Поможем в ✍️ написании учебной работы

Имя

Поможем с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой

Выберите тип работыЧасть дипломаДипломная работаКурсовая работаКонтрольная работаРешение задачРефератНаучно - исследовательская работаОтчет по практикеОтветы на билетыТест/экзамен onlineМонографияЭссеДокладКомпьютерный набор текстаКомпьютерный чертежРецензияПереводРепетиторБизнес-планКонспектыПроверка качестваЭкзамен на сайтеАспирантский рефератМагистерская работаНаучная статьяНаучный трудТехническая редакция текстаЧертеж от рукиДиаграммы, таблицыПрезентация к защитеТезисный планРечь к дипломуДоработка заказа клиентаОтзыв на дипломПубликация статьи в ВАКПубликация статьи в ScopusДипломная работа MBAПовышение оригинальностиКопирайтингДругое

Нажимая кнопку "Продолжить", я принимаю политику конфиденциальности

Для уничтожения микробов (бактерий, виру­сов, грибов и простейших) на различных пред­метах и в материалах, используемых в медицине, в пищевой промышленности и в быту, применя­ют два способа: стерилизацию и дезинфекцию.

4.4.1. Стерилизация

Стерилизация (от лат. sterilis — бесплодный) предполагает полную инактивацию микробов в объектах, подвергающихся обработке.

Существует три основных метода стерили­зации: тепловой, лучевой, химической.

Тепловая стерилизация основана на чувстви­тельности микробов к высокой температуре. При 60 °С и наличии воды происходит денату­рация белка, деградация нуклеиновых кислот, липидов, вследствие чего вегетативные фор­мы микробов погибают. Споры, содержащие очень большое количество воды в связанном состоянии и обладающие плотными оболоч­ками, инактивируются при 160—170 °С.

Для тепловой стерилизации применяют, в основном, сухой жар и пар под давлением.

Стерилизацию сухим жаром осуществля­ют в воздушных стерилизаторах (прежнее название — «сухожаровые шкафы или печи Пастера»). Воздушный стерилизатор пред­ставляет собой металлический плотно закры­вающийся шкаф, нагревающийся с помощью электричества и снабженный термометром. Обеззараживание материала в нем произво­дят, как правило, при 160 °С в течение 120 мин. Однако возможны и другие режимы: 200 °С - 30 мин, 180 °С - 40 мин.

Стерилизуют сухим жаром лабораторную посуду и другие изделия из стекла, инстру­менты, силиконовую резину, т. е. объекты, которые не теряют своих качеств при высокой температуре.

Большая часть стерилизуемых предметов не выдерживает подобной обработки, и поэтому их обеззараживают в паровых стерилизаторах.

Обработка паром под давлением в паровых стерилизаторах (старое название — «автокла­вы») является наиболее универсальным мето­дом стерилизации.

Паровой стерилизатор (существует множес­тво его модификаций) — металлический ци-

линдр с прочными стенками, герметически закрывающийся, состоящий из водопаровой и стерилизующей камер. Аппарат снабжен манометром, термометром и другими конт­рольно-измерительными приборами. В авто­клаве создается повышенное давление, что приводит к увеличению температуры кипения (табл. 4.1).

 

Таблица 4. (.Зависимость темпера от атмосферного давления	гуры кипения волы
0,5 атм	80 "С
1 атм	100 РС
2 атм	121 "С
Затм	136'С

Поскольку кроме высокой температуры на микробы оказывает воздействие и пар, споры погибают уже при 120 "С. Наиболее распростра­ненный режим работы парового стерилизатора: 2 атм — 121 °С — 15—20 мин. Время стерилиза­ции уменьшается при повышении атмосфер­ного давления, а следовательно, и температуры кипения (136 °С — 5 мин). Микробы погибают за несколько секунд, но обработку материала производят в течение большего времени, так как, во-первых, высокая температура должна быть и внутри стерилизуемого материата и. во-вторых, существует так называемое поле безопасности (рассчитанное на небольшую не­исправность автоклава).

Стерилизуют в автоклаве бульшую часть предметов: перевязочный материал, белье, коррозионно-устойчивые металлические инструменты, питательные среды, растворы, инфекционный материал и т. д.

Эффективность стерилизации в паровом стерилизаторе зависит от правильного вы­бора упаковки, соблюдения правил загрузки для свободного прохождения пара (например, перевязочный материал укладывают в камеру параллельно движению пара), плотности за­грузки камеры и других факторов.

Одной из разновидностей тепловой стери­лизации является дробная стерилизация, ко­торую применяют для обработки материалов, не выдерживающих температуру выше 100 "С, например, для стерилизации питательных сред с углеводами, желатина. Их нагревают в во­дяной бане при 80 °С в течение 30—60 мин, в

результате чего вегетативные формы погибают. Процедуру повторяют три дня подряд, в про­межутках между манипуляциями питательные среды выдерживают в термостате, что способс­твует прорастанию спор. Иногда эту процедуру производят в автоклаве при давлении 0,5 атм.

В настоящее время применяют еще один метод тепловой стерилизации, предназначен­ный специально для молока — ультравысоко­температурный (УВТ): молоко обрабатывают в течение нескольких секунд при 130—150 С.

Тепловая стерилизация — наиболее надеж­ный, экологически безопасный, дешевый и хорошо контролируемый метод. Однако его невозможно применять тогда, когда предме­ты повреждаются от высокой температуры. В этих случаях прибегают к другим методам.

Химическая стерилизация предполагает ис­пользование токсичных газов: оксида этиле­на, смеси ОБ (смеси оксида этилена и бро­мистого метила в весовом соотношении 1:2,5) и формальдегида. Эти вещества являются ал-килирующими агентами, их способность в присутствии воды инактивировать активные группы в ферментах, других белках, ДНК и РНК приводит к гибели микроорганизмов.

Стерилизация газами осуществляется в присутствии пара при температуре от 18 до 80 °С в специальных камерах. В больницах используют формальдегид, в промышленных условиях — оксид этилена и смесь ОБ.

Перед химической стерилизацией все из­делия, подлежащие обработке, должны быть высушены.

Этот вид стерилизации небезопасен для персонала, для окружающей среды и для па­циентов, пользующихся простерилизованны-ми предметами (большинство стерилизующих агентов остается на предметах).

