Первооткрывателем вирусов, основоположником вирусологии является русский ученый Дмитрий Иосифович Ивановский, открывший в 1892 году вирус табачной мозаики (ВТМ)

Вирусы настолько отличаются от микроорганизмов, что выделены в особое царство - царство Vira.

Особенности вирусов, отличающие их от всех других живых существ:

наличие только одного типа нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК, в то время как клетки всех остальных живых существ содержат ДНК и РНК, взаимодействие которых необходимо для биосинтеза белков;

отсутствие собственных белоксинтезирующих систем и клеточного строения;

внутриклеточный паразитизм на молекулярном (генетическом) уровне;

убиквитарность (распространенны повсеместно);

имеют микроскопические размеры.

Внеклеточная форма вируса - вирион и вирус, находящийся внутри клетки хозяина - это две разные формы вируса.

Вирионы разных вирусов имеют размеры от 15 до 400 нанометров. Нанометр - это 10-9 метра (рис. 6). Наиболее мелкие вирусы - вирусы полиомиелита - имеют вирион размером 17-25 им, средние - вирус гриппа - 80-120 нм, крупные - вирус оспы - 300-400 им.

В центре вириона располагается его геном. Это нуклеиновая кислота - ДНК или РНК (однонитевая или двунитевая). Плюс-однонитевая РНК несет две функции: наследственную и информационную, например у вируса полиомиелита. Минус-однонитевая РНК, как, например, у вируса гриппа, несет только наследственную функцию, и только в процессе репродукции вируса к ней достраивается плюс-нить иРНК.

Вокруг нуклеиновой кислоты симметрично располагаются белковые молекулы - капсомеры, составляющие капсид (лат. capsa - коробка). Различают спиральный тип симметрии, когда капсомеры уложены по всей длине молекулы нуклеиновой кислоты, и кубический, когда кап­сомеры располагаются в виде двадцатигранника (икосаэдра).

Вирионы, содержащие только нуклеиновую кислоту и белок, составляют нуклеокапсид. Это простые вирусы, например, ВТМ, вирус полиомиелита.

У вирионов сложноорганизованных вирусов имеется еще поверхностная оболочка - суперкапсид, содержащий, кроме белков, также углеводы, липиды, компоненты клетки хозяина. Строение вирио­на лежит в основе классификации вирусов. По типу нуклеиновой кислоты их делят на: рибовирусы и дезоксири-бовирусы, далее по структуре вирионов, по месту размножения и по другим признакам проводится деление на семейства и роды.

Вследствие малых размеров вирусы не видны в световом микроскопе. Только наиболее крупный из них - вирус оспы - можно наблюдать в виде мелких точечных образований - элементарных телец Пашена.

Размножаясь в чувствительных клетках организма, вирусы оспы, бешенства, гриппа образуют в них внутриклеточные включения. Их можно обнаружить в световом или в люминесцентном микроскопе. Обнаружение внутриклеточных включений используется для диагностики. Например, включения Бабеша-Негри в нервных клетках обнаруживаются при бешенстве.

Морфологию вирионов изучают в электронном микроскопе. Вирусы имеют разные формы: сферическую, нитевидную, палочковидную.

Методы культивирования вирусов:

Заражение животных (в\брюшинно, в\в, в\м, интраназально, заражение в мозг и другие)

На куриных эмбрионах после заражения их на хорион – аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, в амниотическую полость, в желточный мешок.

На культуре клеток различных тканей.

Культура ткани – это клетки ткани, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен веществ и восприимчивость к определенным вирусам. Наиболее пригодными для культивирования вирусов являются клетки с быстрым росток и высоким обменом веществ. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки амниона человека и др.), а также культуры тканей опухолей. Выращивание клеток культур тканей производят в специальных флаконах (колбы – матрицы, флаконы Карреля и др.) и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь какую – либо опору, например, пластинки стекла, стенку пробирки. В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда или пластинку стекла в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста другой микрофлоры (кроме вирусов) вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками, чаще пенициллином и стрептомицином. Размножение вируса в клетках определяют по цитопатическому действию (ЦПД): в результате размножения вируса в клетках при микроскопии обнаруживаются включения, дегенеративные изменения и в конечном итоге клетки гибнут. Так как рост клеток прекращается, ph среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса). В связи с этим не изменяется и цвет среды. Питательной средой для культуры тканей могут быть различные растворы, состав которых приближается к составу жидкостей организма (синтетическая среда 199, солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактальбумина с сывороткой и другие). В настоящее время в вирусологической практике чаще всего применят свежие культуры клеток (первичные или первично – трипсинизированные) и перевиваемые культуры (линии) клеток.

