Микроскоп - это оптический прибор, позволяющий получить обратное изображение изучаемого объекта и рассмотреть мелкие детали его строения, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза.

Разрешающая способность микроскопа – это наименьшее расстояние между двумя точками объекта, которые воспринимаются глазом раздельно и не сливаются в одну: чем меньше размер частицы, видимой в микроскоп, тем больше его разрешающая способность. Разрешающая способность объектива зависит от длины волны света и числовой апертуры объективов и конденсора.

Микроскоп состоит из оптической и механической частей.

Механическая часть представлена:

· штатив

· тубус;

· предметный столик

Оптическая часть представлена:

· зеркало

· конденсор

· объектив

· окуляр

Правила работы с микроскопом

1. Работать сидя;

2. осмотреть, вытереть

3. установить перед собой, немного слева на 2-3 см от края стола. Во время работы не сдвигать;

4. Открыть полностью диафрагму, поднять конденсор в крайнее верхнее положение;

5. Работу с микроскопом всегда начинать с малого увеличения;

6. Опустить объектив в рабочее положение, т.е. на расстояние 1 см от предметного стекла;

7. Установить освещение в поле зрения микроскопа, используя электроосветитель или зеркало.

8. Положить микропрепарат на предметный столик так, чтобы изучаемый объект находился под объективом. Глядя сбоку, опускать объектив при помощи макровинта до тех пор, пока расстояние между нижней линзой объектива и микропрепаратом не станет 4-5 мм;

9. Смотреть одним глазом в окуляр и вращать винт грубой наводки на себя, плавно поднимая объектив до положения, при котором хорошо будет видно изображение объекта. Нельзя смотреть в окуляр и опускать объектив. Фронтальная линза может раздавить покровное стекло, и на ней появятся царапины;

10. Передвигая препарат рукой, найти нужное место, расположить его в центре поля зрения микроскопа;

11. Если изображение не появилось, то надо повторить все операции пунктов 6, 7, 8, 9;

12. Для изучения объекта при большом увеличении, сначала нужно поставить выбранный участок в центр поля зрения микроскопа при малом увеличении

13. По окончании работы с большим увеличением, установить малое увеличение, поднять объектив, снять с рабочего столика препарат, протереть чистой салфеткой все части микроскопа, накрыть его полиэтиленовым пакетом и поставить в шкаф.

7. Микроскопическое изучение микроорганизмов в световом, люминесцентном, темнополь-
ном, фазовоконтрастном и электронном микроскопах. Простые и сложные (по Граму,
Циль-Нильсену, Романовскому-Гимза) методы окраски микробов.

Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.), электронные для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий.

 «сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90—100 х.

Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива. В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии — кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива.

Правила работы с иммерсионной системой:

1. установить микроскоп на малое увеличение;

2. навести максимальную освещенность (зеркало, конденсор, диафрагма);

3. установить препарат на столик;

4. нанести каплю масла на препарат;

5. установить иммерсионный объектив;

6. опустить объектив в каплю масла при помощи макровинта;

7. наблюдая в окуляр вращать макровинт до появления изображения;

8. микровинтом установить более четкое изображение;

9. провести микроскопию мазка с описанием морфологических свойств;

10. поднять тубус вверх, снять препарат и очистить объектив от масла;

11. установить микроскоп в нейтральное положение (малое увеличение, тубус вниз).

Существует несколько модификаций светового микроскопа, а, следовательно, и несколько видов световой микроскопии. Большинство бактериальных объектов прозрачны в видимом свете. Окрашенные препараты не позволяют определить некоторые морфологические свойства таких объектов. Для исследования живых нефиксированных и неокрашенных объектов применяют устройства:

Фазово-контрастное устройство обеспечивает четкое изображение объектов. В основе метода лежит изменение фазы световых лучей при прохождении их через прозрачные объекты. Человеческий глаз выявляет только различия в длине (цвет) и амплитуде (интенсивность) световой волны, но не позволяет выявить различия в фазе. С помощью устройства различия в фазе превращаются в изменение амплитуды. Устройство представляет собой прозрачный диск, на поверхности которого напылено кольцо из металла (фазовое кольцо), расположенный в задней плоскости объектива; и кольцевую диафрагму (светонепроницаемая пластина с прозрачным кольцевидным участком), помещенная под конденсором.