Однако существуют объекты, которые мо­гут быть повреждены нагреванием, например, оптические приборы, радио- и электронная аппаратура, предметы из нетермостойких по­лимеров, питательные среды с белком и т. п., для которых пригодна только химическая сте­рилизация. Например, космические корабли и спутники, укомплектованные точной ап­паратурой, для их деконтаминации обезв­реживают газовой смесью (оксид этилена и бромистого метила).

В последнее время в связи с широким рас­пространением в медицинской практике изде­лий из термолабильных материалов, снабжен­ных оптическими устройствами, например эндоскопов, стали применять обезврежива­ние с помощью химических растворов. После очистки и дезинфекции прибор помещают на определенное время (от 45 до 60 мин) в сте­рилизующий раствор, затем прибор должен быть отмыт стерильной водой. Для стери­лизации и отмывки используют стерильные емкости с крышками. Простерилизованное и отмытое от стерилизующего раствора изделие высушивают стерильными салфетками и по­мещают в стерильную емкость. Все манипу­ляции проводят в асептических условиях и в стерильных перчатках. Хранят эти изделия не более 3 суток.

Лучевая стерилизация осуществляется либо с помощью гамма-излучения, либо с помо­щью ускоренных электронов.

Источником гамма-излучения, получаемо­го в специальных гамма-установках, являются радиоактивные изотопы, например ⁶⁰Со, ¹³⁷Cs. Для получения электронного излучения при­меняют ускорители электронов (с высоким уровнем энергии — 5-10 MeV).

Гибель микробов под действием гамма-лу­чей и ускоренных электронов происходит прежде всего в результате повреждения нук­леиновых кислот. Причем микробы более ус­тойчивы к облучению, чем многоклеточные организмы.

Лучевая стерилизация является альтернати­вой газовой стерилизации в промышленных условиях, и применяют ее также в тех случаях, когда стерилизуемые предметы не выдержи­вают высокой температуры. Лучевая стерили­зация позволяет обрабатывать сразу большое количество предметов (например, одноразо­вых шприцев, систем для переливания крови). Благодаря возможности широкомасштабной стерилизации, применение этого метода впол­не оправданно, несмотря на его экологичес­кую опасность и неэкономичность.

Еще одним способом стерилизации является фильтрование. Фильтрование с помощью раз­личных фильтров (керамических, асбестовых, стеклянных), а в особенности мембранных уль­трафильтров из коллоидных растворов нитроцел-

люлозы или других веществ позволяет освободить жидкости (сыворотку крови, лекарства) от бак­терий, грибов, простейших и даже вирусов. Для ускорения процесса фильтрации обычно создают повышенное давление в емкости с фильтруемой жидкостью или пониженное давление в емкости с фильтратом.

В настоящее время все более широкое при­менение находят современные методы стери­лизации, созданные на основе новых техно­логий, с использованием плазмы, озона.

Микробиологический контроль объектов, подвергшихся стерилизации, в повседнев­ной практике не производится. Его заменяет косвенный контроль — контроль работы сте­рилизаторов, который осуществляется не­сколькими способами. Во-первых, персонал должен строго соблюдать и документировать установленный режим стерилизации, кото­рый обеспечивает гибель микробов. Во-вто­рых, косвенно о поддержании определенной температуры можно судить по изменению окраски химических индикаторов (либо ин­дикаторных бумажек, либо порошков, жид­костей — бензойной кислоты, мочевины, запаянных в ампулы), которые помещают на поверхности и в глубине стерилизуемого объекта. В-третьих, должен регулярно про­водиться технический контроль аппарату­ры соответствующей службой. В-четвертых, три раза в году осуществляют биологический контроль, помещая внутрь стерилизуемых предметов биотесты, приготовленные из тер­моустойчивых бацилл Вас. stearothermophilus ВКМ-718.

Для проведения микробиологического кон­троля производят посев кусочков материала, смывов с предметов, подвергшихся стерили­зации, на среды, позволяющие обнаружить аэробные и анаэробные бактерии, грибы (са­харный бульон, тиогликолевую среду, сре­ду Сабуро). Отсутствие роста после 14 дней инкубации в термостате свидетельствует о стерильности предмета. Более тщательный контроль стерильности осуществляют в про­мышленных условиях, отбирая случайным методом некоторое количество образцов.

После процедуры стерилизации должна со­храняться стерильность, которую поддержи­вают с помощью упаковки: полимерной плен-

ки, бумаги, фольги, биксов, металлических пеналов и др.

Существует общий стандарт для всех ви­дов стерилизации, принятый Европейской Фармакопеей в 1983 г.: после завершения сте­рилизации на лечебном материале может ос­таваться некоторое количество жизнеспособ­ных микроорганизмов — 1 из 10^⁶.

4.4.2. Дезинфекция

Дезинфекция (от франц. приставки des , обозначающей удаление, уничтожение ин­фекционного начала) — процедура, пре­дусматривающая обработку загрязненного микробами предмета с целью их уничтоже­ния до такой степени, чтобы они не смогли вызвать инфекцию при использовании дан­ного предмета. Как правило, при дезинфек­ции погибает большая часть микробов (в том числе все патогенные), однако споры и некоторые резистентные вирусы могут остаться в жизнеспособном состоянии.

Стерилизация — лучший способ обеззаражи­вания. Однако, если отсутствует возможность подвергнуть предмет стерилизации, проводится дезинфекция. Например, нельзя простерилизо-вать бокс, в котором ведутся работы с заразным материалом, операционный стол, руки хирурга или оптиковолоконные микроскопы.

После дезинфекции, в отличие от стери­лизации, нет необходимости защищать про­дезинфицированный материал от попадания микробов извне. До стерилизации предмет необходимо тщательно отчистить от грязи, крови, химических веществ (в том числе и ле­карств) и вымыть, чтобы сократить количес­тво микробов на нем. Дезинфекция нередко выполняется перед процедурой чистки для обеспечения безопасности медперсонала.

Различают три основных метода дезинфек­ции: тепловой, химический, УФ-облучение. Выбор того или иного метода также зависит от дезинфицируемого материала.

Тепловая дезинфекция. Очень эффективным является действие горячей воды и насыщен­ного пара. Рекомендуется следующее время воздействия: при 80 °С — 10 мин, при 85 °С — 3 мин, при 90 °С — 1 мин. При этом режиме

погибают все вегетативные формы бактерий и большинство вирусов. Температура 100 С в течение 5 мин убивает все вегетативные фор­мы бактерий и все вирусы.

