5.4.1. Конъюгация

Передача генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиент путем непосредственною контакта клеток назы­вается конъюгацией.

Передача генетического материала от клет­ки-донора в клетку-реципиент впервые была обнаружена Дж. Ледербергом и Э. Тейтумом в 1946 г.

Необходимым условием для конъюгации является наличие в клетке-доноре транс­миссивной плазмиды.

Трансмиссивные плазмиды кодируют по­ловые пили, образующие конъюгационную трубочку между клеткой-донором и клеткой-реципиентом, по которому плазмидная ДНК передается в новую клетку. Механизм пере­дачи плазмидной ДНК из клетки в клетку заключается в том, что специальный белок, кодируемый tra-опероном, «узнает» опреде­ленную последовательность в ДНК плазмиды (называемую origin — начало, англ., перено-

са), вносит в эту последовательность однопе-почечный разрыв и ковалентно связывается с 5'-концом. Затем цепь ДНК, с которой связан белок, переносится в клетку-реципи­ент, а неразорванная комплементарная цепь остается в клетке-доноре. Клеточный аппарат синтеза ДНК достраивает одиночные цепи и в доноре и в реципиенте до двухцепочечной структуры. Белок связанный с 5'-концом пе­ренесенной цепи, способствует замыканию плазмиды в реципиентной клетке в кольцо. Этот процесс представлен на рис. 5.4, 1А на примере переноса в реципиентную клетку плазмиды F { fertility — плодовитость, англ.). которая является как трансмиссивной, так и интегративной плазмидой. Клетки-доноры, обладающие F-фактором, обозначаются как F⁺-клетки, а клетки-реципиенты, не имею­щие F-фактора, обозначаются как F-клетки. Если F-фактор находится в клетке-доноре в автономном состоянии, то в результате скре­щивания: F⁺ х F~ клетка-реципиент приобре­тает донорские свойства (см. рис. 5.4, 1А).

Если F-фактор или другая трансмиссивная плазмида встраиваются в хромосому клетки-донора, то плазмида и хромосома начинают функционировать в виде единого трансмис­сивного репликона, что делает возможным пе­ренос бактериальных генов в бесплазмидную клетку-реципиент, т. е. процесс конъюгации. Штаммы, в которых плазмида находится в интегрированном состоянии, переносят свои хромосомные гены бесплазмидным клеткам с высокой частотой и поэтому называются Hfr (от англ. high frequency of recombination — высо­кая частота рекомбинации)

Процесс переноса хромосомных генов в слу­чае скрещивания: Hfr xF~ всегда начинается с расщепления ДНК в одной и той же точке, месте интеграции F-фактора или другой транс­миссивной плазмиды. Одна нить донорской ДНК передается через конъюгационный мос­тик в реципиентную клетку. Процесс сопро­вождается достраиванием комплементарной нити до образования двунитчатой структуры. Перенос хромосомных генов при конъюга­ции всегда имеет одинаковую направленность, противоположную встроенной плазмиде. Сама трансмиссивная плазмида передается послед­ней. Переданная в реципиентную клетку и до-

строенная до двунитчатой структуры нить ДНК донора рекомбинирует с гомологичным участ­ком реципиентной ДНК с образованием ста­бильной генетической структуры. Вследствие хрупкости конъюгационного мостика половой фактор редко передается в клетку-реципиент, поэтому образовавшиеся рекомбинант донор­скими функциями как правило не обладает.

Вследствие направленности передачи генов ко­нъюгация используется для картирования генома бактерий и построения генетической карты.

5.4.2. Трансдукция

Трансдукцией называют передачу бактери-альной ДНК посредством бактериофага.