Темнопольный конденсор отличается от обычного тем, что пропускает только косые краевые лучи источника света, которые ввиду сильного наклона не попадают в объектив, в результате поле зрения микроскопа остается темным. На объект попадают только боковые лучи, отраженные от внутренних зеркальных поверхностей конденсора. Эти лучи отражаются в линзу объектива и позволяют видеть светлое изображение на темном фоне. 

Методы окраски препаратов

По Граму

На мазок накладывают полоска фильтровальной бумаги и наливают на нее рабочий раствор генцианвиолета. Если есть готовые бумажки, пропитанные этой краской, то их кладут на мазки матовой стороной вверх и наливают несколько капель воды. Через две мин. Бумажки снимают, краску сливают (не промывают), а на препарат наносят раствор Люголя на 1 мин. (до почернения мазка), после чего раствор сливают, а мазок обесцвечивают этиловым спиртом до прекращения отхождения краски (около 30 сек.). Затем мазок промывают водой, и стряхнув воду, докрашивают мазок фуксином Пфейфера 30-60 сек. Или сафранином 2 мин.! Надо строго соблюдать определенные сроки препарата, особенно спиртом: при его передержке можно обесцветить грамположительные микробы

по Циль-Нильсену – окрашивание кислотоустойчивых микроорганизмов

(микобактерии ярко-красные, все прочие бактерии синие).

Мазок фиксируют над пламенем, накрывают полосой фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый фуксин Циля и нагревают с появлением паров 3-5 мин, периодически проводя стекло над пламенем, но не доводя до кипения; при этом надо доливать краску на мазок. Препарату дают остыть, удаляют бумажку, промывают водой; обесцвечивают 5 %-ным раствором серной

Окраивание капсул

2. Окраска по Романовскому-Гимзе

Фиксированный спиртом или жидкостью Никифорова препарат кладут мазком вниз в чашку Петри на подставки из спичечной или стеклянной соломки. Готовят рабочий раствор краски Романовского-Гимзы (15-20 капель на 10 мл. дистиллированной воды), перемешивают и подливают под препарат, следя за тем чтобы все мазки были полностью смочены краской. Через 15-20 мин. Препараты промывают водой и высушивают на воздухе. Под микроскопом тела бактерий темно-синие, капсулы розовые

3. Окраска по Ребигеру

Не фиксированные мазки окрашивают (и одновременно фиксируют) формалинизированным генцианвиолетом 15-20 сек., быстро промывают водой и подсушивают. Бактерии густо-фиолетовые, капсулы красновато-фиолетовые.

4. Окраска по Ольту

Для окрашивания готовят свежий 2 %-ный водный раствор сафранина. Краситель растворяют в горячей воде и фильтруют при подогревании. Мазки красят 1-3 мин., промывают и высушивают. Бациллы – коричневые, капсулы бледно-желтые.

5. Окраска по Михину

Дает хорошие результаты только при наличии старой синьки Леффлера, способной за счет образования азура давать разноцветное окрашивание тел и капсул микробов. Мазок красят синькой 3-5 мин., быстро споласкивают малым количеством воды и быстро подсушивают. Тела бактерий синие, капсулы розовые

Окрашивание бруцелл.

6. Окрашивание по Ольту

Мазок фиксируют над пламенем, окрашивают 2 %-ным свежеприготовленным водным раствором сафранина при подогревании 2 мин., промывают водой, докрашивают без подогрева 0,75-1 %-ным растворм малахитовой зелени в течении1 мин., промывают и высушивают. Бруцеллы из молодых культур красные, другие микроорганизмы зеленые. В более старых культурах бруцеллы красятся в оба цвета и промежуточно.

7. Окраска по Шуляку-Шину

 На фиксированный мазок наливают фуксин Циля в разведении 1:5, выдерживают 2 мин. Без подогревания и промывают водой; докрашивают 2 %-ным водным раствором метиленовой сини 5 мин. и промывают водой. Бруцеллы ярко-красные, остальные бактерии сине-голубые.