При добавлении в воду 2 % натрия гид­рокарбоната (NaHC0₃) погибают и споры. Кроме того, добавление соды имеет дополни­тельные преимущества: сода растворяет белки и жиры, которые могут находиться на повер­хности предмета, предупреждает коррозию инструментов и оседание на них кальция. Подобным образом можно обрабатывать инс­трументы, иглы, шприцы и т. д.

Более удобным является применение авто­матических моечных машин, в которых пред­меты сначала промываются в холодной воде, затем — в теплой с детергентом, далее — в чистой и, наконец, дезинфицируются в дис­тиллированной воде при 90 °С.

Обычные процессы стирки белья, приго­товление пищи и кипячение питьевой воды являются примером использования дезин­фекции в быту.

Для дезинфекции применяют также сухое тепло, например, прокаливание.

Тепловая дезинфекция — это единствен­ный метод, который не вызывает загрязнения окружающей среды; кроме того, он является наиболее эффективным и дешевым.

Разновидностью тепловой дезинфекции яв­ляется пастеризация — метод, созданный Л. Пастером и применяемый для обработки в основном молока, а также соков, вина и пива. При используемом обычно режиме — 60—70 °С в течение 20—30 мин — погибает большинство вегетативных форм бактерий (особенно важно уничтожение бруцелл и Mycobacterium bovis , которые могут находиться в молоке), но сохра­няется часть энтерококков, молочнокислых бактерий и споры. Поэтому пастеризованное молоко помещают на холод для предотвра­щения и прорастания спор и размножения бактерий.

Химическая дезинфекция проводится с помо­щью различных дезинфицирующих веществ. Дезинфектанты действуют, например, раство­ряя липиды клеточных оболочек (детергенты) или разрушая белки и нуклеиновые кислоты (денатураты, оксиданты). Активность каждо­го из дезинфектантов неодинакова для раз-

личных микроорганизмов и зависит от темпе­ратуры, рН и прочих условий.

В качестве контрольных микроорганизмов для изучения действия дезинфектантов ис­пользуют S . typhi и S . aureus .

Обеззараживанию с помощью данного ме­тода подлежат, например, поверхность опе­рационного стола, стены процедурного ка­бинета, кожа, некоторые инструменты — все то, что невозможно обработать теплом. Еще одним примером химической дезинфекции является хлорирование воды.

Использование большинства дезинфициру­ющих веществ опасно для медперсонала, они загрязняют окружающую среду, многие из них дорогостоящи.

Ультрафиолетовое облучение (лучи с длиной волны 200—400 нм) производится с помощью специальных бактерицидных ламп (настен­ных, потолочных, передвижных и др.) для обеззараживания воздуха, различных поверх­ностей в операционных, перевязочных, мик­робиологических лабораториях, предприяти­ях пищевой промышленности и т. д. Действие ультрафиолетовых лучей приводит к разруше­нию ДНК микробов в результате образования тиминовых димеров.

Очень незначительна роль механической дезинфекции: проветривания, вентиляции, обработки пылесосом и т. п.

Различают профилактическую дезинфек­цию в эпидемическом очаге, которая осущест­вляется с целью предупреждения распростра­нения различных болезней. При возникнове­нии эпидемического очага проводят текущую (во время вспышки) и заключительную (пос­ле ее окончания) дезинфекцию; подобные процедуры проводятся как в медицинских учреждениях, так и за их пределами.

4.4.3. Асептика и антисептика

Для профилактики внутрибольничных, и в особенности хирургических, инфекций при­меняют асептику и антисептику.

Асептика, основоположником которой явля­ется Д. Листер (1867), — это комплекс мер, направленных на предупреждение попадания возбудителя инфекции в рану, органы больно­го при операциях, лечебных и диагностических процедурах. Методы асептики применяют для

Зорьбы с экзогенной инфекцией, источниками которой являются больные и бактерионосители.

Асептика включает: стерилизацию и сохране­ние стерильности инструментов, перевязочного материала, операционного белья, перчаток и всего, что приходит в соприкосновение с раной; дезинфекцию рук хирурга, операционного поля, аппаратуры, операционной и других помеще­ний, применение специальной одежды, масок. К мерам асептики относится также планировка операционных (этаж, боксирование, вентиля­ция, кондиционирование воздуха и т. п.).

Методы асептики находят также примене­ние в микробиологических производствах, на предприятиях пищевой промышленности.

Антисептика — совокупность мер, направ­ленных на уничтожение микробов в ране, па­тологическом очаге или организме в целом, на предупреждение или ликвидацию воспалитель­ного процесса. Первые элементы антисептики были предложены И. Земмельвейсом в 1847 г.

Антисептика включает различные методы: ме­ханические (удаление инфицированных некро-тизированных тканей, инородных тел и т.д.), физические (дренирование ран, введение там­понов, наложение гигроскопических повязок), химические (применение антисептиков), био­логические (использование протеолитических ферментов для лизиса нежизнеспособных кле­ток, применение бактериофагов, антибиотиков). Обычно применяют комплекс этих методов.

Санитарная микробиология

Санитарная микробиология — раздел меди­цинской микробиологии, изучающий мик­роорганизмы, содержащиеся в окружающей среде и способные оказывать неблагоприят­ное воздействие на состояние здоровья чело­века. Она разрабатывает микробиологические показатели гигиенического нормирования,

методы контроля за эффективностью обез-
зараживания объектов окружающей среды, а
 также выявляет в объектах окружающей сре­
ды патогенные, условно-патогенные и сани-
тарно-показательные микроорганизмы.      

Обнаружение патогенных микроорганизмов позволяет дать оценку эпидемиологической

ситуации и принять соответствующие меры по борьбе и профилактике инфекционных заболеваний.

Условно-патогенные микроорганизмы спо­собны вызывать гнойно-воспалительные про­цессы в ослабленном организме. Кроме того, они могут попадать в продукты питания, быс­тро размножаться с накоплением большого количества микробных клеток и их токсинов, вызывая у людей пищевые отравления микро­бной этиологии.

