то это приведет к образованию строго опреде­ленного количества фрагментов ДНК фикси­рованного размера.

Размер каждого типа фрагментов можно узнать с помощью электрофореза в агароз-ном геле: мелкие фрагменты перемещаются в геле быстрее, чем более крупные фрагменты, и длина их пробега больше. Гель окрашива­ют бромистым этидием и фотографируют в УФ-излучении. Таким образом можно полу­чить рестрикционную карту определенного вида микробов.

Сопоставляя карты рестрикции ДНК, вы­деленных из различных штаммов, можно оп­ределить их генетическое родство, выявить принадлежность к определенному виду или роду, а также обнаружить участки, подвергну­тые мутациям.

Этот метод используется также как началь­ный этап метода определения последователь­ности нуклеотидных пар (секвенирования) и метода молекулярной гибридизации.

5.6.2. Метод молекулярной гибридизации

Позволяет выявить степень сходства раз­личных ДНК. Применяется при идентифи­кации микробов для определения их точно­го таксономического положения.

Метод основан на способности двухцепо-чечной ДНК при повышенной температуре (90 °С) в щелочной среде денатурировать, т. е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10 °С вновь восстанавливать

исходную двухцепочечную структуру. Метод требует наличия молекулярного зонда.

Зондом называется одноцепочечная мо­лекула нуклеиновой кислоты, меченная ра­диоактивными нуклидами, с которой срав­нивают исследуемую ДН К.

Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить фиксируют на специальном фильтре, который затем помещают в раствор, со­держащий радиоактивный зонд. Создаются ус­ловия, благоприятные для образования двойных спиралей. В случае наличия комплементарности между зондом и исследуемой ДНК, они образу­ют между собой двойную спираль.

5.6.3. Полимеразная цепная реакция

ПЦР позволяет обнаружить микроб в ис­
следуемом материале (воде, продуктах, ма­
териале от больного) по наличию в нем
ДНК микроба без выделения последнего в
чистую культуру.

Для проведения этой реакции из исследу­емого материала выделяют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для дан­ного микроба гена. Обнаружение гена осу­ществляют его накоплением. Для этого необ­ходимо иметь праймеры комплементарного З'-концам ДНК исходного гена. Накопление (амплификация) гена выполняется следую­щим образом. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на 2 нити. Добавляют праймеры. Смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры, при наличии в смеси ДНК искомо­го гена, связываются с его комплементарными участками. Затем к смеси ДНК и праймера добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. Устанавливают температуру, оптимальную для функционирования ДНК-полимеразы. В этих условиях, в случае комплементарности ДНК гена и праймера, происходит присоединение нуклеотидов к З'-концам праймеров, в резуль­тате чего синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяется снова, при этом ко­личество ДНК гена будет увеличиваться каж-

дый раз вдвое (рис. 5.5) Проводят реакцию в специальных приборах — амплификаторах. ПЦР применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.

5.6.4. Риботипирование и опосредованная транскрипцией амплификация рибосомальной РНК

Последовательность нуклеотидных основа­ний в оперонах, кодирующих рРНК, отлича­ется консервативностью, присущей каждому

виду бактерий. Эти опероны представлены на бактериальной хромосоме в нескольких ко­пиях. Фрагменты ДНК, полученные после об­работки ее рестриктазами, содержат последо­вательности генов рРНК, которые могут быть обнаружены методом молекулярной гибри­дизации с меченой рРНК соответствующего виды бактерий. Количество и локализация копий оперонов рРНК и рестрикционный состав сайтов как внутри рРНК-оперона, так и по его флангам варьируют у различных вида

бактерий. На основе этого свойства построен метод риботипироваиия, который позволяет производить мониторинг выделенных штам­мов и определение их вида. В настоящее вре-мя риботипирование проводится в автомати­ческом режиме в специальных приборах.

Опосредованная транскрипцией амплифика-ция рРНК используется для диагностики сме­шанных инфекций. Этот метод основан на обнаружении с помощью молекулярной гиб-ридизации амплифицированных рРНК, спе­цифичных для определенного вида бактерий. Исследование проводится в три этапа:

1. Амплификация пула рРНК на матрице вы-деленной из исследуемого материала ДНК при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы.

2. Гибридизация накопленного пула рРНК с комплементарными видоспецифическим рРНК олигонуклеотидами, меченными флю-орохромом или ферментами.

3. Определение продуктов гибридизации методами денситометрии, иммунофермент-ного анализа (ИФА).

Реакция проводится в автоматическом ре­жиме в установках, в которых одномоментное определение рРНК, принадлежащих различ­ным видам бактерий, достигается разделе­нием амплифицированного пула рРНК на несколько проб, в которые вносятся компле­ментарные видоспецифическим рРНК мече­ные олигонуклеотиды для гибридизации.