Первично – трипсинизированные культуры клеток готовят из органов взрослых животных (чаще из почек обезьян и других животных) и эмбрионов человека, куриных фиброфластов путем трипсинизации кусочков тканей с последующим культивированием в питательной среде. С этой целью кусочки тканей измельчают ножницами (или другим способом), а затем промывают буферным раствором Хенкса для удаления крови и обрабатывают 0,25 – 0,3 % раствором трипсина. Трипсин разрушает межклеточные мостики и освобождает клетки. С помощью камеры Горяева подсчитывают количество клеток, разводят до концентрации 400 тыс. клеток в 1 мл. Полученную взвесь клеток разливают в пробирки, плотно закрывают стерильными резиновыми пробками и помещают в термостат при 37°С в почти горизонтальном положении (под углом 50°) в специальных штативах. Через 3-4 дня на стенке пробирки образуется сплошной слой размножившихся клеток. Пробирки с хорошим ростом ткани отбирают для заражения вирусом.

Перевиваемые культуры клеток (растущие) - это стабильные линии клеток, пассируемые вне организма в течение многих лет. Их получают из злокачественных опухолей и из нормальных (эмбриональных) тканей человека и животных. К ним относятся: 1) линия Hela – клетки карциномы шейки матки человека; 2)линия Hep – 2 – клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) линия Детройт – 6 – клетки, выделенные из костного мозга человека, больного раком легких; 4) линии А – 0 и А – 1 – клетки амниона человека; 5) линия СОЦ – клетки сердца обезьяны циномольгус и другие.

Полуперевиваемые или диплоидные культуры клеток – это клетки тканей человека, сохраняющие в процессе пассажей – диплоидный набор хромосом. Диплоидные клетки человека не подвергаются злокачественному перерождению и этим выгодно отличаются от опухолевых.

Методы культивирования вирусов

Вирусы - строгие внутриклеточные паразиты, поэтому их можно выращивать только в живых клетках. Для культивирования вирусов используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбрионы и культуры клеток.

Лабораторные животные: белые мыши (для вирусов гриппа, Коксаки), кролики (вирус бешенства). Индикацию, то есть обнаружение вируса, проводят на основании развития типичных признаков заболевания и изменений органов животного.

Куриные эмбрионы 5-19-дневной инкубации пригодны для культивирования большинства вирусов: Преимущества метода: стерильность и отсутствие скрытых вирусных инфекций, возможность получения вирусов в больших количествах, простота техники работы. В зависимости от цели и от вида вируса материал вносят на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, желточный мешок, амниотическую полость. Индикацию вирусов проводят по характеру колоний вируса на хорион-аллантоисной оболочке. В аллантоисной жидкости вирусы обнаруживают по реакции гемагглютинации. Эта реакция основана на способности вируса гриппа и некоторых других вирусов агглютинировать (склеивать) куриные эритроциты.

Культура клеток - это клетки из органа животного или человека, которые живут и размножаются вне организма в питательном растворе (в среде 199 или в среде Хенкса). Культивирование в культуре клеток - один из наиболее распространенных методов в вирусологии. Чаще всего применяются однослойные культуры клеток, прикрепленные к стенкам пробирок или плоских флаконов. Различают несколько типов культур.

первично-трипсинизированные, которые получают, обрабатывая трипсином исходную ткань, например, почки обезьян, или эмбриональную ткань человека. Культура клеток используется однократно.

перевиваемые культуры клеток способны размножаться при многократных посевах на свежие питательные среды. Они могут поддерживаться в лаборатории путем постоянных пересевов в течение десятков лет. Во многих лабораториях применяются перевиваемые культуры, полученные из раковой ткани человека: HeLa, ИЕр-2 и др.

полуперевиваемые культуры клеток - это, например, диплоидные клетки из фибробластов человеческого эмбриона, способные размножаться в течение 40-50 пассажей (пересевов), сохраняя исходный диплоидный набор хромосом.

Обнаружение вирусов в культуре клеток. Вирусы в культуре клеток обнаруживаются по цитопатическому действию (ЦПД), которое вызывают многие вирусы, например, вирус полиомиелита. ЦПД проявляется в дегенерации и разрушении клеток, или в формировании мно­гоядерных клеток.

ЦПД можно обнаружить по цветной пробе. Для этого используют клетки, помещенные в питательную среду с индикатором, например, метиловым красным. При размножении незараженных клеток образуются кислые продукты метаболизма, и индикатор меняет цвет на желтый. Если клетки заражены вирусом, происходит нарушение нормального метаболизма клеток, и цвет среды не меняется.

Репродукцию вируса в клетке можно обнаружить и по образованию внутриклеточных включений.

Для подсчета количества вирионов используют метод бляшек. Клеточный монослой, покрытый тонким слоем агара, в плоском флаконе, заражают вирусом и по количеству бляшек или "стерильных пятен" подсчитывают количество вирионов. Считается, что одна бляшка образуется при размножении одного вириона.

Репродукцию вируса в клетке можно обнаружить также по реакции гемадсорбции. Это вариант реакции гемагглютинации. Эритроциты, внесенные в культуру клеток, адсорбируются на поверхности клеток, зараженных вирусом. Реакцию применяют, например, для обнаружения вируса гриппа