Санитарно-показательные микроорганизмы используют в основном для косвенного опре­деления возможного присутствия в объектах окружающей среды патогенных микроорга­низмов. Их наличие свидетельствует о загряз­нении объекта выделениями человека и жи­вотных, так как они постоянно обитают в тех же органах, что и возбудители заболеваний, и имеют общий путь выделения в окружаю­щую среду. Например, возбудители кишечных инфекций имеют общий путь выделения (с фекалиями) с такими санитарно-показатель-ными бактериями, как бактерии группы ки­шечной палочки — БГКП (в эту группу, кроме кишечной палочки, входят сходные по свойс­твам бактерии родов Citrobacter , Enterobacter , Klebsiella ), энтерококки, клостридии перф-рингенс. Возбудители воздушно-капельных инфекций имеют общий путь выделения с бактериями (кокками), постоянно обитаю­щими на слизистой оболочке верхних дыха­тельных путей, выделяющимися в окружаю­щую среду (при кашле, чиханье, разговоре), поэтому в качестве санитарно-показательных бактерий для воздуха закрытых помещений предложены гемолитические стрептококки и золотистые стафилококки. Санитарно-пока-зательные микроорганизмы должны отвечать следующим основным требованиям:

— должны обитать только в организме лю­дей или животных и постоянно обнаружи­ваться в их выделениях;

— не должны размножаться или обитать в почве и воде;

— сроки их выживания и устойчивость к различным факторам после выделения из ор­ганизма в окружающую среду должны быть равными или превышать таковые у патоген­ных микробов;

—их свойства должны быть типичными и легко выявляемыми для их дифференциации;

—методы их обнаружения и идентифика­ции должны быть простыми, методически и экономически доступными;

—должны встречаться в окружающей среде в значительно больших количествах, чем па­тогенные микроорганизмы;

—в окружающей среде не должно быть близ­ко сходных обитателей — микроорганизмов.

Кроме определения патогенных, условно-патогенных и санитарно-показательных мик­роорганизмов, в практике санитарно-мик-робиологических исследований используется определение общего микробного числа, т. е. общего количества микроорганизмов в опре­деленном объеме или определенной массе ис­следуемого материала (вода, почва, продукты питания, лекарственная форма и др.).

4.5.1. Микробиологический контроль почвы, воды, предметов обихода

Загрязненность почвы, воды, воздуха и дру­гих объектов определяется по общей микро­бной обсемененности и обнаружению сани­тарно-показательных микроорганизмов — ин­дикаторов наличия выделений человека или животных. В воде регистрируют кишечную палочку, БГКП (колиформные палочки), энте­рококк, стафилококки; в почве — кишечную палочку, БГКП (колиформные палочки), клост-ридии перфрингенс, термофилы; на предметах обихода — БГКП (колиформные палочки), золо­ тистый стафилококк, энтерококк.

На основании количественного выявле­ния этих санитарно-показательных бак­терий вычисляются индекс БГКП (число БГКП в 1 л воды), перфрингенс-титр, титр энтерококка и г. д. Так. например, пир энтерококка воды— это наименьшее ко­личество воды, в котором определяется энтерококк.

К бактериям группы кишечной палочки относят грамотрицательные палочки, сбра­живающие с образованием кислоты и газа лактозу или глюкозу при температуре 37°С в течение 24—48 ч и не обладающие оксидазной активностью. Наиболее часто этот показатель

применяют как индикатор фекального за­грязнения воды. Другой сходный показатель фекального загрязнения — общие колифор­мные бактерии: грамотрицательные, оксида-заотрицательные палочки, ферментирующие лактозу или маннит (глюкозу) с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 часов. Вместо последнего термина предлагается использовать термин «бактерии семейства Enterobacteriaceae», так как все бактерии этого семейства имеют ин­дикаторное значение. К бактериям семейства Enterobacteriaceae относятся грамотрицатель­ные, оксидазаотрицательные палочки, расту­щие на лактозосодержащих средах типа среды Эндо и ферментирующие глюкозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 ча­сов; колиформные бактерии (палочки).

При бактериальном загрязнении воды свыше допустимых норм следует провести дополни­тельное исследование на наличие бактерий — показателей свежего фекального загрязнения. К таким бактериям относят термотолерантные колиформные бактерии, фекальные кишечные палочки, ферментирующие лактозу до кислоты и газа при температуре 44 °С в течение 24 часов и не растущие на цитратной среде. О свежем фекальном загрязнении свидетельствует также выявление энтерококка. На давнее фекальное загрязнение указывают отсутствие БГКП и на­личие определенного количества клостридии перфрингенс, т. е. наиболее устойчивых споро-образующих бактерий.

В соответствии с нормативными докумен­тами регламентируются следующие нормати­ вы микробиологических показателей питьевой воды при централизованном водоснабжении:

1. Общее микробное число воды не должно пре­вышать 100 микробов в 1 мл исследуемой воды;

2. Общие колиформные бактерии должны от­сутствовать в 100 мл исследуемой воды;

3. Термотолерантные колиформные бактерии должны отсутстовать в 100 мл исследуемой воды;

4. Колифаги не должны определяться в 100 мл исследуемой воды (учет по бляшкооб-разующим единицам);

5. Споры сульфитредуцирующих клостридии не должны определяться в 20 мл исследуемой воды;

6. Цисты лямблий не должны определяться в 50 мл исследуемой воды.

Кроме того, загрязненность воды оценива­ется по обнаружению патогенных микробов с фекально-оральным механизмом переда­чи (энтеровирусы, энтеробактерии, холерные вибрионы и др.).

Оценка фекального загрязнения почвы и его давности проводится по индексу БГКП (количество БГКП в 1 г почвы), перфрин-генс-титру (наименьшее количество почвы, в котором обнаруживается Clostridium ре r - fringens ), а иногда и по титру энтерококков. Параллельно определяется микробное число почвы. Загрязненность почвы навозом и ком­постом оценивается по титру термофилов — бактерий, вырастающих на мясо — пептон-ном агаре при 60 °С в течение 24 часов.

Существуют следующие критерии оценки степени загрязнения почвы:

1. Титр БГКП и перфрингенс-титр для сильно загрязненных почв — соответственно 0,009 и ни­же, 0,00009 и ниже; для чистых почв — коли-титр 1,0 и выше, перфрингенс-титр — 0,01 и выше.