Этот процесс был открыт в 1951 г. Н. Циндером и Дж. Ледербергом. В процессе репликации фага внутри бактерий (см. разд. 3.5) фрагмент бактериальной ДНК проникает в фаговую частицу и переносится в реципиен-тную бактерию во время фаговой инфекции. Существует два типа трансдукции:

общая трансдукция — перенос бактериофа­гом фрагмента любой части бактериальной хромосомы — происходит вследствие того, что бактериальная ДНК фрагментируется после фаговой инфекции и кусочек бактериальной ДНК того же размера, что и фаговая ДНК, проникает в вирусную, формируя дефектную фаговую частицу с частотой приблизительно 1 на 1000 фаговых частиц (рис. 5.4, 2А). При инфицировании клетки-реципиента дефек­тной фаговой частицей ДНК клетки-донора «впрыскивается» в нее и рекомбинирует го­мологичной рекомбинацией с гомологичным участком хромосомы-реципиента с образова­нием стабильного рекомбинанта. Этим типом трансдукции обладают Р-фаги;

специфическая трансдукция — наблюдается в том случае, когда фаговая ДНК интегрирует в бактериальную хромосому с образованием профага. В процессе исключения ДНК-фага из бактериальной хромосомы в результате случайного процесса захватывается приле­гающий к месту включения фаговой ДНК фрагмент бактериальной хромосомы, стано­вясь дефектным фагом (рис. 5.4, 2Б). Так как большинство умеренных бактериофагов

интегрирует в бактериальную хромосому в специфических участках, для таких бакте­риофагов характерен перенос в клетку-ре­ципиент определенного участка бактериаль­ной ДНК клетки-донора. ДНК дефектного фага рекомбинирует с ДНК клетки-реципи­ента сайт-специфической рекомбинацией. Рекомбинант становится меродиплоидом по привнесенному гену. В частности, бактери-офагпередает специфической трансдукцией gal-ген у Е. coli .

5.4.3. Трансформация

Феномен трансформации впервые был опи­сан в 1928 г. Ф. Гриффитсом, обнаружившим превращение бескапсульного R-штамма пнев­мококков ( Streptococcus pneumoniae ) в штамм, образующий капсулу S-формы. Гриффите ввел мышам одновременно небольшое количество авирулентных R-клеток и убитых нагреванием S-клеток. R-клетки были получены от штамма, капсульное вещество которого принадлежало к типу S II, а убитые нагреванием S-штаммы принадлежали к типу SIII. Из крови погибших мышей были выделены вирулентные пневмо­кокки с капсулой S III.

Природу трансформирующего фактора в 1944 г. установили О. Эвери, К. Мак-Леод, М. Мак-Карти, которые показали, что ДНК, экстрагированная из инкапсулированных пневмококков, может трансформировать не-капсулированные пневмококки в инкапсу­лированную форму. Таким образом, было до­казано, что именно ДНК является носителем генетической информации.

Процесс трансформации может самопро­извольно происходить в природе у некоторых видов бактерий, чаще у грамположительных, когда ДНК, выделенная из погибших клеток, захватывается реципиентными клетками.

Процесс трансформации зависит от ком­петентности клетки-реципиента и состо­яния донорской трансформирующей ДНК. Компетентность — это способность бактери­альной клетки поглощать ДНК. Она зависит от присутствия особых белков в клеточной мембране, обладающих специфическим аф­финитетом к ДНК. Состояние компетентнос­ти у грамположительных бактерий связано с определенными фазами кривой роста.

Трансформирующей активностью обла­дает только двунитчатая высокоспирализо-ванная молекула ДНК.

Это связано с тем, что в клетку-реципиент проникает только одна нить ДНК, тогда как другая — на клеточной мембране — подвер­гается деградации с освобождением энергии, которая необходима для проникновения в клетку сохранившейся нити. Высокий моле­кулярный вес трансформирующей ДНК уве­личивает шанс рекомбинации, так как внутри клетки трансформирующая нить ДНК подвер­гается воздействию эндонуклеаз. Интеграция с хромосомой требует наличия гомологичных с ней участков у трансформирующей ДНК. Рекомбинация происходит на одной нити, в результате чего образуется гетеродуплексная молекула, одна нить которой имеет гено­тип реципиента, а другая — рекомбинантный генотип. Рекомбинантные трансформанты формируются только после цикла реплика­ции (рис. 5.4, 3).

В настоящее время этот метод является ос­новным методом генной инженерии, исполь­зуемым при конструировании рекомбинант-ных штаммов с заданным геномом.