2. Количество термофилов (на 1 г почвы; культивирование при температуре 60°С): в чистых почвах — 100-1000, в загрязнен­ных— 1000—10 000, а в сильно загрязнен­ных— 100 000-400 000 колониеобразующих единиц (КОЕ).

Санитарный надзор за состоянием объектов общественного питания, аптек, лечебных и детских учреждений осуществляется исследо­ванием смывов с рук персонала, посуды, по­верхности столов, оборудования и др. Смыв высевают на различные питательные среды для определения микробной обсемененности, наличия БГКП, патогенных энтеробактерий, золотистого стафилококка, энтерококка, гри­бов рода Candida . Отдельно можно выявлять энтеровирусы.

4.5.2. Микробиологический контроль воздуха

Микробиологический контроль возду-\а проводится с помощью методов естест­венной или принудительной седиментации лкробов. Естественная седиментация (по методу Коха) проводится в течение 5—10 мин путем осаждения микробов на поверхность твердой питательной среды в чашке Петри. Принудительная седиментация микробов

осуществляется путем «посева» проб воздуха на питательные среды с помощью специаль­ных приборов (импакторов, импинджеров, фильтров). Импакторы — приборы для при­нудительного осаждения микробов из воздуха на поверхность питательной среды (прибор Кротова, пробоотборник аэрозоля бактерио­логический и др.). Импинджеры — приборы, с помощью которых воздух проходит через жидкую питательную среду или изотоничес­кий раствор хлорида натрия.

Санитарно-гигиеническое состояние воз­духа определяется по следующим микробио­логическим показателям:

1. Общее количество микроорганизмов в 1 м³ воздуха (так называемое общее микробное число, или обсемененность воздуха) — коли­чество колоний микроорганизмов, выросших при посеве воздуха на питательном агаре в чашке Петри в течение 24 ч при 37 °С, выра­женное в КОЕ;

2. Индекс санитарно-показательных микро­ бов— количество золотистого стафилококка и гемолитических стрептококков в 1 м³ воздуха. Эти бактерии являются представителями мик­рофлоры верхних дыхательных путей и имеют общий путь выделения с патогенными микроор­ганизмами, передающимися воздушно-капель­ным путем. Появление в воздухе спорообразу-ющих бактерий — показатель загрязненности воздуха микроорганизмами почвы, а появление грамотрицательных бактерий — показатель воз­можного антисанитарного состояния.

Для оценки воздуха лечебных учреждений мож­но использовать данные из официально рекомен­дованных нормативных документов (табл. 4.2).

4.5.3. Микробиологический контроль продуктов питания

Санитарно-микробиологическое исследо­вание продуктов питания проводится в пла­новом порядке и по эпидемиологическим показаниям. В плановом порядке проводятся исследования по следующим показателям:

1. Общее микробное число (обсеменение). Определяют МАФАМ — мезофилъные и фа­ культативно анаэробные микроорганизмы, вы­росшие в виде видимых колоний на плотной питательной среде после инкубации при 37°С в течение 24 ч.

Таблица 4.2. Допустимые уровни бактериальной обсемененности воздуха в некоторых отделениях стационаров

Место отбора проб Условия работы Общее количество КОБ в 1 м³ воздуха Количество золо­ тистого стафи­ лококка в 1 м^3 воздуха Количество грамот- рицательных бакте­ рий в 1 м^3 воздуха Операционные (обес­печенные 10— 20-крат­ным и более воздухо­обменом) Подготовленные к работе Не более 100

Не должно быть

Реанимационные от­деления (палаты)   Не более 1000 Не более 4 Не должно быть

Процедурная

До начала работы Не более 50 Не должно быть  

 

Во время работы Не более 2000 Не более 1—2  

2. Обнаружение санитарно-показательных бактерий в продуктах питания — кишечной па­ лочки, БГКП, энтерококка, золотистого ста­ филококка, бактерий группы протея, клостри- дий (сульфит-восстановителей).

3. Обнаружение сальмонелл, например, при исследовании продуктов из мяса (наряду с другими показателями).

По эпидемиологическим показаниям продукты исследуют на наличие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов — возбудителей пищевых отравлений микробной этиологии.

Общее микробное обсеменение не опреде­ляют в кисломолочных продуктах — твороге, сметане, кефире и других, содержащих спе­цифическую микрофлору (молочнокислые стрептококки, лактобактерии и др.). В этих продуктах исследуют молочнокислую микро­флору бактериоскопическим изучением маз­ков из них, окрашенных метиленовым синим. Отсутствие характерной молочнокислой мик­рофлоры и наличие посторонней микрофло­ры (плесневые грибы, дрожжи и др.) указыва­ют на неудовлетворительное приготовление, нарушение технологии или неправильное хранение продуктов. Исключение составляют кефир, кумыс, в которых при микроскопичес­ком исследовании обязательно выявляются в поле зрения 2-5 дрожжевых клеток, пос­кольку эти продукты есть результат комби-

нированного брожения — молочнокислого и спиртового.

Некоторые ориентировочные микробиоло­гические показатели приведены в табл. 4.3.

Консервированные продукты питания не должны содержать кишечную палочку, про­тей и патогенные микробы. При исследова­нии таких пищевых продуктов, как консервы овощные, рыбные, мясные, предусмотрено:

1. Обнаружение аэробных микроорганизмов.

2. Обнаружение анаэробных микроорганизмов.

3. Определение ботулинических экзотоксинов.

4.5.4. Микробиологический контроль лекарственных средств

Обсеменение лекарственного сырья возмож­но на всех этапах его заготовки и при хра­нении. Активному размножению микроорга­низмов способствует увлажнение растений и растительного сырья. Размножившиеся мик­роорганизмы вызывают изменение фармако­логических свойств препаратов, полученных из лекарственных растений. Микроорганизмы могут также попадать из окружающей среды, от людей и обсеменять лекарственные препараты в процессе их изготовления из растительного сырья. Для соблюдения санитарного режима изготовления лекарственных препаратов про­водят санитарно-микробиологический конт­роль объектов окружающей среды предприятия

Таблица 4. 3. Ориентировочные микробиологические показатели некоторы:
Продукт	Общее микробное число	Наличие БГКП (коли-титр)
Молоко, сливки, пахта	75 000-150000	Не менее 3
Сухое молоко	Не более 2500	Не допускается
Кефир	Не исследуется	Не менее 0,3
Полуфабрикаты из рубленого мяса (кот­леты шницели и яр.)	Не более 1000	Не допускается
Жареная и печеная рыба	Не более 1000	Не должны быть в 10 г продукта

и каждой серии выпускаемой лекарственной формы. Лекарственные средства для паренте­рального введения в виде инъекций, глазные капли, мази, пленки и др., в отношении кото­рых имеются соответствующие указания в нор­мативно-технической документации, должны быть стерильными. Контроль стерильности ле­карственных средств проводят путем посева на тиогликолевую среду для выявления различных бактерий, в том числе анаэробов; при посеве на среду Сабуро выявляют грибы, главным обра­зом рода Candida . Стерильность лекарственных средств с антимикробным действием определя­ют путем мембранной фильтрации: фильтр пос-лe фильтрации исследуемого препарата делят на части и вносят для подращивания задержанных микроорганизмов в жидкие питательные сре­ды. При отсутствии роста препарат считается стерильным.

Лекарственные средства, не требующие стерилизации, обычно содержат микроорга­низмы. Поэтому их испытывают на микро­биологическую чистоту: проводят количес­твенное определение жизнеспособных бак-терий и грибов в 1 г или 1 мл препарата, а

также выявляют микроорганизмы (бактерии семейства энтеробактерий, синегнойная па­лочка, золотистый стафилококк), которые не должны присутствовать в нестерильных ле­карственных средствах. В 1 г или 1 мл лекарс­твенного сырья для приема внутрь должно быть не более 1000 бактерий и 100 дрожжевых и плесневых грибов; должны отсутствовать кишечные палочки и сальмонеллы. В случаях местного применения (полость уха, носа, ин-травагинальное использование) количество микроорганизмов не должно превышать 100 (суммарно) микробных клеток на 1 г или 1 мл препарата при отсутствии энтеробактерий, синегнойной палочки и золотистого стафи­лококка. В таблетированных препаратах не должно быть патогенной микрофлоры, а об­щая обсемененность не должна превышать 10 тыс. микробных клеток на таблетку. Средства гигиены полости рта, зубные пасты и элек-сиры, жевательные резинки не должны со­держать синегнойную палочку, бактерии се­мейства Enterobactericeae, плесневые грибы и грибы рода Candida; микробное число должно быть не более 100 КОЕ/г.

ГЛАВА 5. ГЕНЕТИКА МИКРОБОВ

Строение генома бактерий

Бактериальный геном состоит из генети­ческих элементов, способных к самостоятель­ной репликации (син. воспроизведение), т. е. репликонов. Репликонами являются бактери­ альная хромосома и плазмиды.

Наследственная информация хранится у бактерий в форме последовательности нук-леотидов ДНК, которые определяют после­довательность аминокислот в белке (строение ДНК изложено в разд. 2.1 и показано на рис. 2.1). Каждому белку соответствует свой ген, т. е. дискретный участок на ДНК, отличаю­щийся числом и специфичностью последова­тельности нуклеотидов.

5.1.1. Бактериальная хромосома
Бактериальная хромосома представлена одной

двухцепочечной молекулой ДНК кольцевой фор­мы. Размеры бактериальной хромосомы у различ­ных представителей царства Procaryotae варьируют от 3 х 10^⁸ до 2,5 х 10⁹ Да, что соответствует 3,2 х 10⁶ нуклеотидных пар (н.п.). Например, у Е. coli бак­териальная хромосома содержит 5х10^6 н.п. Для сравнения: размеры ДНК вирусов составляют порядка 10³ н.п., дрожжей — 10⁷ н.п., а суммарная длина хромосомных ДНК человека составляет 3 х 10⁹ н.п. Бактериальная хромосома формиру­ет компактный нуклеоид бактериальной клетки. Бактериальная хромосома имеет гаплоидный на­бор генов. Она кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции.

5.1.2. Плазмиды бактерий

Плазмиды представляют собой двухце-почечные молекулы ДНК размером от 10^³

до 10^⁶ н.п. Они кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преиму­щества при попадании в неблагоприятные условия существования.

Среди фенотипических признаков, сооб­щаемых бактериальной клетке плазмидами. можно выделить следующие:

1) устойчивость к антибиотикам;

2) образование колицинов;

3) продукция факторов патогенности;

4) способность к синтезу антибиотических веществ;

5) расщепление сложных органических ве­ществ;

6) образование ферментов рестрикции и модификации.

Репликацию плазмидной ДНК осуществля­ет тот же набор ферментов, что и репликацию бактериальной хромосомы (см. разд. 3.1.7 и рис. 3.6), однако репликация плазмид проис­ходит независимо от хромосомы.

Некоторые плазмиды находятся под стро­ гим контролем. Это означает, что их реплика­ция сопряжена с репликацией хромосомы так. что в каждой бактериальной клетке присутс­твует одна или, по крайней мере, несколько копий плазмид.

Число копий плазмид, находящихся под слабым контролем, может достигать от 10 до 200 на бактериальную клетку.

Для характеристики плазмидных реплико­нов их принято разбивать на группы совмести­мости. Несовместимость плазмид связана с не­способностью двух плазмид стабильно сохра­няться в одной и той же бактериальной клетке. Несовместимость свойственна тем плазмидам. которые обладают высоким сходством репли­конов, поддержание которых в клетке регули­руется одним и тем же механизмом.

Некоторые плазмиды могут обратимо встраиваться в бактериальную хромосому и функционировать в виде единого репликона. Такие плазмиды называются интегративными или эписомами.

Некоторые бактериальные плазмиды спо­собны передаваться из одной клетки в другую.

иногда даже принадлежащую иной таксоно­мической единице. Такие плазмиды назы-заются трансмиссивными (конъюгативными, син.) Трансмиссивность присуща лишь круп­ным плазмидам, имеющим tra-оперон, в ко­торый объединены гены, ответственные за пе-ренос плазмиды. Эти гены кодируют половые пили, которые образуют мостик с клеткой, не содержащей трансмиссивную плазмиду, по которой плазмидная ДНК передается в новую клетку. Этот процесс называется конъюгацией; подробно он будет рассмотрен в разд. 5.4.1.

Мелкие плазмиды, не несущие tra-гены, не могут передаваться сами по себе, но способны к передаче в присутствии трансмиссивных ллазмид, используя их аппарат конъюгации. Такие плазмиды называются мобилизуемыми, а сам процесс — мобилизацией нетрансмис-сивной плазмиды.

Особое значение в медицинской микроби­ологии имеют плазмиды, обеспечивающие устойчивость бактерий к антибиотикам, ко­торые получили название R-плазмид, и плаз­миды, обеспечивающие продукцию факторов патогенности, способствующих развитию ин­фекционного процесса в макроорганизме.

R-плазмиды ( resistance — противодействие, англ.) содержат гены, детерминирующие син­тез ферментов, разрушающих антибактери­альные препараты (например, антибиотики).

В результате наличия такой плазмиды бакте­риальная клетка становится устойчивой (резис­тентной) к действию целой группы лекарствен­ных веществ, а иногда и нескольким препаратам. Многие R-плазмиды являются трансмиссивными, распространяясь в популяции бактерий, делая ее недоступной к воздействию антибактериальных препаратов. Бактериальные штаммы, несущие R-плазмиды, очень часто являются этиологическими агентами внутриболъничных инфекций.

Плазмиды, детерминирующие синтез фак­торов патогенности, в настоящее время об­наружены у многих бактерий, являющихся возбудителями инфекционных заболеваний человека. Патогенность возбудителей шигел-лезов, иерсиниозов, чумы, сибирской язвы, иксодового бореллиоза, кишечных эшерихи-озов связана с наличием у них и функциони­рованием плазмид патогенности. Первыми, из этой группы плазмид были определены

Ent-плазмида, определяющая синтез энтеро-токсина, и Hly-плазмида, детерминирующая синтез гемолизина у Е. coli .

Некоторые бактериальные клетки содержат плазмиды, детерминирующие синтез бакте­рицидных по отношению к другим бактериям веществ. Например, некоторые Е. coli вла­деют Col-плазмидой, определяющей синтез колицинов, обладающих микробоцидной ак­тивностью по отношению к колиформным бактериям. Бактериальные клетки, несущие такие плазмиды, обладают преимуществами при заселении экологических ниш.

Плазмиды используются в практической деятельности человека, в частности в генной инженерии, при конструировании специаль­ных рекомбинантных бактериальных штам­мов, вырабатывающих в больших количествах биологически активные вещества (см. гл. 6).

5.1.3. Подвижные генетические элементы

В состав бактериального генома, как в бак­териальную хромосому, так и в плазмиды, входят подвижные генетические элементы. К подвижным генетическим элементам от­носятся вставочные последовательности и транспозоны.

Вставочные (инсерционные) последова­тельности IS-элементы { insertion sequences , англ.)— это участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка реп-ликона в другой, а также между репликона-ми. IS-элементы имеют размеры -1000 н.п. и содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения — транс­позиции: ген, кодирующий фермент транспо- зазу, обеспечивающую процесс исключения IS-элемента из ДНК и его интеграцию в но­вый локус, и ген, детерминирующий синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения.

Отличительной особенностью IS-элемен-тов является наличие на концах вставочной последовательности инвертированных повто­ ров. Эти инвертированные повторы узнает фермент транспозаза (рис. 5.1). Транспозаза осуществляет одноцепочечные разрывы це­пей ДНК, расположенных по обе стороны от подвижного элемента. Оригинальная копия IS-элемента остается на прежнем месте, а ее

реплицированный дупликат перемещается на новый участок.

Перемещение подвижных генетических элементов принято называть репликативной или незаконной рекомбинацией. Однако в отличие от бактериальной хромосомы и плаз-мид подвижные генетические элементы не являются самостоятельными репликонами, так как их репликация — составной элемент репликации ДНК репликона, в составе кото­рого они находятся.

Известно несколько разновидностей IS-элементов, которые различаются по раз­мерам и по типам и количеству инвертиро­ванных повторов.

Транспозоны — это сегменты ДНК, облада­ющие теми же свойствами, что и IS-элемен-ты, но имеющие структурные гены, т. е. гены, обеспечивающие синтез молекул, обладаю­щих специфическим биологическим свойс­твом, например токсичностью, или обеспечи­вающих устойчивость к антибиотикам.

Перемещаясь по репликону или между реп­ликонами, подвижные генетические элемен­ты вызывают:

1. Инактивацию генов тех участков ДНК, куда они, переместившись, встраиваются.

2. Образование повреждений генетического материала.

3. Слияние репликонов, т. е. встраивание плазмиды в хромосому.

4. Распространение генов в популяции бак­терий, что может приводить к изменению биологических свойств популяции, смене возбудителей инфекционных заболеваний, а

также способствует эволюционным процес­сам среди микробов.

Изменения бактериального генома, а следо­вательно, и свойств бактерий могут происхо­дить в результате мутаций и рекомбинаций.

Мутации у бактерий

Мутации — это изменения в последо­вательности отдельных нуклеотидов ДНК. которые ведут к таким проявлениям, как из­менения морфологии бактериальной клет­ки, возникновение потребностей в факторах роста, например в аминокислотах, витами­нах, т. е. ауксотрофности; к устойчивости к антибиотикам, изменению чувствительнос­ти к температуре, снижению вирулентноти (аттенуация) и т. д.

По протяженности изменений поврежде­ния ДНК различают мутации точечные, когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов, и протяженные или аберрации. В последнем случае могут наблюдаться выпа­дения нескольких пар нуклеотидов, которые называются делецией, добавление нуклеотид-ных пар, т. е. дупликации, перемещения фраг­ментов хромосомы, транслокации и переста­новки нуклеотидных пар — инверсии.

Мутации могут быть спонтанными, т. е. воз­никающими самопроизвольно, без воздейс­твия извне, и индуцированными.

Точечные спонтанные мутации возникают в результате возникновения ошибок при репли­кации ДНК, что связано с таутомерным пере­мещением электронов в азотистых основаниях.

Тимин, например, обычно находится в кетоформе. в которой он способен образовывать водородные связи с аденином. Но если тимин во время спари­вания оснований при репликации ДНК переходит в енольную форму, то он спаривается с гуанином. В ре­зультате в новой молекуле ДНК на месте, где раньше стояла пара А—Т, появляется пара Г—Ц.

Спонтанные хромосомные аберрации возни­кают вследствие перемещения подвижных ге­нетических элементов.

Индуцированные мутации появляются под влиянием внешних факторов, которые на-

зываются мутагенами. Мутагены бывают физическими (УФ-лучи, гамма-радиация), химическими (аналоги пуриновых и пири-мидиновых оснований, азотистая кислота и ее аналоги и другие соединения) и биологиче-кими — транспозоны.

Аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, например 2-аминопурин, 5-бромурацил, включаются в нуклеотиды, а следовательно, и в ДНК, но при этом они значительно чаще в силу таутомерных превраще­ний спариваются с «неправильными» партнерами, в результате вызывая замену пурина другим пурином (А—Г) или пиримидина другим пиримидином (Т—Ц). Замены пурина на пурин, а пиримидина на пирими­дин называются транзициями.

Азотистая кислота и ее аналоги вызывают дезами-нирование азотистых оснований, результатом чего являются ошибки при спаривании и, как следствие, возникновение транзиции. Аденин в результате де-заминирования превращается в гипоксантин, ко­торый спаривается с цитозином, что приводит к возникновению транзиции AT—ГЦ. Гуанин же при дезаминировании превращается в ксантин, который по-прежнему спаривается с цитозином; таким обра­зом, дезаминирование гуанина не сопровождается

му тацией.

Акридин и профлавин внедряются между сосед­ними основаниями цепи ДНК, вдвое увеличивая расстояние между ними. Это пространственное из­менение при репликации может привести как к ут-рате нуклеотида, так и включению дополнительной нуклеотидной пары, что приводит к сдвигу рамки счи­ тывания тРНК. Начиная с того места, где произошло зыпадение или включение нуклеотида, информация считывается неправильно.

УФ-облучение затрагивает преимущественно пи-- чидиновые основания, при этом два соседних ос­татка тимина ДНК могут оказаться ковалентно свя-

нными.

На бактериях, подвергнутых УФ-облу-чению, было показано, что повреждения, вызванные облучением в бактериальных ЛНК, могут частично исправляться бла­годаря наличию репарационных систем. У различных бактерий имеется несколько типов репарационных систем. Один тип репарации протекает на свету, он связан с деятельностью фотореактивирующегося фермента, который расщепляет тимино-вый димер. При темновой репарации де-

фектные участки цепи ДНК удаляются, и образовавшаяся брешь достраивается при помощи ДНК-полимеразы на матрице со­хранившейся цепи и соединяется с цепью лигазой (рис. 5.2).

Мутация, приводящая к потере функции, называется прямой мутацией. У мутантов может произойти восстановление исходных свойств, т. е. реверсия ( reverse — обратный, англ.) Если происходит восстановление ис­ходного генотипа, то мутация, восстанавли­вающая генотип и фенотип, называется об­ратной или прямой реверсией. Если мутация восстанавливает фенотип, не восстанавли­вая генотип, то такая мутация называется супрессорной. Супрессорные мутации могут возникать как в пределах того самого гена, в котором произошла первичная мутация, так в других генах или могут быть связаны с мута­циями в тРНК.

Рекомбинация у бактерий

Генетическая рекомбинация — это взаимо­действие между двумя геномами, т. е. между двумя ДНК, обладающими различными ге­нотипами, которое приводит к образованию рекомбинантной ДНК, формированию до­чернего генома, сочетающего гены обоих родителей.

Отсутствие полового размножения и мей-оза, в процессе которых у высших организ­мов происходит рекомбинация, гаплоидный набор генов и определяют особенности ре­комбинации у бактерий. В процессе реком­бинации бактерии условно делятся на клет­ки-доноры, которые передают генетический материал, и клетки-реципиенты, которые воспринимают его. В клетку-реципиент проникает не вся, а только часть хромо­сомы клетки-донора, что приводит к фор­мированию неполной зиготы — мерозиготы. В результате рекомбинации в мерозиготе об­разуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента, с включенным в него фрагмен­том хромосомы донора. Реципроктные ре-комбинанты не образуются.

По молекулярному механизму генетичес­кая рекомбинация у бактерий делится на три вида: гомологичную, сайт-специфическую и незаконную.

5.3.1. Гомологичная рекомбинация

При гомологичной рекомбинации в процессе раз­рыва и воссоединения ДНК происходит обмен меж­ду участками ДНК, обладающими высокой степенью гомологии. Гомологичная рекомбинация происхо­дит через образование промежуточного соединения, крестообразной структуры Холидея или полухиаз­ мы (рис. 5.3). В полухиазме осуществляется комп­лементарное спаривание между одноцепочечными участками, принадлежащими разным родительским молекулам ДНК. Процесс гомологичной рекомби­нации находится под контролем генов, объединен-

ных в REC-систему, состоящую из генов recA, B, C, D. Продукты этих генов производят расплетание нитей ДНК и их переориентацию с образованием структу­ры Холидея, а также разрезают структуру Холидея для завершения процесса рекомбинации.

5.3.2. Сайт-специфическая рекомбинация

Происходит в определенных участках генома и не требует высокой степени гомологии ДНК. Этот тип рекомбинации не зависит от функционирования генов recA,B,C,D. Примером этого типа рекомби­нации является встраивание плазмиды в хромосому бактерий, которое происходит между идентичными IS-элементами хромосомы и плазмиды, интеграция ДНК фага в хромосому Е. coli. Сайт-специфическая рекомбинация, происходящая в пределах одного репликона, участвует также в переключении актив-

Рис, 5.4. Схемы: 1 — конъюгации у бактерий; 2 — трансдукции; 3 — трансформации

ности генов. Например, у сальмонелл следствием этого процесса являются фазовые вариации жгути­кового Н-антигена.

5.3.3. Незаконная или репликативная рекомбинация

Незаконная или репликативная рекомбинация не зависит от функционирования генов recA,B,C,D. Примером ее является транспозиция подвижных ге­нетических элементов по репликону или между реп-ликонами, при этом, как уже было отмечено в разд. 5.1.3, транспозиция подвижного генетического эле­мента сопровождается репликацией ДНК.

Рекомбинация у бактерий является конечным эта­пом передачи генетического материала между бакте­риями, которая осуществляется тремя механизмами: конъюгацией (при контакте бактерий, одна из кото­рых несет конъюгативную плазмиду), трансдукцией (при помощи бактериофага), трансформацией (при помощи высокополимеризованной ДНК) (рис. 5.4).